Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Deze video toont de inductie en de klinische scoren van een diermodel van multiple sclerose: chronisch-recidiverende experimentele auto-immune encephalomyelitis in DA ratten. De ziekte, veroorzaakt door het immuniseren van ratten met een emulsie met hele rat het ruggenmerg en de volledige Freund's adjuvans, presenteert klinische symptomen lijken op de menselijke ziekte.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multiple sclerose (MS) is een chronische ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die vaak bij jonge volwassenen. Het wordt gekenmerkt door demyelinisatie en gliale schrikken in gebieden verspreid in de hersenen en het ruggenmerg. Deze letsels veranderen zenuwgeleiding en induceren de invaliderende neurologische tekorten die variëren met de locatie van de gedemyeliniseerde plaques in het centraal zenuwstelsel (bijv. paraparese, verlamming, blindheid, incontinentie).

Experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE) is een model voor MS. EAE werd voor het eerst per ongeluk veroorzaakt bij mensen tijdens de vaccinatie tegen hondsdolheid, met behulp van virussen gekweekt op konijnen ruggenmerg. Resten van spinale geïnjecteerd met het geïnactiveerd virus veroorzaakte het CZS ziekte. Naar aanleiding van deze waarnemingen, was een eerste model van EAE beschreven in de niet-menselijke primaten geïmmuniseerd met een CNS homogenaat door rivieren en Schwenther in 1935. EAE is sindsdien gegenereerd in een variëteit van soorten en kunnen volgen verschillende cursussen afhankelijk van de soort / stam en immuniseren gebruikte antigeen. Bijvoorbeeld, immuniseren Lewis ratten met myeline basisch eiwit in emulsie met adjuvans induceert een acute model van EAE, terwijl dezelfde antigeen veroorzaakt een chronische ziekte bij cavia's.

De EAE-model hier beschreven wordt veroorzaakt door het immuniseren van DA ratten tegen DA rat het ruggenmerg in de emulsie in volledig Freund's adjuvans. Ratten ontwikkelen een oplopende slappe verlamming binnen 7-14 dagen na de immunisatie. Klinische symptomen volgen een relapsing-remitting koers over een aantal weken. Pathologie blijkt uit grote immuun infiltreert in het CZS en demyelinisatie plaques. Speciale overwegingen voor het nemen van de zorg voor dieren met EAE worden beschreven aan het eind van de video.

Protocol

Inductie en monitoring van chronische recidiverende EAE

De emulsie is een 1:1 mengsel van antigeen in waterige oplossing toegevoegd aan aangevuld met Freund's volledig adjuvans. Het is zeer belangrijk om het antigeen toe te voegen aan de hulpstof en niet andersom!

Er is een veel afval bij het maken van en het injecteren van een emulsie. Altijd bereiden 1,5 of 2 keer meer dan wat je nodig hebt.

Gebruik geautoclaveerd mortier, de stamper, glazen spuiten, en bruggen. Alle kunststoffen moet steriel zijn. Het preparaat kan worden gedaan op een regelmatige laboratoriumtafel.

1. Voorbereiding van de aangevuld met adjuvante

Weeg 30 mg van het Mycobacterium tuberculosis (Difco catalogus # 231141) en plaats deze in een vijzel. Maak in dunne poeder zonder op te hard om te voorkomen dat het breken van de bacteriën. Voeg 10 ml van de volledige Freund's adjuvans H37Ra (Difco catalogus # 231131) en meng. Dit aangevuld met adjuvans bevat nu 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transfer naar een buis.

2. Voorbereiding van het ruggenmerg homogenaat

Verzamel ruggenmerg van DA ratten (leeftijd / geslacht onverschillig) en op te slaan ingevroren bij -80 ° C. Weeg de bevroren ruggenmerg te hebben genoeg aan 1:1 (gewicht: volume) mengen met het aangevulde adjuvans. Hak het ruggenmerg zo fijn mogelijk met een scheermesje, over te dragen aan de mortel worden gebruikt in paragraaf 1, en maken een pasta met de stamper.

3. De voorbereiding van de emulsie

  1. Plaats aangevuld volledig Freund's adjuvans in een buis. Vortex op hoge snelheid. Voeg het ruggenmerg homogenaat druppelsgewijs, terwijl vortexen. Wanneer alle van het ruggenmerg homogenaat wordt toegevoegd, vortex nog 5 minuten. Het mengsel moet draaien licht roze.

  2. Doe de emulsie in een 5 ml glazen injectiespuit en een link naar een andere 5 ml glazen injectiespuit met behulp van een 18G brug (Fisher catalogus # 14 tot 825-17L). Stuur de emulsie uit een spuit naar de andere totdat het wordt moeilijk (5-10 min). Als er meer dan 5 ml van de emulsie wordt bereid, gebruik maken van verschillende 5 ml spuiten NIET groter spuiten gebruiken.

  3. De emulsie kan worden opgeslagen in de spuiten bij 4 ° C gedurende 3 weken. Ik raad te bereiden op ten minste 12 uur van tevoren om te controleren dat het niet breken. Het moet blijven dik en niet gescheiden in 2 fasen. De kleur zal 's nachts veranderen in een licht geel of beige.

4. Immunisatie van de ratten

  1. Meng de emulsie in de spuiten voor een paar minuten en transfer naar de spuit die voor de injectie. Subcutaan injecteren 200 ul aan de basis van de staart met behulp van 23G naalden en 3 ml Luer-Lock spuiten onder de kortlopende anesthesie.

  2. De ontvangers zijn 7-9 weken oude vrouwelijke DA ratten. We krijgen onze ratten van Harlan Sprague-Dawley.

  3. Ratten moeten tweemaal per dag worden geobserveerd en gewogen dagelijks. Klinische symptomen worden verwacht 7-15 dagen na de injectie van de emulsie.

Klinische scoren:

0: geen ziekte

0.5: distale slap tail

1: slap tail

2: milde paraparese, ataxie

3: matig paraparese, de ratten trips van tijd tot tijd

3.5: een achterste ledematen is verlamd, de andere zetten

4: complete achterste ledematen verlamming

5: complete achterste ledematen verlamming en incontinentie

6: stervende, ademhalingsproblemen, niet eten of drinken. Euthanaseren onmiddellijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn een paar belangrijke overwegingen voor dit protocol.

Genetica van DA ratten zullen enigszins verschillen afhankelijk van welke fokker ze zijn gekocht. Deze verschillen kunnen verhogen of verlagen van de gevoeligheid van ratten inductie EAE. Als je ratten zijn meer vatbaar voor EAE wil je de kracht van de immunisatie te verminderen door het gebruik van niet-aangevuld met volledig Freund's adjuvans of zelfs incompleet Freund's adjuvans. U kunt ook het verminderen van de hoeveelheid emulsie geïnjecteerd of verdunnen van het ruggenmerg homogenaat met een zoutoplossing overwegen voordat de voorbereiding van de emulsie. Als je ratten ontwikkelen geen klinische tekenen van EAE het gebruik van de full-sterkte immuniseren emulsie Controleer de reinheid van uw woning faciliteit. Ratten die besmet zijn met parasieten (zoals pinworm) zal zich niet ontwikkelen EAE. Kunt u overwegen uw woning dieren onder voorwaarden in schoner geautoclaveerd kooien met filter-tops, en hen aangezuurd water ad libitum (het protocol voor het bereiden van aangezuurd water is aangesloten).

De emulsie moet water-in-olie worden, zodat de olie in de adjuvante volledig vacht van het antigeen die u toevoegt druppel voor druppel. Een emulsie bereid andersom (olie-in-water) zal zo dik maar zal niet worden encefalitogene.

Ratten zijn vriendelijke dieren als ze gewend zijn aan hun baas, het is daarom een ​​goed idee om voorzichtig mee om te gaan op een dagelijkse basis voor de injectie van het encefalitogene emulsie. Dit vermindert stress en het risico van een beet.

Dieren met ernstige EAE (score van 3 of meer) hebben speciale zorg nodig. Ratten mogen nooit worden opgepikt door de staart, maar eerder door het lichaam. Dit is nog belangrijker voor het verminderen van stress bij zieke dieren. Het is zeer belangrijk ervoor te zorgen dat alle dieren de toegang tot voedsel en water hebben door er voedsel en gel packs in de bedden en het verstrekken van lange-sipper buizen op het water flessen. Ratten met EAE zullen blijven eten en drinken, als een dier te stoppen of het eten of drinken contact op met uw dierenarts of instituut laten inslapen van het dier. Zieke ratten moeten gescheiden worden van gezonde dieren te zorgen dat ze niet voortdurend vertrapt, maar alleen achter te laten omdat ze ratten zijn sociale dieren en moeten bedrijf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB en KGC zijn mede-oprichters en consultants voor Airmid Inc

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

21 Comments

  1. Dear Dr. Beeton,
    I watched your video with great interest.
    I am a researcher at the CEA, Orsay, France, and we are interested in inducing EAE in DA rats. I would kindly like to ask you a few questions in this regard:
    1. Should the meninges be removed prior to the freezing of the spinal cord, to avoid aggregates/ clumps in the emulsion?
    ². Is it possible to reduce the spinal cord into fine powder by using a mortar and pestle in liquid nitrogen rather than using a razor and cutting it over dry ice?
    3. Can the emulsion be prepared by using a polytron or some other homogenisation system rather than the glass syringes and the connecting bridges (we seem to have a problem to obtain some of these tools).
    4. Is it possible to use rats older than 7-9 weeks or dŒs susceptibility decrease with increasing age?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 5, 2008 - 11:20 AM
  2. We use whole spinal cords, without removing any parts.
    Since we published this video and following advice from Dr. Holmdahl (Lund, Sweden), we have started using fresh spinal cords from ~1² weeks old DA rats. The emulsions give more homogeneous diseases when working with a large group of animals (> 40 recipients). We have not tried using a mortar and pestle. I don't think it would work for fresh cords but might on frozen cords.
    I haven't tried any other methods for preparing the emulsion. As a graduate student in France I was able to buy glass syringes but we had to ask facilities to make metal bridges to connect the syringes by using two metal needles.
    Recipients should be young adults for best susceptibility to EAE. We have never tried using older DA rats but in other rat models of EAE (using Lewis rats) we have found that the older the recipients, the less susceptible to EAE they were. Note that not all DA rats are identical, there are small variations from vendor to vendor so you may want to try rats from several vendors in your area to find which are more susceptible to EAE.
    If you have any more questions you are welcome to contact me by email at beeton@bcm.edu.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    February 5, 2008 - 4:02 PM
  3. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. I would like to ask you , if you have any experience with the EAE induction in mice using this protocol. Thank You for the answer. Sincerely Jan Pazour

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 30, 2008 - 9:31 AM
  4. I have never used this protocol in mice. For mice I have only used the MOG 35-55 peptide to induce EAE [in C57BL/6 mice]. Using whole spinal cord should work in mice but the protocol would have to be adjusted. You would first have to ensure you are working with the right strain and then you would have to work out the doses and type of adjuvant. Most protocols in mice also call for an additional injection of pertussis toxin and very often mice need a booster injection to develop EAE. This can be a rather tricky protocol to adapt to mice. Sorry that I could not give you a more helpful answer.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    June 30, 2008 - 10:38 AM
  5. Dear all, could there be any difference in using M.butyricum instead of M. tuberculosis H37RA containing adjuvant in inducing EAE in wistar rats (mylein basic protein- MP bio-vendor). I plan to use the former.Please suggest.

    raghul
    toxicologist
    SGS -LSS india

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2008 - 1:24 PM
  6. Dear Raghul, I have no experience inducing EAE in Wistar rats so am unsure of the results. When inducing acute EAE in Lewis rats with MBP we used CFA made with M. butyricum and supplemented it with 3 mg/ml M. tuberculosis and this worked well with 100% EAE incidence and a homogeneous disease. Best wishes, Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    August 25, 2008 - 5:46 PM
  7. what is the concentration of the HCl for drink wather?

    Reply
    Posted by: Andres Q.
    September 15, 2009 - 2:40 PM
  8. To prepare acidified drinking water, fill a clean carboy with 10 liters of water. Add 5 ml of 1²N (concentrated) hydrochloric acid (HCl) to the water and stir. The pH of the solution should be in the range of ².4-3.0.
    For more safety, ensure that your stock of concentrated acid is not used for anything else but preparing acidified drinking water. This will reduce the risk of accidental contamination with toxic chemicals.
    Do not check the pH directly in your carboy but rather in a sample taken into a beaker.
    This acidified drinking water is not quite as acidic as common sodas many people drink every day. It will not damage the lining of the Œsophagus of the rats.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2009 - 3:03 PM
  9. Dear Dr Beeton,
    I found and watched with great interest you movie about induction and clinical
    scoring of chronic-relapsing EAE in rats and i would like to ask you if
    you have some hystological or/and MRI findings to prove that the major
    pathophisiologycal changes, induced by the immunization, occur in the brain
    and not in the spinal cord? How much this animal model mimics what is
    happening in human brain in MS? I am interested more by demyelination
    which i can observe using DT-MRI.

    Thank you in advance

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 8:32 AM
  10. We have not done any histology the brain of these animals as our focus was on the spinal cord.
    We used the brains to isolate mononuclear cells and found more with a CCR7- differentiated phenotype in EAE rats than controls. This suggest brain-infiltration and therefore a potential for demyelinating lesions, but I can't guaranty it.
    This model is definitely demyelinating in the spinal cord (see figure S6 in the online supplement of the paper Matheu, Beeton et al. Immunity ²008, ²9:60²).
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 1:54 PM
  11. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. Do you have the protocol to induce EAE in mice? Can you please provide injecting protocol for mice. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2010 - 1:24 PM
  12. The protocol will depend on the mouse strain you are interested in. Some strains are more susceptible to EAE than others. A good place to start is the following protocol: http://www.penningerlab.com/uploads/media/EAE_induction_01.pdf

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 30, 2011 - 11:34 PM
  13. Dear Dr Beeton
    Thanks for the vieo, it is very helpful. I have just one question regarding the part you use as "SPINAL CORD". Is it seperated from spinal column or you just use spinal colum containing spinal cord?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2011 - 5:01 AM
  14. You want to use the spinal cord itself, removed from the bone. It is pretty easy to collect since you don't need to keep it in a single piece (as you would for histology for example). You can simply scrape it out.
    Hope this helps!
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2011 - 4:36 PM
  15. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. Please let me know how to make acidified water and HOW LONG THE ANIMAL SHOUL DRINK SUCH A WATER BEFORE INDUCTION OF EAE?
    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 3:58 AM
  16. For preparation of the acidified water, please refer to my answer to a similar question from Andres Quintanar, posted 09/15/²009.
    We put our rats on acidified water as soon as we receive them, which is 4-7 days before we induce EAE.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 4:40 PM
  17. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. It is really helpful. Can we use Sprague-Dawley and Wistar Rats. Do we need in your model to use pertussis toxin.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2011 - 6:32 AM
  18. Hello Dear Christine Beeton
    Thanks for your useful video. I would be grateful if you response my question: In this video when you work with Mycobacterium tuberculosis H37RA for making it thin powder, you didn't wear mask, is it safe for you?

    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2012 - 5:34 AM
  19. Hello Dear Professor Beeton
    I have another question dear Dr Beeton: Should we perfuse the rat before spinal cord isolation (for EAE induction) or no the perfusion is just necessary when we want to isolate the cells from spinal cord or brain? I want to isolate the guina pig spinal cord for EAE induction and I don't know the perfusion is necessary or no.
    Best Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 10, 2012 - 7:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics