Détermination des espèces d'oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

Neuroscience
 

Summary

Nous démontrons l'application de l'indicateur de fluorescence, TMRM, dans les neurones corticaux de déterminer les changements relatifs d'intensité de fluorescence TMRM avant et après application d'un stimulus spécifique. Nous montrons aussi l'application de la fluorescence de la sonde H

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Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (51), e2704, doi:10.3791/2704 (2011).

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Abstract

Potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) est essentiel pour maintenir la fonction physiologique de la chaîne respiratoire pour produire l'ATP. Une perte importante de ΔΨm rend les cellules épuisées d'énergie avec la mort subséquente. Espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont importantes molécules de signalisation, mais leur accumulation dans des conditions pathologiques conduit au stress oxydatif. Les deux principales sources de ROS dans les cellules sont des toxines environnementales et le processus de phosphorylation oxydative. Dysfonction mitochondriale et le stress oxydatif ont été impliqués dans la physiopathologie de nombreuses maladies et, par conséquent, la capacité de déterminer ΔΨm et ROS peuvent fournir des indices importants sur l'état physiologique de la cellule et la fonction des mitochondries.

Plusieurs sondes fluorescentes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) peut être utilisée pour déterminer Δψm dans une variété de types de cellules, et de nombreux indicateurs de fluorescence (Dihydroethidium, dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) peut être utilisée pour déterminer les ROS . Presque toutes les sondes de fluorescence disponibles utilisés pour évaluer ΔΨm ou ROS sont une seule longueur d'onde des indicateurs, qui augmentent ou diminuent leur intensité de fluorescence proportionnelle à un stimulus qui augmente ou diminue les niveaux de ΔΨm ou ROS. Ainsi, il est impératif de mesurer l'intensité de fluorescence de ces sondes au niveau basal et après l'application d'un stimulus spécifique. Cela permet de déterminer le pourcentage de changement dans l'intensité de fluorescence entre le niveau de référence et un stimulant. Ce changement dans l'intensité de fluorescence reflète le changement dans les niveaux relatifs de ΔΨm ou ROS. Dans cette vidéo, nous démontrons comment appliquer l'indicateur de fluorescence, TMRM, chez le rat neurones corticaux de déterminer le pourcentage de variation de l'intensité de fluorescence TMRM entre le niveau de base et après l'application FCCP, un découplant mitochondrial. Les niveaux inférieurs de la fluorescence TMRM résultant du traitement FCCP refléter la dépolarisation du potentiel de membrane mitochondriale. Nous montrons aussi comment appliquer la fluorescence de sonde H 2 DCF-DA pour évaluer le niveau de ROS dans des neurones corticaux, d'abord au départ et puis après application de H 2 O 2. Ce protocole (avec des modifications mineures) peuvent être également utilisés pour déterminer les changements dans ΔΨm et ROS dans différents types cellulaires et dans les neurones isolés à partir d'autres régions cérébrales.

Protocol

1. La culture cellulaire

  1. Les neurones corticaux sont isolées et cultivées en utilisant des techniques décrites précédemment et étalées sur des boîtes de culture avec un fond de verre (MatTek Corporation, Ashland, MA) recouvertes de poly-D-lysine et de la laminine 1.

2. Préparer les solutions mères pour les sondes fluorescentes TMRM et H 2 DCF-DA

  1. Préparer une solution stock de 10 mM de TMRM en dissolvant 5,0 mg de TMRM dans 1 ml de diméthylsulfoxyde anhydre. Vortex c'est pendant 1 min. Ensuite, faire des aliquots et de les stocker à -20 ° C, protéger de la lumière, et l'utiliser dans un mois.
  2. Ensuite, préparer une solution stock de 10 mM de H 2 DCF-DA en dissolvant 4,87 mg de H 2 DCF-DA dans 1 ml de DMSO anhydre. De même, il vortex pendant 1 min. Ensuite, faire des aliquots et de les stocker à -20 ° C, protéger de la lumière, et l'utiliser dans une semaine.

3. Chargement des neurones de rat corticale avec TMRM et H 2 DCF-DA

TMRM est un potentiométrique, les cellules perméables indicateur fluorescent qui s'accumule dans l'intérieur, fortement chargées négativement des mitochondries. Il est important d'utiliser les faibles concentrations (10-50 nm) des TMRM pour éviter l'auto-extinction de TMRM mitochondriale. Ensuite, le signal de fluorescence de TMRM peuvent être directement liés à la co-ΔΨm à travers la membrane mitochondriale interne. Une perte de ΔΨm provoque une fuite de TMRM des mitochondries entraînant une perte d'intensité de fluorescence. H 2 DCF-DA est la cellule-perméable sonde converti en signal DCF-DA par des estérases intracellulaires, et ses résultats d'oxydation dans DCF fluorescente. La concentration finale de H 2 DCF-DA varie entre 2-10 uM et il devrait être testé empiriquement dans les neurones issus de différentes régions du cerveau car les concentrations de chargement élevée peut entraîner la saturation du DCF de fluorescence, même en l'absence de H 2 O 2. La présence de tout oxydant endogène ou exogène (par exemple, l'hydrogène hypoazotique oxyde) va augmenter DFC de fluorescence d'intensité. Ci-dessous, nous fournissons un protocole pour le chargement de neurones corticaux de rat avec TMRM et H 2 DCF-DA.

  1. Pour charger les neurones corticaux de rat avec TMRM, d'abord, lavez les neurones cultivés à 3 reprises avec du tampon de Tyrode (Superposition de texte: la tuberculose: 145 mM NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucose, 1,5 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, et 10 mM HEPES; ajuster le pH à 7,4 avec NaOH). Ensuite, préparez 20 nM de TMRM en diluant le stock de 10 mM TMRM 1 / 1000 fois dans la tuberculose, puis ajouter 2 pi de TMRM dilué par 1 ml de la tuberculose. Incuber les neurones avec TMRM pendant 45 min dans le noir à température ambiante. Après 45 minutes, monter la boîte de culture sur la scène du microscope et de commencer l'imagerie.
  2. Pour charger les neurones corticaux de rat avec du H 2 DCF-DA, laver les neurones cultivés 3 fois avec la tuberculose. Ensuite, préparez 2 uM de H 2 DCF-DA en diluant le 10 mM H 2 DCF-DA stock de 1 / 10 fois dans la tuberculose, puis ajouter 2 pi de dilution de H 2 DCF-DA pour 1 ml de la tuberculose. Puis, incuber les neurones avec du H 2 DCF-DA pendant 45 min dans le noir à température ambiante. Après 45 minutes, laver les neurones 4 fois avec la tuberculose pour enlever l'excès indicateur fluorescent, avant d'obtenir des images.

4. En direct d'imagerie des neurones incubées avec TMRM pour déterminer ΔΨm

  1. Pour effectuer l'imagerie en direct de neurones incubées avec TMRM, microscopie confocale à balayage laser (Superposition de texte: LSM 510, objectif Carl Zeiss Inc), avec l'application de vivre des séries chronologiques de programme, est utilisé. Appliquer à faible résolution et atténué la puissance laser (Superposition de texte: basse résolution: 256 x 256; puissance du laser: 1%) pour minimiser le temps nécessaire pour obtenir des images et d'éviter de photoblanchiment.
  2. . Ensuite, régler la netteté de l'neurones montés chargé avec TMRM utilisant la lumière réfléchie. Examiner la fluorescence TMRM par illumination à 514 nm et la détection à 570 nm. Réglez le gain de détection d'une caméra juste en dessous du niveau de saturation.
  3. Une fois tous les paramètres qui incluent la résolution, la puissance du laser, le gain de détection d'une caméra, et time-lapse d'intervalle pour obtenir des images sont définies, ne pas modifier ces paramètres entre les expériences. Ensuite, modifiez le champ. Commencer à recueillir des images.
  4. Pour tester des changements dans ΔΨm, des stimuli tels que 1 uM de FCCP ou 2 ug / ml de oligomycine, peut être appliquée, ce qui va considérablement dépolariser ou hyperpolariser le potentiel de membrane mitochondriale, respectivement. Ces changements seront reflétés par une diminution de l'intensité de fluorescence TMRM par rapport à l'intensité de la fluorescence de base dans le cas du FCCP, ou une augmentation de TMRM intensité de fluorescence dans le cas de oligomycine.

5. Imagerie en direct de neurones incubées avec H 2 DCF-DA ROS pour déterminer

  1. Pour effectuer l'imagerie en direct de neurones incubées avec H 2 DCF-DA, d'abord, monter la boîte de culture sur la scène d'un microscope. Ajustez la mise au point des cellules-nousING lumière réfléchie. Examinez DCF de fluorescence par excitation à 488 nm et émission à 515 nm.
  2. Ensuite, régler la puissance du laser à 5-7%, le gain du détecteur, et la résolution de 256 x 256. Ne pas modifier ces paramètres entre les expériences. Ensuite, définissez la fréquence pour obtenir des images en direct en utilisant le programme de séries chronologiques.
  3. Sélectionner un domaine nouveau et commencer à acquérir des images. Pour détecter les changements dans les niveaux de ROS, traiter avec des cellules 100-200 pm de H 2 O 2. Cela sera reflété par une augmentation de l'intensité de fluorescence DCF par rapport au niveau de base.

6. L'analyse des données

  1. Utilisez région d'intérêt (Superposition de texte: RCI) l'outil à partir du programme LSM pour sélectionner les domaines. Ensuite, mesurer la TMRM ou ROS intensités de fluorescence. Sélectionnez ROIs de régions mitochondrial ou ROIs du corps cellulaire dans les cellules de toute imagée pour mesurer les intensités de fluorescence de TMRM ou ROS, respectivement.
  2. Calculer les intensités moyennes de fluorescence de tous les ROIs de chaque cellule pour TMRM ou d'organismes à cellules entières pour toutes les cellules imagé pour ROS pour chaque point de temps. Sélectionnez les régions à côté de la cellules pour calculer l'intensité de fluorescence de fond. Prenez plusieurs mesures et de calculer l'intensité de fond moyenne.
  3. Soustraire l'intensité de fluorescence de fond moyen de la moyenne des intensités de fluorescence de ROIs dans chaque cellule de chaque point de temps en utilisant Microsoft Excel. Après soustraction de l'intensité de fond, de normaliser l'intensité de fluorescence TMRM ou DCF à la fluorescence de base en utilisant cette formule (Superposition de texte: AF = FF o / o F x 100, où F = intensité de fluorescence à aucun moment, Fo = base de fluorescence). Ensuite, utilisez le programme tracé Sigma pour générer le graphique montrant les changements d'intensité de fluorescence au cours du temps.

7. Les résultats représentatifs

La figure 1A montre une image de fluorescence des neurones corticaux de rat incubées avec TMRM. Ajout de FCCP, un découplant mitochondrial, conduit à une dépolarisation mitochondriale et une perte d'intensité de fluorescence TMRM (Fig. 1B). Le niveau de fluorescence de base TMRM reste stable avant l'addition du FCCP (le premier 350 sec;. Fig 1C). L'analyse quantitative des changements de fluorescence TMRM au fil du temps montre une diminution significative de la fluorescence après ajout de TMRM FCCP (Fig. 1C).

La figure 1D montre l'image de fluorescence des neurones corticaux de rats chargé avec DCF. L'addition de H 2 O 2 résultats dans DCF augmenté l'intensité de fluorescence dans les corps cellulaires (figure 1E). La base de fluorescence DCF niveau est inchangé (le premier 120 sec) avant l'application de H 2 O 2. Time-lapse mesures de fluorescence montrent DCF ses niveaux stables, ce qui augmente après H 2 O 2 de traitement (Fig. 1F).

Figure 1
Figure 1. Évaluation du potentiel de membrane mitochondriale et les niveaux de ROS dans des neurones corticaux rat vivant. (A) représentant l'image de fluorescence des neurones corticaux chargés avec TMRM. Après la numérisation de la base TMRM de fluorescence, les neurones ont été traités avec le FCCP protonophore (1 uM). A droite se trouve une barre d'intensité de fluorescence pseudo TMRM vif maximal représentant jaune et noir et une intensité minimale, respectivement. La perte de fluorescence TMRM des régions mitochondrial indique l'effondrement du FCCP ΔΨm sur le traitement (tableau B). La représentation quantitative des changements dans l'intensité de fluorescence TMRM à différents moments avant et après traitement FCCP est montré dans le panneau C (D) image de fluorescence des neurones corticaux de rat chargé avec H2DCF-DA. Après détermination de la base DCF de fluorescence, les cellules ont été traitées avec 200 uM H 2 O 2, et le changement de DCF de fluorescence a été évaluée. Une augmentation de la fluorescence DCF reflète l'augmentation des niveaux de ROS lors de H 2 O 2 de traitement (E). L'analyse quantitative des changements dans la fluorescence DCF, avant et après H 2 O 2 de traitement, est montré dans le panneau de F. Échelle bar = 10 um

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
Direct imagerie cellulaire des neurones corticaux dans TMRM avant et après addition FCCP utilisant l'objectif 40X. L'intensité pseudo montre un maximum (jaune vif, avant l'addition FCCP) et a diminué (de couleur rouge, après addition FCCP) TMRM intensité de fluorescence après ajout FCCP. Cliquez ici pour voir la vidéo

Vidéo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Direct imagerie cellulaire du DCF dans les neurones corticaux, avant et après H 2 O 2 en utilisant plus objectif 40X. La base de fluorescence a DCF lumière de couleur verte dans les corps cellulaires et H2O2 ajout augmente le DCF l'intensité de fluorescence à la couleur vert vif. Cliquez ici pour voir la vidéo

Discussion

Nous avons présenté une procédure étape par étape décrivant comment déterminer ΔΨm et ROS dans les neurones corticaux de rat en utilisant les indicateurs fluorescents TMRM et H 2 DCF-DA, respectivement. Pour d'autres types cellulaires, il est important de déterminer empiriquement la concentration finale et le temps de chargement pour TMRM ou H 2 DCF-DA. En général, la gamme des concentrations de TMRM 20-200 nm, et le temps d'incubation des cellules avec des TMRM varie de 20 à 60 min. La concentration finale de H 2 DCF-DA varie de 2 à 10 uM, et l'incubation des cellules dans une solution de chargement contenant cet indicateur varie de 30-45 min.

Il est important pour optimiser la puissance du laser et la vitesse de balayage de prendre les images pour éviter à la fois photo-toxicité pour les cellules et les changements dans l'intensité de fluorescence (par exemple vacillante de TMRM fluorescence) en l'absence de tout stimulus. Les paramètres optimisés optiques devrait se traduire par un signal de fluorescence qui n'est pas plus ou moins saturés (seuil) en l'absence de stimulus. Les conditions optimales pour recueillir les images à partir d'un champ sélectionné à un laser de puissance particulière et une vitesse de balayage sont obtenus lorsque il n'ya pas de changements dans l'intensité de fluorescence de la sonde en l'absence de tout stimulus pendant 10-15 min d'imagerie en temps réel.

Autres sondes de fluorescence pour déterminer ΔΨm comprennent la rhodamine 123 et tétra méthyl ester éthylique de la rhodamine (TMRE). Cependant, ils ont été trouvés pour inhiber les processus respiratoires en 2 mitochondries isolées. Surtout, TMRM n'a aucun effet sur ​​la respiration mitochondriale à de faibles concentrations 2 et a phototoxicité faible et photoblanchiment 3 par rapport à d'autres sondes. H 2 DCF-DA est un bon indicateur de ROS comme elle est bien conservée dans les cellules et reconnaît espèces oxydantes de plusieurs, tels que les peroxydes, oxydes super, et l'oxyde nitrique 4.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (K22NS050137 à JCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass bottom culture dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
NbActive4 BrainBits NbActive4
TMRM Invitrogen T668
H2DCF-DA Invitrogen C400
NaCl Sigma-Aldrich S6191
KCl Sigma-Aldrich P3911
CaCl2∙2H2O Sigma-Aldrich C3306
MgCl2∙6H2O Sigma-Aldrich M2670
D-Glucose Sigma-Aldrich G6152
HEPES Invitrogen 15630

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References

  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Comments

15 Comments

  1. I have ² queries:

    1. U ddid not mention washing off of the TMRM containing media before imaging. DŒs that mean that there is TMRM present in the imaging media?

    ². If DCFDA is washed off and imaging being done, upon addition of H²O², how can the DCF fluorescence increase?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 3:02 AM
  2. 1. We did not wash the neurons after TMRM loading. TMRM makes equilibrium between compartments (mitochondria-cytosol- extracellular buffer) in response to negative membrane potentials and a very low concentration of the dye has to be present in the imaging buffer throughout the experiment.
    ². The principle of H²DCF-DA is different as it is cell-permeable probe and trapped into the cytosol once the acetate group is cleaved by intracellular esterases. The access of dye from extracellular medium has to be washed out. Intracellular oxidation of DCF-DA by reactive oxygen species (generated by H²O² addition) results an increased DCF fluorescence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2012 - 12:42 AM
  3. Thanks for the response. However regarding DCFDA, if the dye is washed off, and then H²O² added to increase the ROS inside cells, where is the dye to react with the newly formed ROS? How will the fluorescence increase if there are no more molecules of DCF available for reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 9:42 AM
  4. When we incubate cells with H²DCFDA for an optimal time period, most of the dye molecules are trapped in cytosol and excess of dye has to be washed from extracellular buffer. The cytosolic dye will have enough molecules to produce many fold increase of fluorescence upon oxidation. Due to basal ROS activity some of the dye molecule gets oxidized but not all until cells undergo some stress which causes ROS formation. It is well known that H²O² addition to the cells result intracellular ROS formation and even H²O² itself can diffuse through the cell membrane and oxidize the cytosolic dye to increase the fluorescence.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 3, 2012 - 12:43 AM
  5. Changes in plasma membrane potential will also lead to a decrease in both the mitochondrial and cytosolic TMRM signals, (because there is a step-wise concentration gradient mitochondrial > cytosol > medium). How do you think is the best way distinguish between a loss of signal due to mitochondrial depolarization vs. loss of signal due to plasma membrane depolarization?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 9:28 PM
  6. A previous lab member has used KCl in the media to keep the plasma membrane potential constant so that changes in TMRM fluorescence are reflective of changes in mitochondrial potential only rather than a combination of both.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 1:57 AM
  7. In non- quenched method (1 to 50nM, should be optimized for a particular cell type) majority of the TMRM fluorescence arise from mitochondria and any change in TMRM fluorescence (either single mitochondrion or entire cell) can be directly correlated to polarized state of mitochondria. Alternately the ratio of TMRM fluorescence from mitochondrial and non-mitochondrial regions in cell can be normalized to ratio of TMRM fluorescence at baseline and after FCCP addition. A parallel control experiment to monitor the TMRM fluorescence under plasma membrane depolarization (such as in presence of 30mM KCl) also can be performed.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 7, 2012 - 12:50 PM
  8. For the DCFDA experiments, is the use of verapamil advisable to inhibit the efflux of DCF from cells?

    Can both TMRM and DCFDA be used at the same time or will one affect the read-out of the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 2:31 AM
  9. We never tried using verapamil in our experiments but there are reports using this drug in DCFDA experiments.
    Yes TMRM and DCFDA can be used at the same time to monitor ROS formation and mitochondrial membrane potential.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 11, 2012 - 1:30 AM
  10. Hi, I am curious how stable the preparation is in order to measure membrane potential. We have a 4 h protocol applied to cells in culture and at the end of this treatment we'd like to assess the membrane potential. Would you recommend loading TMRM before or after the 4 h procedure? I am afraid the membrane potential might change during the 45 min incubation. Therefore, it seems better to load TMRM before perhaps.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 16, 2012 - 11:37 PM
  11. TMRM incubation time varies from one cell type to another. However, once the equilibrium is reached, TMRM fluorescence remains quite stable for long time. You can try loading TMRM before treatment and keep a parallel control loading without any treatment to rule out the change in TMRM fluorescence due to artifacts.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 17, 2012 - 11:54 PM
  12. Thanks. Another question is whether you can easily convert the fluoresce intensity ratio to absolute membrane voltage.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 24, 2012 - 2:22 PM
  13. We can not convert the TMRM fluorescence into absolute membrane voltage. The difference in TMRM fluorescence intensity is always a relative change between the experimental groups.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 24, 2012 - 11:13 PM
  14. But I still have some queries . In your article only described the determination of mitochondrial membrane potential and oxygen species in primary cortical neurons, my query is if I want to know the relationship of my target drug and its concentration to the result , how should I go on my study? Which step should I give my compound to the cell? How can I determine the appropriate concentration? I really appreciate you can give me some advice. I am looking forward for your reply. Wish you have a nice day. Many thinks~

    Reply
    Posted by: longjun z.
    February 25, 2013 - 9:40 PM
  15. First, you will have to optimize the dye as well as the drug concentration in the cells independently. I would suggest optimizing the dye loading conditions first, then do dose dependent changes in the fluorescence of either TMRM or DCF to get an optimal drug concentration to start with. Once you have the optimized conditions, you can measure the ROS and membrane potential in two ways. 1. Incubate the cells with the probe; image them before and after the addition of drug. ². You can incubate the cells with drug and then load the cells with probe to monitor the effect of your drug. If longer incubation of drug is required, second method is preferred. Both the methods are well documented in the literature.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    February 28, 2013 - 1:23 PM

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