Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi introducerar en hel-fäste immunohistokemi och laserskanning konfokalmikroskopi med flera märkning för att analysera invecklade vaskulära nätverk bildas i möss embryonala lem hud.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo. J. Vis. Exp. (51), e2620, doi:10.3791/2620 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hela montering immunhistokemiska analyser för att avbilda hela kärlsystemet är avgörande för att förstå de cellulära mekanismer förgrening morfogenes. Vi har utvecklat extremiteten modell huden kärlsystemet att studera vaskulär utveckling där en befintlig primitiva kapillär plexus ombildas till ett hierarkiskt förgrenad vaskulär nätverk. Hela montering konfokalmikroskopi med flera märkning möjliggör robusta avbildning av intakta blodkärl samt deras cellulära komponenter inklusive endotelceller, pericyter och smidig muskelceller, med specifika fluorescerande markörer. Framsteg inom denna delgrund huden kärlsystemet modell med genetiska studier har ökat förståelsen molekylära mekanismer av vaskulära utveckling och mönster. Extremiteten huden kärlsystemet modell har använts för att studera hur perifera nerver ger en rumslig mall för differentiering och mönstring av artärer. Denna video artikeln beskrivs en enkel och robust protokoll för att färga intakta blodkärl med vaskulär specifika antikroppar och fluorescerande sekundära antikroppar, som är tillämplig för vaskulariserad embryonala organ där vi kan följa processen av vaskulära utveckling.

Protocol

1. Samla Mus Embryonala Limb Skin (E13.5 ~ E17.5)

  1. Euthanize ansluten honor av godkända proceduren. Enligt vår godkända djur protokollet, honorna euthanized av CO 2 exponering och sedan säkerställs av halsdislokation. Lägg djuret när det absorberande pappersduk och blöt den ordentligt i 70% EtOH / H 2 O från en sprutflaska.
  2. Dissekera livmodern intakt och placera den i en 100 x 15 mm petriskål med iskall Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) att tvätta bort blod.
  3. Separera och dissekera embryot. Ta bort den mycket tunna amnion från embryot.
  4. (Tillval) dissekera en enda embryo i en 35 x 10 mm petriskål om varje embryo behöver genotypas. Dissekerade svans överförs till ett 0,2 ml PCR-rör för genotypning.
  5. Skär av frambenen av embryon och överföra framben med en ring pincett i 24 brunnar innehållande 2 ml iskall färska 4% Paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffert saltlösning (PBS).
  6. Fäst framben med varsam blandning på Nutator mixern vid 4 ° C över natten.
  7. Följande dag, ta bort PFA och tvätta tre gånger i 5 minuter i 2 ml PBS med varsam blandning på Nutator mixern i rumstemperatur.
  8. Överför framben i 100% metanol (MeOH) och förvara dem vid -20 ° C enzym frys (frysen med kritisk temperatur kontroll och utan automatisk avfrostning funktion). Primära antikroppar som anges i tabell 1 arbete efter 100% MeOH behandling.
  9. Dra av skinnet från forelimb med fin pincett. Limb hud, när uttorkad bör separata lätt från benet. Första plats lem med ventrala sida (handflatan) uppåt. Sedan använda fin pincett, skära in i huden som visas i videon. Nästa dissekera runt hela kroppsdelen, peeling huden bort försiktigt utan några skador.

2. Hela montering immunhistokemisk färgning av Limb Skins

  1. Rehydrera lem skinn 5ml polypropylen rundbottnad röret genom att inkubera genom graderade serie MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) i 5 minuter vardera. Observera att utbyta lösningar bör vara noga med att undvika skador på extremiteterna skinn.
  2. Tvätta två gånger i 5 min i PBT med varsam blandning på Nutator mixern i rumstemperatur.
  3. Blockera extremiteten skinn med antingen 10% get serum / PBS 0,2% TX100 blockerande buffert för get sekundära antikroppar eller 10% Donkey serum / PBS 0,2% TX100 blockerande buffert för åsna sekundära antikroppar i 2 timmar med varsam blandning på Nutator Mixer på rumstemperatur.
  4. Placera extremiteten skinn på en 35 x 10 mm petriskål och överlåtelse av en ring pincett i 2ml-mikrocentrifugrör med 800μl av primära antikroppar (lämplig utspädning som anges i tabellerna) i blockerande buffert (antingen 10% get serum / PBS 0,2 % TX100 eller 10% Donkey serum / PBS 0,2% TX100). Inkubera lem skinn med varsam blandning på Nutator mixern vid 4 ° C över natten. Observera att flera primära antikroppar från olika arter (t.ex. råtta monoklonal antikropp + kanin polyklonala antikroppar) kan användas samtidigt.
  5. Följande dag, plats lem skinn på en 35 x 10 mm petriskål och överlåtelse av en ring pincett i 5ml polypropylen rundbottnad rör med 4 ml av tvätt buffert (antingen 2% get serum / PBS 0,2% TX100 eller 2 % Donkey serum / PBS 0,2% TX100).
  6. Tvätta fem gånger i 15 min med varsam blandning på Nutator mixern i rumstemperatur.
  7. Placera extremiteten skinn på en 35 x 10 mm petriskål och överlåtelse av en ring pincett i 2ml-mikrocentrifugrör med 800μl av sekundära antikroppar i blockerande buffert (antingen 10% get serum / PBS 0,2% TX100 eller 10% Donkey serum / PBS 0,2% TX100). Vanligtvis använder vi sekundära antikroppar från Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 utspädning) eller Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 utspädning). Filtrera sekundär antikropp lösningen med hjälp 0.22μm PVDF membranfilter sprutan för att avlägsna aggregerade partiklar av den sekundära antikroppar. Inkubera lem skinn i mörker eller lindade med aluminiumfolie i 1 timme med varsam blandning på Nutator mixern i rumstemperatur. Observera att olika fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar kommer från olika arter kan användas samtidigt.
  8. Placera extremiteten skinn på en 35 x 10 mm petriskål och överlåtelse av en ring pincett i 5ml polypropylen rundbottnad rör med 4 ml av tvätt buffert (antingen 2% get serum / PBS 0,2% TX100 eller 2% Donkey serum / PBS 0,2% TX100). Tvätta fem gånger i 15 min i mörker eller lindade med aluminiumfolie med varsam blandning på Nutator mixern i rumstemperatur.
  9. (Tillval för motfärgning mot kärna) Inkubera lem skinn med 4 ml av tvätt buffert (antingen 2% get serum / PBS 0,2% TX100 eller 2% Donkey serum / PBS 0,2% TX100) med To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 utspädning) i mörker eller lindade med aluminiumfolie i 10 min med varsam blandning på Nutator mixern i rumstemperatur temperaturerRe. Sedan tvätta tre gånger i 5 minuter med 4 ml av tvätt buffert (antingen 2% get serum / PBS 0,2% TX100 eller 2% Donkey serum / PBS 0,2% TX100) i mörker insvept eller aluminiumfolie med varsam blandning på den Nutator Mixer vid rumstemperatur. Observera att starka och specifik färgning för kärnor observeras för att pro-3 i en specifika utsläppet (HeNe 633 nm excitation).

3. Montering av Limb Skins på Slide

  1. Placera extremiteten skinn på en 35 x 10 mm petriskål. Ta bort damm, kristaller, fibrer från det inre lagret av skinn med fin pincett under stereomikroskop med låg belysning för att undvika omfattande foto blekning.
  2. Överför lem skinn till lim mikroskopisk bild av en ring tång. Placera skinn med det inre lagret ligger uppåt i bilden (dvs mot täckglaset). Platta till skinn försiktigt med fin pincett och ta bort överföring tvättbuffert av Kimwipe.
  3. Montera i anti-fade montering media utan luftbubblor. Vi använder 25 "x25" täckglas. Cure på en plan yta i mörker (t.ex. monterade prover med Förläng Guld reagens placeras över natten i mörker vid rumstemperatur före visning). För långtidsförvaring, täta täckglas till bilden och förvara vid 4 ° C.

4. Konfokalmikroskopi

  1. Inrätta lämpliga laser för fluoroforer. Vi använder Leica TCS SP5 konfokalmikroskop med tre laserkällor inklusive Argon 488nm (för Alexa Fluor 488 och GFP), DPSS 561nm (för Alexa Fluor 568 och Cy3) och HeNe 633nm (för Alexa Fluor 633, Cy5 och Till-Pro-3) .
  2. Använd sekventiell skanning verktyg för att undvika eller minska överhörning där alla färgämnen i dubbel-eller trippel-färgade prover kommer vara glada på samma gång. I den sekventiella skanningsläget, kommer bilderna att registreras i en sekventiell ordning.
  3. Mer allmän information om fluorescerande färger och lasrar för excitation kan grundas i "konfokalmikroskopi för biologer" av Hibbs (2004)

5. Representativa resultat

Hela montera trippel-label konfokala immnofluorescence mikroskopi i mus forelimb huden på E15.5 med antikroppar mot den pan-endotel markör PECAM-1 (Figur 1A-C, D blå), de neurofilament markör 2H3 (Figur 1A grön) och den glatta muskulaturen cellen markör αSMA (Figur 1A, B röd) visade en karakteristisk förgrening mönster av αSMA + artärer, i linje med 2H3 + perifera nerver i extremiteten huden. Förutom blodkärl förgrenar är denna delgrund huden kärlsystemet modell som används för att studera mönstring av lymfatiska fartyg förgrening med antikroppar mot det lymfatiska endotelceller markör LYVE-1 (Figur 1D, E röd) och Neuropilin2 (NRP2) (Figur 1D, F gröna ).

Figur 1
Figur 1. (AC) artärer anpassning till perifera nerver i den embryonala lem huden. Hela montera trippel-label konfokala immnofluorescence mikroskopi med antikroppar mot den pan-endotel markör PECAM-1 (AC, blå), de neurofilament markör 2H3 (A, grön), och den glatta muskulaturen cellen markör αSMA (A och B, röd ) visas. På E15.5, 2H3 + perifera nerver (öppen pilar) förknippar med artärer (pilspetsar) som omfattas av αSMA + glatta muskelceller. (DF) lymfatiska kärlen i den embryonala lem huden. Triple-etikett konfokala immnofluorescence mikroskopi med antikroppar mot den pan-endotel markör PECAM-1 (D, blå), det lymfatiska endotelceller markör LYVE-1 (D och E, röd) och Neuropilin2 (NRP2) (D och F, grön ) visas. Lymfkärl kan göras synliga genom både LYVE-1 och NRP2, medan LYVE-1 uttrycks även av en delmängd av makrofager (öppen pilspetsar). Skala bar: 100μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kärlsystemet är avgörande för organutveckling under fosterutvecklingen samt för orgel underhåll och fortplantningsförmågan hos vuxna, eftersom det levererar tillräckligt med syre och näring till organen. Korrekt vaskulära nätverket är väletablerat med komplexa och multi-processer genom angiogenes där befintliga kapillära nätet är organiserat med mycket grenade och hierarkiska strukturer. Trots att många verk har visat att en mängd olika molekyler som är inblandade i dessa processer, har det inte varit klart hur organ eller deras komponenter ger signaler att främja stegvis process av vaskulära utveckling inklusive endotel differentiering och mönstring av vaskulära förgrening. För att hantera denna fråga är lämpliga vaskulariserad organ där vi kan följa processen av vaskulära utveckling krävs. Extremiteten huden kärlsystemet modell med få-av-funktion och bortfall av funktionen genetiska manipulationer möjliggör hög upplösning analys av vaskulär utveckling.

Vi beskriver här ett detaljerat protokoll, inklusive dissekering av embryonala mus framben, hel-fäste immunhistokemisk färgning och konfokalmikroskopi som rutinmässigt används i vårt laboratorium för att analysera angiogenes lem hud och lymphangiogenesis. Protokollet ger reproducerbara resultat och intakt kärl för tidiga liksom sena embryonala lem hud är lätt att avbildas av konfokalmikroskopi. Det gäller också för vuxna öron huden kärlsystemet (YM och K. Perkins, opublicerad). För att ytterligare utforska avbildning av dynamiken i blodkärlens tillväxt och ombyggnader är dock andra djurmodell som zebrafisk med fluorescerande blodkärl användbart för tidsförlopp avbildning av kärlen in vivo med hög upplösning.

Hela montering konfokalmikroskopi med flera märkning av vaskulära markörer möjligt för oss att bilden Blodet och endotelceller, och deras grannar, inklusive glatta muskelceller och pericyter i skinn. Förutom den vaskulära markör antikroppar (tabell 2), kan antikroppar för produkter reporter gen (β-galaktosidas, β-gal och grönt fluorescerande proteinet, GFP, tabell 2) att sammanfatta uttrycket mönster av endogena gener av ditt intresse användas. Till exempel använde vi forelimb huden från Embryon som lacZ reporter riktade till ephrinB2 (Wang et al., 1998) eller EphB4 lokus (Gerety et al., 1999), vilket ger en histokemiska indikator på ephrinB2 eller EphB4. EphrinB2, en transmembrana ligand, uttrycks genom artärerna men inte vener, medan dess receptor är tyrosinkinas EphB4 företrädesvis uttrycks av vener (Wang et al., 1998). Hela montering immunhistokemisk analys forelimb skinn från E15.5 ephrinB2 lacZ / + eller EphB4 lacZ / + heterozygot embryon visade att perifera sensoriska nerver i samband företrädesvis med arteriell fartyg (Mukouyama et al. 2002). Dessa möss är tillgängliga i Jackson Laboratory (Efnb2 tm1And / J: lager # 006.039, Ephb4 tm1And / J: lager # 006.044).

Studiet av olika stadier av dessa vaskulära system avslöjar cellulär dynamik angiogenes, inklusive vaskulära förgrening, arteriella / venösa differentiering, lymfatiska fartyg utveckling och glatt muskulatur / pericyte täckning i u-lem huden. Genom E13.5 var primitiva kapillär plexus etablerade i extremiteten huden men inget samband mellan sensoriska nerver och blodkärl har observerats. Genom E14.5 inträffade kärlremodellering och nerv i samband med remodeled grenade fartyg, som uttrycker arteriell endotelceller markörer och har αSMA + glatta muskelceller (Mukouyama et al. 2002). Genetiska studier tyder på att perifera sensoriska nerver ger en mall för att bestämma blodkärl förgrenar mönster och arteriell differentiering (Mukouyama et al. 2002). Analysen av nerv-VEGF-A villkorlig mutanter visade att nerv-derived VEGF-A krävs för arteriell differentiering i extremiteten huden kärlsystemet (Mukouyama et al. 2005). Våra resultat visade också att nerv-VEGF-A villkorlig mutanter uppvisar mindre nedsättning av nerv-fartyg anpassning, vilket indikerar medverkan av ytterligare angiogena faktor (s). Detta tyder på att lem huden kärlsystemet modell ger oss möjlighet att studera olika mekanismer som styr arteriell differentiering och mönstring av vaskulära förgrening. Dessutom kontrollerar vad venös differentiering och mönstring av venösa och lymfatiska fartyg förgrening återstår att besvaras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar K. Gill för hjälp med mus uppfödning och vård och för laboratorie-ledningen. Tack också till Mukoyama lab medlemmar för teknisk hjälp. Finansieringen kom från Interna forskningsprogram Naitonal Institutes of Health.

Materials

Antibodies

Pan-endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1
PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution
VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution
CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution
Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2

Arterial endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution
Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution

Venous endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution

Lymphatic endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution
LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution
Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution
Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution
Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution
Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution

Smooth muscle cell/pericyte marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6
NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution
SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution

Antibodies forGFP reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution
GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution
GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution

Antibodies for LacZ reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution
β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution
β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution

Antibodies for peripheral axon

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution
Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution
Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution

Antibodies for migrating Schwann cells

BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution

(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody

#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.

#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.

#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.

#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.

#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.

#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.

#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.

#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.

#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  3. Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
  4. Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).

Comments

5 Comments

  1. excellent! I learned a lot

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2011 - 5:38 PM
  2. Very detailed and helpful !!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 9:54 AM
  3. it is the first time I saw the image of nerves and vessels so lively. it is a GREAT model to study the dynamic development during mouse embryonic stage even in adult mouse! it is amazing that you found this technic!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 8, 2012 - 11:26 AM
  4. Thanks for the very useful method!
    Have you tried adult mouse skin? What would you recommend to modify if I do whole mount staining of adult mouse skin?
    Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Dong W.
    February 6, 2013 - 10:36 PM
  5. Yes, this method works on adult mouse skin as well. The detailed protocols are descibed in our revision paper submitting to Developmental Dynamics. Thanks!

    Reply
    Posted by: wenling l.
    February 7, 2013 - 2:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics