Name: Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Impara a utilizzare micropattern adesivi per normalizzare l'architettura cellulare e quantificare gli effetti dei farmaci con maggiore sensibilità. Questo metodo migliora la riproducibilità nello screening di farmaci e siRNA.

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1. Preparazione e Semina delle cellule su microdisegni <ol><li> Posto 2 CYTOOchips in 2 pozzi indipendente di una piastra ben 6 assicurando che si legge "CYTOO" nell'angolo in basso a destra della CYTOOchip. Microdisegni possono essere marcate con Cy3 o Cy5 coloranti. CYTOOChips utilizzati per questo esperimento sono Cy3 fluorescente microdisegni. ATTENZIONE: Conservare i chip al buio. </li><li> Raccogliere le cellule HeLa (confluenti ~ 80%) da tripsinizzazione. Controllare al microscopio che le cellule siano dispersi dal trattamento tripsina. Raccogliere e centrifugare le cellule a 300g per 4 minuti, poi delicatamente risospendere il pellet cellulare. Contare le celle e diluire ad una concentrazione di 15.000 cellule / ml in terreni di coltura DMEM/F12 completato. </li><li> Dispensare 4 ml (60.000 cellule) in ciascun pozzetto contenente un CYTOOchip. ATTENZIONE: La piastra deve essere spostato il meno possibile per evitare di indurre i movimenti di rotazione nel mezzo come questo tenderà a concentrare le cellule al centro. </li><li> Lasciate che il sedimento cellule per 10 minuti sotto il cofano per poi passare alla cella incubatrice. Dopo 10-20 minuti, le cellule iniziano a aderire al microdisegni. Dopo 10 minuti, controllare regolarmente sotto il microscopio. </li><li> Non appena le cellule hanno attaccato, cambiare il medium delle cellule e lavare delicatamente la superficie del vetrino con la seguente procedura: </li><li> Mantenere la piastra piatta, leggermente aspirare il terreno con una pipetta dal lato del bene. ATTENZIONE: Non lasciare che il chip di fuori asciutto, questo significa che non è mai aspirare fuori tutto il liquido lasciando sufficiente a coprire il CYTOOchip in ogni momento. </li><li> Aggiungere 4 ml di PBS e aspirare di nuovo primo avvio al centro del chip per poi passare al lato del bene. Aspirare al largo della PBS come descritto senza esporre il chip per aria. Ripetere 3-4 volte. </li><li> Controllare al microscopio per le cellule galleggianti: <ul><li> Se un gran numero di cellule galleggianti rimangono, ripetere la procedura di lavaggio. </li><li> Se vedete cellule molto pochi, aspirare una parte dei PBS e sostituirlo con 2 ml di mezzo fresco. Aspirare e aggiungere 4 ml di terreno fresco due volte. </li></ul></li><li> Porre la piastra in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per un minimo di tre ore per permettere alle cellule di raggiungere la piena diffusione. NOTA: L'utilizzo di questo metodo tra il 10-30% (2.000-6.500) microdisegni sarà occupata da un cellule singole o multiple. ATTENZIONE: Il tempo necessario per le cellule di aderire prima della fase di lavaggio e il tempo necessario per la piena diffusione delle celle microdisegni saranno specifici per ogni linea cellulare. </li></ol> 2. Blebbistatin Trattamento <ol><li> Sciogliere il blebbistatin in 100% DMSO per ottenere una soluzione stock di 17 mm. Diluire la soluzione stock ulteriormente a 5 mm con 100% di DMSO. Effettuare una diluizione finale nel terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 5 micron di blebbistatin 0,1% DMSO. </li><li> Per le condizioni di controllo, preparare 4 mL di mezzo contenente 0,1% di DMSO solo. </li><li> Aspirare il multimediale su cellule e sostituirlo con il mezzo preparato per 4 mL condizioni di trattamento e di controllo. </li><li> Cellule incubare per 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fissazione delle cellule e la colorazione di actina <ol><li> La preparazione della soluzione per il fissaggio delle cellule Vedere la sezione reagente per la preparazione del citoscheletro tampone (CB) e PFA 5%. CB è particolarmente indicato per l'etichettatura di fluorescenza di filamenti di actina e microtubuli. <ul><li> Preparare 1xCB-saccarosio: aggiungere 1 g di saccarosio a 2 ml di CB. L'inclusione di saccarosio aiuta a preservare le strutture cellulari interne. </li><li> Preparare 4% PFA-CB-saccarosio: Aggiungere 1 ml di 1xCB-saccarosio a 4 ml di caldo PFA 5%. ATTENZIONE: Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per pochi giorni soltanto. </li></ul></li><li> PFA fissazione <ul><li> Usare pinze per prendere il CYTOOchip sul logo CYTOO e metterla (senza lavatrice) in un pozzo di un 6-pozzetti contenenti 2 ml del 4% PFA-CB-soluzione di saccarosio </li><li> Incubare 10 min a RT </li><li> Rimuovere PFA-CB-saccarosio e lavare una volta con PBS </li><li> Fare un secondo lavaggio con 2 ml di 100 mM NH 4 Cl per 10 minuti al fine di soddisfare la residua attività di reticolazione PFA NOTA: diapositive PFA fisso possono essere memorizzati in PBS per diversi giorni a 4 ° C prima della colorazione organello per l'imaging a fluorescenza. </li></ul></li><li> Permeabilizzazione della membrana cellulare con Triton X-100 Permeabilizzazione delle cellule con detergente permette anticorpi o altre sonde per penetrare la membrana cellulare ed elimina alcuni della piscina citosolico di proteine ​​del citoscheletro che possono comunque ridurre il contrasto dei polimeri del citoscheletro che rende difficile analizzare la loro localizzazione. <ul><li> Rimuovere NH 4 Cl e aggiungere 2 mL / pozzetto del 0,1% Triton X-100-CB per 3 min a RT </li><li> Lavare due volte con 2 ml di PBS </li></ul></li><li> Actina colorazione Fluorescenti che falloidinah lega alla actina nativo viene utilizzato per colorare i filamenti di actina. <ul><li> Aggiungere 2 ml di coniugato FITC falloidina diluito 1:2000 in PBS con 1,5% di BSA </li><li> Incubare 1 ora a RT </li><li> Lavare una volta con 2 ml di PBS </li></ul></li><li> Nuclei colorazione <ul><li> Aggiungere 2 mL di Hoechst (macchia con 1μg / ml in PBS) </li><li> Incubare 3 minuti a RT </li><li> Lavare per 2 volte con 2 ml di PBS </li></ul></li><li> Montaggio di diapositive <ul><li> Raccogliete il CYTOOchips sul logo CYTOO e CYTOOchip montare su un vetrino da microscopio standard con 25-30 ml di Mowiol o qualsiasi altra soluzione di montaggio. </li></ul></li></ol> 4. Microscopio installazione e acquisizione automatica dell'immagine Numerosi pacchetti software di imaging che esiste il controllo del microscopio per una rapida acquisizione delle immagini e la visualizzazione automatica. Questo esempio utilizza Metamorph software di imaging e di acquisizioni automatiche vengono eseguite su un microscopio Nikon Eclipse Ti dotato di una fotocamera CCD Hamamatsu e mercurio in fibra Intensilight illuminatore. Le immagini sono acquisite a 20x in tre lunghezze d'onda corrispondenti al DAPI (nuclei), Cy-3 (microdisegni) e FITC-falloidina (actina). Il numero di microdisegni visualizzati per ogni campo varia a seconda della fotocamera e le impostazioni obiettivo. Microdisegni CYTOO sono posizionati a intervalli definiti l'uno dall'altro (100 o 130 micron) attraverso il chip facilitando l'acquisizione. <ol><li> Seleziona 20x </li><li> Acquisizione aperto (Multidimensional nella barra dei menu: Applicazioni / multidimensionali Acquisizione) e impostare i vari parametri della sperimentazione: <ul><li> Numero di lunghezze d'onda: 3 </li><li> Tipi di lunghezza d'onda: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Impostare il tempo di esposizione per ogni lunghezza d'onda per prima concentrandosi su un campo di cellule </li><li> Messa a fuoco automatica può essere eseguita su ogni lunghezza d'onda </li><li> Scegliere dove salvare i dati </li></ul></li><li> Seleziona Cy3 lunghezza d'onda e posizionare la fotocamera in modo che 12 microdisegni vengono visualizzati e centrato nel campo della fotocamera (4 colonne e 3 righe di modelli). </li><li> Creare un giornale in esecuzione di acquisizione multidimensionale. La procedura per la creazione di una rivista è descritto nella Figura 1. </li><li> Aprire la funzione di scansione stadio (nella barra dei menu: Dispositivi / Stage / Stage Scan). Per acquisire 24 immagini ciascuno contenente 12 microdisegni a ingrandimento 20x, immettere 6 colonne e 4 righe con -400 micron passo X dimensioni e 300 Y dimensioni micron passo. In Gazzetta SET per eseguire, caricare la MDA.JNL rivista. Poi premere Scansione per avviare l'acquisizione automatica del blocco tutto nelle tre lunghezze d'onda. NOTA: Le dimensioni X e Y passo qui indicati possono variare in base al numero di microdisegni presenti in un campo di macchina fotografica. A seconda del palco allestito, in direzione X e / o Y può richiedere valori negativi per il movimento nella direzione corretta. </li></ol> 5. Image Processing ed analisi automatizzata Molti pacchetti software di elaborazione delle immagini e analisi di esistere. Le procedure descritte di seguito l'elaborazione delle immagini schema e fasi di analisi eseguite da 2 misura macro scritte per il programma ImageJ open source. Il CellRef prima macro crea una cella di riferimento, la seconda Ipotenusa rigidità misure / collasso della membrana cellulare. Entrambi sono disponibili su richiesta presso <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Creare stack di immagine per tutti e tre i canali centrata su microdisegni (macro CellRef). L'uso di cellule microdisegni evita di clustering e di aggregazione, semplificando notevolmente il primo passo per l'elaborazione delle immagini è automatico che la localizzazione e la segmentazione delle singole cellule. Le immagini marcate micropattern sono usati per definire e delimitare le regioni centrata sul microdisegni. Queste regioni sono poi trasposti sul immagini acquisite in altri canali e tagliate. Corrispondenti immagini ritagliate vengono poi assemblati in pile per ogni lunghezza d'onda. Un RGB-pila è anche creato dalla fusione dei tre canali (Figura 2). </li><li> Applicare singola cella di selezione del filtro (macro CellRef) Come indicato sopra, il 10-30% (2.000-6.500) del microdisegni sono occupati da una singola cellula o più celle, mentre le rimanenti microdisegni sono vuote. Per selezionare le immagini che mostrano microdisegni occupato da solo una singola cella, la macro rileva il numero di nuclei per immagine ed elimina da tutti (RGB e lunghezze d'onda diverse) stack quelli contenenti più di un nucleo o senza nuclei (Figura 3). </li><li> Eliminare non normalizzati e le cellule che non sono pienamente teso la micropattern utilizzando zona di cut-off cella filtrante (macro CellRef) Per rimuovere divisione delle cellule che sono sfuggite al filtro nuclei, un altro filtro utilizzando il canale FITC per actina viene applicata. Area di cella viene calcolato e quelli di sotto di un certo cut off (aree di cellule circa 2 volte meno di area di cella interfase) vengono rimossi da tutti gli stack. L'area busta cella è determinata dalle dimensioni del pattern. </li><li allineare le immagini delle cellule cellref> Dai passaggi precedenti, le immagini contenenti singole cellule micropatterned sono stati selezionati. Anche se queste immagini sono centrati su microdisegni, non sono mai tutti perfettamente allineati gli uni agli altri. Per concludere l'elaborazione delle immagini, un plugin ImageJ (MultiStackReg) viene applicata a riallineare tutte le immagini raccolte e tutti i canali in base alla posizione micropattern. Questa operazione genera pile allineate su singole immagini, che possono ora essere utilizzati per l'analisi singola cella o la creazione di una cella di riferimento (Figura 4) <li> Costruire una cella di riferimento (macro CellRef) Cellule in crescita su microdisegni significa che tutte le cellule hanno forme simili. Questa normalizzazione permette un preciso allineamento e sovrapposizione delle immagini delle cellule molti. Riassumendo il segnale in ogni immagine sopra l'intero stack permette di visualizzare e misurare un "effetto media della droga". L'immagine finale complessivo o cella di riferimento è uno strumento unico e utile per la rappresentazione e analisi di immagine e può essere ottenuto solo con le cellule micropatterned (Figura 4). In ImageJ, la cella di riferimento è costruito facendo una proiezione delle immagini filtrate e allineate da una pila (Immagine&gt; Pile&gt; Z-progetto). Diversi metodi di proiezione può essere applicato come l'intensità media o massima, ma di solito una proiezione mediana viene scelta che elimina outlier principale della serie di immagini. Per facilitare l'esame dei risultati, una LUT (Look Up Tables) convertire l'immagine in un monocolore Mappa del frequenza viene applicata. </li><li> Misurazione e quantificazione dei parametri di interesse (Ipotenusa macro) In questo articolo video, L-microdisegni vengono utilizzati perché la forma organizza il citoscheletro di actina in una singola fibra di stress maggiori. Evidenziando actina in questo modo, l'impatto blebbistatin sul citoscheletro può essere determinato in molti modi: misurando i cambiamenti nella curvatura della fibra di stress l'actina, colorazione di intensità, lunghezza o spessore delle fibre di stress, cambiamenti nelle caratteristiche morfometriche dei filamenti di actina o forma ecc cellula Questi parametri possono essere misurati sia su immagini singola cella o nella cella di riferimento finale stesso. Qui, l'impatto su 5 blebbistatin mM è stata caratterizzata da contando il numero di cellule crollato con un secondo ImageJ macro chiamata Ipotenusa (Figura 7). In breve, le immagini thresholded della L-micropattern sono usati per definire un ipotenusa teorico della forma triangolare cellulare. Successivamente, soglia di immagini colorate della actina viene effettuata allo scopo di approssimare la forma delle cellule reale. L'area compresa tra l'ipotenusa teorico del triangolo cellulare e la membrana cellulare reale concava viene misurata. Quando la cellula è crollato, una zona sotto l'ipotenusa teorico appare. La percentuale di cellule crollato viene utilizzato per confrontare le condizioni di controllo e trattati. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Esempi di ciò che le cellule dovrebbe essere simile a microdisegni immediatamente e diverse ore dopo le fasi di lavaggio critici descritti in 1,6-1,8, sono mostrati in figura 5. Dopo 15 minuti a CYTOOchips, rotondo cellule HeLa sono osservati a distanze uguali indica che hanno aderito al microdisegni fibronectina (figura 5a). L'adesione è completa quando le cellule rimangono immobilizzati nonostante agitando delicatamente il recipiente di coltura. Per ridurre al minimo il numero di microdisegni occupati da più celle, i chip vengono poi lavati con PBS per rimuovere le cellule galleggianti sulle aree cytophobic. Dopo diverse ore, le cellule che sono completamente stirato sul microdisegni sarà simile a quelli mostrati nella figura 5b. Tipico immagini singola cella ottenute dopo incubazione di cellule con blebbistatin, fissazione e colorazione di actina e dei nuclei sono presentati nella Figura 6. Dopo l'acquisizione automatica di immagini multiple ed elaborazione delle immagini utilizzando il ImageJ CellRef macro, una mappa a colori frequenza è generata che ritrae l'intensità di actina in media su tutte le immagini delle cellule (Figura 6c e 6f). Il confronto tra la cella di riferimento per le condizioni non trattati e trattati mostra il potenziale di questo approccio per l'osservazione facile del fenotipo in fase di studio ed è particolarmente utile per esplorare gli effetti della droga cellulare. Un esempio di analisi dei possibili effetti di blebbistatin sulle cellule è presentato in figura 7. Il numero delle cellule è crollato (es. celle con un'area vuota esistente sotto l'ipotenusa teorico) rilevati in 50 cellule di controllo e 50 cellule trattate con 5 mM blebbistatin come rilevato dalla macro Ipotenusa ImageJ è mostrato. L'aumento del numero delle cellule è crollato nella popolazione trattata blebbistatin riflette il rilassamento delle fibre di stress e quindi la tensione a livello della membrana a causa dell'inibizione blebbistatin delle forze actinomyosin contrattili all'interno della cellula. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Procedura per creare una nuova rivista con Metamorph. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagramma di flusso della procedura automatica di elaborazione delle immagini. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Filtrare di singole cellule. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Costruire una cella di riferimento. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Semina cellulare. A) le cellule Hela aderito a microdisegni dopo la fase di lavaggio (ingrandimento 4x) B) le cellule HeLa dopo la piena diffusione sul microdisegni L (ingrandimento 10x). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Confronto delle cellule nonpatterned micropatterned e nel controllo della droga e le condizioni di trattamento. Cellule HeLa sono state seminate per 3 ore e trattati con 5 blebbistatin mM per 1 ora (pannello inferiore) oa sinistra non trattati (pannello superiore). Nel controllo delle cellule nonpatterned (a), actina assembla in fibre multiple che smontare impercettibilmente in seguito al trattamento con 5 blebbistatin mM (d). Su L-microdisegni, le cellule di controllo di adottare una forma triangolare (b) e sviluppare una fibra importante actina (fibra di stress) tra i 2 apici della L. Rispetto alle cellule nonpatterned (d), blebbistatin induce un importante cambiamento fenotipico su L-micropatterned cellule (e). Visualizzazione diretta degli effetti del farmaco e il confronto di controllo e alle condizioni trattate possono essere visualizzati rapidamente con la presentazione cella di riferimento costruito a partire da 20 celle. Simile a singole celle, una fibra di stress chiara e intensa è presente la cella di riferimento di controllo (c), mentre blebbistatin trattati collasso delle cellule e le fibre di stress principali scompare (f). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Esempio di un'analisi degli effetti della blebbistatin sulle cellule utilizzando l'ipotenusa macro. Mentre il 25% delle cellule di controllo erano crollati, questa aumentata di 3 volte al 75% nelle cellule mM 5 blebbistatin trattati che riflette la debole actinomyosin contrattile rete (n = 50 cellule).

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Tutti gli autori ad eccezione di Anne Béghin sono dipendenti di CYTOO SA, che produce reagenti e strumentazioni presenti in questo articolo.

Scelta del micropattern Mentre gli effetti su 5 blebbistatin mM sono appena rilevabili su supporti cultura standard, la quantificazione efficiente disponibile in microdisegni che concentrano la actina in una singola fibra di stress maggiori. Questo migliora la visualizzazione del citoscheletro di actina aiutare quantificazione precisa degli effetti blebbistatin sulla cellula. La scelta della forma micropattern è fondamentale nella progettazione del test ed è progettato in base alla variazione fenotipica da evidenziare in questo studio. Conclusioni Microdisegni facilitare la visualizzazione e la quantificazione degli effetti del farmaco, soprattutto a basse concentrazioni. La sostituzione del omogenea substrati planari con microdisegni adesivo per saggi cellulari migliora la precisione, la sensibilità e la qualità dei dati prodotti. Di conseguenza, un minor numero di celle sono necessari per l&#39;analisi al fine di ottenere robusti risultati statistici 3. Microdisegni adesivo offrire una reale opportunità per migliorare gli studi funzionali e ad esplorare i cambiamenti fenotipici a concentrazioni di farmaco inferiori in modo da evitare indurre effetti dei farmaci tossici o indiretta. Se le piattaforme di screening adeguati vengono utilizzati, microdisegni in grado di soddisfare le esigenze delle aziende farmaceutiche per il miglioramento genetico / farmaco applicazioni di screening. Alcuni esempi di pubblicazioni recenti che hanno sfruttato microdisegni per l&#39;analisi e la quantificazione fenomeno cellulari sono citati sotto 3-13.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Coltura cellulare </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips sono disponibili per l&#39;adsorbimento della proteina di vostra scelta </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Camera di conteggio (scivolo Kova) </td><td> Prolabo </td><td> 71.287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal siero bovino) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicillina e Streptomicina </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 pozzi-plate </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> centrifuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Droga, fissaggio e immunostaining </td></tr><tr><td colspan="2" > Citoscheletro Buffer 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > MES 10 mM pH 6.1, KCl 138mm, MgCl 3mm, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Saccarosio </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Miscelare 10 mL di PFA 32% con 54 ml di CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS compresse </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin albumina sierica (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Image Acquisition </td></tr><tr><td colspan="2"> Microscopio epifluorescente </td><td> Nikon</td><td> Ti Eclipse </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule micropatterned

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Fino ad oggi, la maggior parte HCA (Content Analysis Alta) studi sono effettuati con linee cellulari aderenti coltivate su un substrato omogeneo nel tessuto-coltura trattata micro-piatti. In queste condizioni, le cellule diffuse e dividere in tutte le direzioni con conseguente variabilità nella forma delle cellule, la morfologia e il comportamento. L&#39;alta cellula-cellula varianza della popolazione complessiva impedisce il successo di HCA, soprattutto per lo sviluppo di farmaci. La capacità di microdisegni di normalizzare la forma e la polarità interno di ogni singola cella fornisce una straordinaria opportunità per la soluzione di questo collo di bottiglia critico 1-2. Per facilitare l&#39;accesso e l&#39;utilizzo della tecnologia micropatterning, CYTOO ha sviluppato una gamma di pronto all&#39;uso microdisegni, disponibili in formati coprioggetto e pozzetti. In questo articolo video, forniamo protocolli dettagliati di tutte le procedure da semina cella microdisegni CYTOOchip, trattamento farmacologico, la fissazione e la colorazione di acquisizione automatica, elaborazione delle immagini automatizzata e l&#39;analisi dei dati finali. Con questo esempio, illustrare come microdisegni può facilitare saggi cellulari. Alterazioni del citoscheletro delle cellule sono difficili da quantificare in cellule in coltura su substrati omogenei, ma le cellule in coltura risultati microdisegni a un&#39;organizzazione riproducibile del reticolo di actina grazie al posizionamento sistematico di contatti adesione della cellula in ogni cellula. Tale normalizzazione dell&#39;architettura intracellulare consente la quantificazione di anche piccoli effetti sul citoscheletro di actina come dimostrato in questi set di protocolli con blebbistatin, un inibitore della actina-miosina interazione.

Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l&#39;acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

Ad oggi, la maggior parte degli studi di HCA (High Content Analysis) viene condotta utilizzando linee cellulari aderenti cresciute su un substrato omogeneo in... trattato per la coltura tissutale...

L'obiettivo generale della seguente procedura è mostrare come la normalizzazione dell'architettura cellulare e della posizione, ottenuta su specifici microdisegni adesivi, permetta una facile automazione dell'acquisizione delle immagini e un'elaborazione semplice delle immagini con una quantificazione sensibile e robusta degli effetti dei farmaci, cosa irraggiungibile sui tradizionali supporti in vetro. Questo risultato si ottiene seminando cellule heli su chip SI due che presentano microdisegni a forma di L etichettati SI tre. Le cellule assumono una forma triangolare formando un fascio di stress principale che si estende tra le due estremità della L. Le cellule sui disegni vengono quindi incubate con lebos statin o lasciate non trattate, poi fissate e colorate per visualizzare il citoscheletro di actina e i nuclei.Le immagini delle cellule micropattern sono quindi acquisite ed elaborate utilizzando la macro cell ref per generare uno stack di immagini da analizzare e la macro hypotenuse per quantificare i fenotipi. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano un effetto significativo di basse dosi di BLEs statina sulle cellule micropattern HELOC, effetto non rilevabile nelle condizioni standard di coltura cellulare. Ciao, benvenuto.Siamo qui oggi per accompagnarvi attraverso il nostro protocollo sperimentale che spiega come utilizzare microdisegni adesivi per l'analisi cellulare, nonché per mostrarvi dati sperimentali che illustrano la semplice quantificazione di dosi molto basse di farmaci su questi microdisegni adesivi. Osservando per la prima volta questi microdisegni, comprenderete immediatamente come possano risolvere i problemi di variabilità nella cattura delle immagini durante l'analisi cellulare. Infatti, disponendo di un vero e proprio array di cellule, simile a un microarray, è possibile spostare facilmente lo stadio del microscopio da una cellula all'altra per acquisire immagini in modo progressivo.Ma questo naturalmente non è l'unico vantaggio offerto dai microdisegni. Offre molti ulteriori miglioramenti perché, in effetti, su determinati microdisegni tipici come il crossbo o la Y, stiamo normalizzando l'architettura cellulare interna, il che significa che gli organelli, il fuso mitotico, il citoscheletro e le diverse reti proteiche si trovano tutti nella stessa posizione da cellula a cellula o nella stessa orientazione da cellula a cellula, rendendo così molto più semplice prevedere e quantificare gli effetti dei farmaci su questi particolari disegni. Ora questo può sembrare piuttosto controintuitivo rispetto a quanto normalmente si fa nella classica piastra di Petri o nella micropiastra.Beh, perché si osserva spesso, ovviamente, che le cellule si muovono e assumono diverse morfologie. Mentre sui micropattern adesivi, tutte le cellule inizieranno ad apparire simili perché rispondono a questo micropattern adesivo e organizzano la loro architettura nello stesso modo. Questo potrebbe sembrare effettivamente un po' artificiale, ma osservando da vicino, non è forse ancora più artificiale la piastra di Petri?Nei tessuti, le cellule sono vincolate dalle cellule adiacenti e dalla matrice extracellulare, pertanto ricevono molte informazioni spaziali che orientano l'architettura cellulare. Questa è la base all'uso di micropatterns, che è ciò che stiamo facendo.Stiamo ripristinando queste informazioni spaziali alle cellule e tutte le cellule rispondono a questo stimolo organizzandosi nello stesso modo. Ora, poiché tutte le cellule sono simili tra loro, possiamo introdurre il concetto di cellula di riferimento, ovvero possiamo mediare tutte le immagini ottenendo un'immagine singola, che rappresenta fedelmente l'aspetto della cellula in una determinata condizione. Successivamente, è possibile aggiungere un farmaco e osservare nuovamente la cellula di riferimento per valutare come il farmaco abbia modificato la morfologia o l'organizzazione cellulare.Posizionare due chip situ two singolarmente in due pozzetti indipendenti di una piastra a sei pozzetti, assicurandosi che il logo situ two sia leggibile. I chip situ two utilizzati per questo esperimento presentano microstrutture colorate con FibroGen SI three e devono essere conservati al buio prima dell'uso. Raccogliere le cellule hela che sono circa all'80% confluenti mediante tripsina e verificare che siano adeguatamente individualizzate al microscopio; centrifugare a 300 ×g per quattro minuti e risospendere delicatamente le cellule. Contare e diluire le cellule fino a una concentrazione di 15.000 cellule per millilitro.Nel mezzo di coltura D-M-E-M-F 12 incompleto, distribuire 60.000 cellule per pozzetto. La piastra dovrebbe essere spostata il meno possibile per evitare di introdurre movimenti rotatori nel mezzo, che tenderebbero a concentrare le cellule al centro. Lasciare sedimentare le cellule per 10 minuti sotto la cappa, quindi trasferirle nell'incubatrice per cellule.Dopo 10-20 minuti nell'incubatore cellulare, le cellule inizieranno ad aderire dopo 10 minuti; controllare regolarmente al microscopio quando le cellule si sono attaccate. Cambiare il mezzo cellulare ed eliminare l'eccesso di cellule ripetendo la seguente procedura quattro volte. Mantenendo la piastra in piano, aspirare delicatamente il mezzo dal lato del pozzetto.Attenzione a mantenere un quantitativo sufficiente di mezzo per evitare che il chip si secchi. Aggiungere quattro millilitri di PBS ed aspirare a partire dal centro del chip. Successivamente, spostarsi ai lati del pozzetto per aspirare la maggior parte del PBS come in precedenza, quindi controllare al microscopio la presenza di cellule in sospensione.Se rimane una grande quantità di cellule in sospensione, ripetere la procedura di lavaggio. Se sono presenti molto poche cellule, aspirare parte del PBS e sostituirlo con due millilitri di mezzo fresco, quindi aspirare nuovamente e aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco per due volte. Incubare le cellule per tre ore in un incubatore cellulare per consentire alle cellule di aderire completamente.Utilizzando questo metodo, dal 10 al 30% dei microdisegni sarà occupato da una singola cellula, mentre altri disegni saranno o vuoti o occupati da più cellule. Per trattare le cellule con BLEs statina, diluire la soluzione madre del farmaco 17 millimolare a una concentrazione finale di cinque micromolari con 0,1% di DMSO in quattro millilitri di mezzo. Per il controllo, preparare il mezzo con solo 0,1% di DMSO, aspirare il mezzo cellulare e sostituirlo rapidamente con le soluzioni di BLEs statina o con quelle di controllo per evitare che il chip si secchi.Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius. Durante questa incubazione, preparare il buffer del citoscheletro. Aggiungere un grammo di saccarosio a due millilitri di cb.Questo aiuta a preservare le strutture cellulari interne. Mescolare un millilitro di saccarosio in CB con quattro millilitri di PFA al 5%. Aggiungere due millilitri di PFA nella soluzione di saccarosio in CB.In due pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti. Per fissare le cellule, utilizzare pinze per prelevare il chip CY2 e posizionarlo nella piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di PFA in soluzione di saccarosio CB. Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere il PFA e lavare le cellule una volta con PBS, quindi lavare le cellule con due millilitri di cloruro di ammonio 100 millimolare per 10 minuti.Per bloccare l'attività residua di cross-linking del PFA, permeabilizzare le cellule aggiungendo due millilitri di PBS contenente 0,1% Triton X-100 per tre minuti, lavare due volte con PBS, quindi colorare i filamenti di actina con due millilitri di farina coniugata con ZI in un rapporto di 1 a 2000 in PBS con 1,5% di BSA, incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule una volta con due millilitri di PBS. Poi, mantenere i nuclei.Aggiungere due millilitri di un milligrammo per millilitro di hawked in PBS e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte con due millilitri di PBS. Montare i due chip laterali su un vetrino standard utilizzando da 25 a 30 microlitri di soluzioni di montaggio come al.Per acquisire immagini in tre lunghezze d'onda, utilizziamo il software di imaging Metamorph e un microscopio NIK icon eclipse T, dotato di una fotocamera CCD Hema Matsu e di un illuminatore a fibra di mercurio Intens Lite. Selezionare innanzitutto un'ingrandimento di 20x.Successivamente nella barra del menu, aprire l'acquisizione multidimensionale per impostare i diversi parametri dell'esperimento. Indicare innanzitutto dove salvare i dati.Impostare il numero di lunghezze d'onda a tre, selezionare le tre lunghezze d'onda SI e posizionare il vetrino coprioggetto in modo che 12 micro pattern siano centrati nel campo visivo della telecamera. Il numero di micro pattern visualizzati per campo varierà a seconda delle configurazioni della telecamera e dell'obiettivo. Impostare il tempo di esposizione per ciascuna lunghezza d'onda e la messa a fuoco automatica.Per PS tre, creare un journal per l'acquisizione multi-dimensionale e salvarlo come MDA jnl. Aprire la funzione di scansione della piastra per acquisire 24 immagini, ciascuna contenente 12 micro-pattern. Inserire sei colonne e quattro righe con dimensione del passo x pari a meno 400 micron e dimensione del passo y pari a 300 micron nell'insieme di journal da eseguire, caricare il journal MDA jnl e premere scan per avviare l'acquisizione automatizzata delle 24 immagini nelle tre lunghezze d'onda.In questo video, i micro pattern di forma L vengono utilizzati per indurre la formazione di una singola fibra principale di actina da stress che sostiene la parte della cellula non aderente e semplifica la visualizzazione e la misurazione dell'impatto delle statine sulle cellule, rispetto alle cellule aderenti su fibronectina semplice. Per l'elaborazione e l'analisi automatizzata delle immagini, illustriamo due macro personalizzate scritte per il programma open source ImageJ: a partire da uno stack di immagini grezze, la prima macro estrae le singole cellule e crea una cellula di riferimento. La seconda macro misura il collasso della membrana cellulare.Il primo passaggio consiste nella segmentazione delle singole cellule a partire da immagini grezze. Le immagini del micro pattern marcate con fluorescenza vengono utilizzate per delimitare le regioni centrate sui micro pattern, che vengono ritagliate nelle immagini per ogni lunghezza d'onda e quindi riassemblate in stack separati per ogni lunghezza d'onda. Per selezionare i micro pattern contenenti una singola cellula, il macro rileva il numero di nuclei per immagine ed elimina, in tutti gli stack, quelle immagini che contengono più di un nucleo o nessun nucleo.Infine, il plugin ImageJ multi-stack reg viene utilizzato per riallineare tutte le immagini raccolte e tutti i canali in base alla posizione del micromotivo. Questo passaggio genera pile di immagini individuali che possono ora essere utilizzate per l'analisi di singole cellule o per creare una cellula di riferimento. In ImageJ, la cellula di riferimento viene costruita creando una proiezione delle immagini filtrate e allineate provenienti da una pila.Possono essere applicati diversi metodi di proiezione, ma di solito si sceglie una proiezione mediana per eliminare i valori anomali dello stack di immagini. La cellula di riferimento è uno strumento unico e utile per la rappresentazione e l'analisi delle immagini, ottenibile soltanto con cellule su micropattern. Per facilitarne l'esame, viene applicata una tabella di consultazione (LUT) per convertire l'immagine monocromatica in una mappa di frequenza codificata.Per caratterizzare l'effetto dello statina sui BLE, la rigidità e il collasso della cellula sono stati analizzati utilizzando una seconda macro di ImageJ. In breve, le immagini soglia del micro-modello L vengono utilizzate per definire un'ipotenusa teorica della forma triangolare della cellula. Successivamente, viene eseguita la sogliatura delle immagini di marcatura dell'actina per definire la forma della cellula.La differenza di area tra l'ipotenusa teorica e la membrana cellulare concava effettiva viene quindi misurata: le cellule che presentano un'area al di sotto dell'ipotenusa teorica sono considerate collassate. L'impatto dello statina BLEs a cinque micromolar è stato caratterizzato confrontando il numero di cellule collassate in condizioni trattate e di controllo. Sono mostrate immagini tipiche di cellule micropatternate di L trattate con lo statina BLEs o lasciate non trattate; le cellule sono state fissate e colorate sui micropattern.L'actina e i nuclei sono mostrati rispettivamente in rosso, verde e blu. Si noti l'impatto dello statino BLEs sulla forma cellulare rispetto alle condizioni di controllo. Qui sono mostrate cellule rappresentative dopo incubazione con lo statino BLEs o con i controlli su fibronectina pura.Le cellule sono state fissate e colorate; l'actina e i nuclei sono rispettivamente in verde e in blu. Si noti la somiglianza tra le condizioni trattate e quelle di controllo. Sono mostrate immagini tipiche di cellule di riferimento ottenute da cellule trattate con statine BLE o lasciate non trattate.Si noti il potenziale di questo approccio per l'osservazione semplice del fenotipo in studio. Di seguito è riportato un esempio di analisi degli effetti dello statina BLEs sulle cellule mediante l'uso del macro ipotenusa. Mentre il 25% delle cellule di controllo era collassato, questa percentuale triplicava fino al 75% nelle cellule trattate con lo statina BLEs a cinque micromolar, indicando un'indebolimento della rete contrattile dell'actinina.Dopo aver visto questo, ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come le microstrutture adesive risolvano diverse criticità nell'analisi ad alto contenuto. In primo luogo, l'uso di microstrutture adesive ha reso molto più semplice l'acquisizione, l'elaborazione e l'analisi delle immagini. In secondo luogo, le microstrutture permettono di rilevare effetti estremamente sottili dei farmaci a dosi molto basse, poiché si riduce la variabilità tra cellula e cellula normalizzandone la morfologia e il comportamento.E infine, rispetto alle migliaia di cellule che di solito sono necessarie per ottenere un buon risultato nell'analisi cellulare, sono necessarie solo poche decine di cellule per ottenere un risultato robusto e significativo utilizzando la nostra cellula di riferimento.

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