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Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Medicine

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Summary

Ce protocole vidéo montre l'application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l'identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.

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Deleyrolle, L. P., Rohaus, M. R., Fortin, J. M., Reynolds, B. A., Azari, H. Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE). J. Vis. Exp. (62), e3918, doi:10.3791/3918 (2012).

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Abstract

Hétérogénéité tumorale représente une caractéristique fondamentale soutenant la robustesse de la tumeur et présente un obstacle majeur au développement de stratégies thérapeutiques 1. Pour surmonter le problème de l'hétérogénéité tumorale, il est essentiel de développer des tests et des outils permettant phénotypique, (épi) l'identification génétique et fonctionnelle et la caractérisation des sous-populations tumorales qui conduisent pathologies spécifiques aux maladies et représentent des cibles cliniquement pertinentes. Il est maintenant bien établi que les tumeurs présentent distinct sous-fractions de cellules avec des fréquences différentes de la division cellulaire, et que les critères fonctionnels d'être lent vélo est positivement associée à la capacité de formation de tumeurs dans plusieurs cancers, notamment ceux du cerveau, du sein, de la peau et pancréas et leucémie 2-8. Le colorant fluorescent carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) a été utilisée pour suivre la fréquence de division des cellules in vitro et in vivo dans le sang tumors et des tumeurs solides tels que le glioblastome 2,7,8. La cellule-perméant non fluorescent pro-drogue de CFSE est converti par les estérases intracellulaires en un composé fluorescent, qui est retenu à l'intérieur des cellules par liaison covalente à des protéines par réaction de son radical succinimidyle avec des groupes amine intracellulaires pour former des liaisons amide stables 9. Le colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l'intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Cela permet le suivi de la fréquence du cycle cellulaire jusqu'à huit à dix tours de la division 10. Capacité de rétention CFSE a été utilisé avec des cellules tumorales du cerveau pour identifier et isoler une sous-population vélo lente (top 5% colorant retenue cellules) a démontré d'être enrichie en activité des cellules souches du cancer 2.

Ce protocole décrit la technique de coloration des cellules avec CFSE et l'isolement des populations individuelles au sein d'une culture de l'homme glioblastome (GBM) dérivés de cellules possédant des taux de division différents en utilisant 2 cytométrie en flux. La technique a permis d'identifier et d'isoler une tumeur au cerveau lent vélo population de cellules en raison de leur capacité à retenir l'étiquetage CFSE.

Protocol

1. Préparation de la suspension de cellules de glioblastome unique

  1. Gliomasphere culture est établie et maintenue en utilisant le test de neurosphères (NSA) comme décrit précédemment 2,11,12.
  2. Au moment approprié pour les passages gliomaspheres, le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une taille stérile tube approprié culture de tissus, et centrifugé à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min à température ambiante.
  3. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension de sphères dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incubées à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 3-5 min.
  4. Un volume égal d'inhibiteur de trypsine de soja est ensuite utilisé pour arrêter l'activité trypsine.
  5. La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour assurer l'homogénéité et la neutralisation complète de l'activité de la trypsine.
  6. La suspension cellulaire est à nouveau centrifugé à 800 tours par minute pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de NeuroCultNSC milieu de base.
  7. 10 pl de la suspension à cellule unique est mélangée avec 90μl de bleu trypan à effectuer un comptage des cellules.

2. La coloration avec la revue Cell Trace Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) Teinture verte fluorescente

  1. Pour chaque 1 million de cellules à colorer, 1 ml de réactif de coloration est préparée en ajoutant 1 pi de 5 mM de cellules CFSE colorant Trace (Molecular Probes, Invitrogen) à 1 ml de milieu de base NeuroCult NSC pour obtenir une concentration finale de coloration 5 uM .
  2. Le réactif de coloration contenant les cellules est bien mélangé jusqu'à homogénéité et incubée à température ambiante pendant 10 min.
  3. Pendant l'incubation, glacée NeuroCult NSC milieu de base est préparée comme la solution de trempe.
  4. Pour arrêter le processus de coloration, les volumes environ 5-10 de solution d'arrêt glacée est ajoutée aux cellules CFSE-chargés.
  5. La solution est ensuite centrifugée à 800 rpm pendant 5 min et le surnageant est éliminé.
  6. A eest le point, il doit apparaître une pastille de cellules au fond du tube avec une teinte vert clair de couleur, indiquant la coloration a été couronnée de succès.
  7. Les cellules sont lavées par remise en suspension du culot dans 1-2 ml de frais NeuroCult NSC milieu de base, la centrifugation à 800 rpm pendant 5 min et élimination du surnageant. Cette procédure est répétée pour un total de trois lavages.
  8. Après le troisième lavage, les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu de base NeuroCult NSC et une numération cellulaire est effectuée.
  9. Les cellules CFSE colorées sont ensuite étalées dans des flacons de culture de tissus stériles à une densité appropriée [50.000 cellules / ml] et placé dans un 37 ° C / 5% de CO2 incubateur humidifié.

3. Vérification en cours de chargement CFSE

  1. Cellules ensemencées dans la culture NSA peut être contrôlé au microscope à fluorescence afin de vérifier coloration CFSE. A ce stade, toutes les cellules présentent lumineux de couleur verte (Figure 1). En variante, une goutte de la suspension de cellules à partir deCellules colorées CFSE pourrait être placée sur une lame de microscope et recouverte d'une lamelle couvre-objet à visualiser les cellules au microscope fluorescent.
  2. Étiquetage CFSE réussie est confirmée par cytométrie en flux. Pas moins de 1-5 x 10 5 cellules de chaque groupe est suffisant pour la vérification de coloration CFSE. Le CFSE chargés et déchargés cellules cellules témoins négatifs sont remises en suspension dans respectivement 1 x-PBS ou NeuroCult NSC milieu de base pour un volume total de 500 ul et placés dans des tubes FACS séparés.
  3. Le cytomètre de flux est ajusté en fonction de ses instructions mode d'emploi pour les paramètres associés. CFSE a une longueur d'onde d'excitation maximale de 492 nm et le maximum d'émission de 517 nm.
  4. Tout d'abord, les cellules témoins non chargées sont exécutées et les événements acquis sont enregistrés dans dispersion vers l'avant et le côté (FSC vs SSC) et des parcelles histogramme, et la population de cellules principale est fermée (figure 2A).
  5. De même, les cellules CFSE chargés sont analysées en utilisant le même paramètres utilisé pour les cellules de contrôle (figure 2B).

4. Isolement de la lente séparation [CFSE soit retenue] Population cellule à l'aide Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)

  1. Lors de la division, de l'intensité CFSE est diminuée et les cellules hGBM former gliomaspheres qui sont composées de cellules présentant différents niveaux d'intensité de fluorescence verte (Figure 3). Lorsque les gliomaspheres ont atteint une taille moyenne d'environ 150-200 pm de diamètre (environ 5 à 10 jours après chargement CFSE en fonction de la vitesse de croissance de la lignée cellulaire), le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une culture tissulaire stérile de taille appropriée tube et centrifugée à 800 rpm pendant 5 min à température ambiante.
  2. Une suspension à cellule unique est préparé de la manière décrite dans les étapes précédentes, et les cellules sont remises en suspension dans du PBS pendant un nombre de cellules afin de préparer une suspension de cellules avec une densité allant jusqu'à 10 7 cellules par millilitre.
  3. À l'arrièreer remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de PBS, l'iodure de propidium (PI, Sigma, 500 pg / ml) est ajouté à une concentration de 1 ug / ml de suspension cellulaire à exclure les cellules mortes lors du tri / analysés par cytométrie en flux.
  4. Deux 15 ml stériles tubes de culture cellulaire contenant chacun 1 ml de NeuroCult complet NSC moyen est utilisé pour collecter les cellules triées lente séparation (cellules CFSE de retenue) et les cellules rapides de division (cellules CFSE dilution).
  5. Tout d'abord, la suspension de cellules dans le groupe de cellules non chargée est exécutée à travers le cytomètre de flux.
  6. Les cellules (événements) sont tracées sur la base de diffusion vers l'avant (FSC) contre side scatter (SSC) et les paramètres de tension pour les deux paramètres sont réglés de telle sorte que la majorité des cellules sont inclus dans le complot de flux.
  7. Pour exclure les cellules mortes ou endommagées, les cellules sont tracées en fonction de la réactivité par rapport SSC PI et la population seule cellule vivante (PI négatif) est fermée.
  8. Ensuite, une population homogène de cellules est sélectionnée en fonction fscatter scatter orward (FSC) par rapport latéral (SSC).
  9. La seule population homogène de cellules vivantes est ensuite tracée dans un histogramme basé sur la fréquence de cellules CFSE mis en fonction de l'intensité sur une échelle logarithmique. L'intensité du laser est ajustée CFSE pour placer le signal négatif entre 0 et 100.
  10. En utilisant les mêmes paramètres et une stratégie de déclenchement similaire, les cellules CFSE étiquetés sont passés à travers le cytomètre en flux et analysées (figure 4C).
  11. Par la suite, une population de cellules divisant lente et une population globale (cellules en division rapide) sont identifiés en fonction de leur capacité à retenir CFSE (CFSE haut-dessus de 5% et CFSE bas-fond de 85%, respectivement).
  12. Ces différentes populations de cellules sont ensuite triées dans différents tubes stériles de 15 ml de culture de tissus contenant 1 ml de milieu complet NSC.
  13. Les cellules triées sont ensuite centrifugées à 800 rpm pendant 5 min.
  14. Surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans une approle volume approprié de milieu (en fonction du nombre d'événements isolés ou la taille de pastille) et une numération cellulaire est effectuée.
  15. Les cellules provenant de différentes populations triées sont ensuite étalées à 50.000 cellules par millilitre dans une fiole appropriée tissus stériles culture et placé dans un 37 ° C / 5% incubateur à CO2 humidifié pendant 5-10 jours avant d'être des passages en série ou utilisés pour des expériences en aval.

5. Les résultats représentatifs

Après le chargement CFSE, toutes les cellules présentent une fluorescence verte intense que visualisé au microscope (Figure 1). Cette couleur verte teintée peut être vu, même à l'œil nu (voir la vidéo). L'analyse de ces cellules avec la cytométrie en flux montre également très intense fluorescence verte par rapport aux cellules témoins (Figure 2). Sur les cellules CFSE placage chargés de la culture de neurosphères, ces cellules prolifèrent et forment 150-200 gliomaspheres um dans 5-10 jours. Comme les cellules prolifèrent, t Il colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l'intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Glioblastomes sont fonctionnellement hétérogènes et sont constituées de cellules en prolifération sur des échelles de temps différentes. La méthode décrite dans ce protocole permet d'identifier et d'isoler rapides et lents cellules qui se divisent en vertu de leur capacité de diluer ou de conserver CFSE, respectivement (figure 3, voir aussi la vidéo).

Analyse par cytométrie en flux de gliomaspheres dissociées générés à partir de cellules chargées CFSE par rapport aux cellules non chargées démontre diverses propriétés de rétention CFSE (figure 4). Cellules en division rapide (en bas 85%) ou lents cellules en division (les 5% - haute CFSE) gliomapshere exposition capacité à former lorsqu'elles sont cultivées dans les conditions d'essai neurosphères (figure 5).

gure 1 "/>
Figure 1. Cellules tumorales dissociées immédiatement après le chargement d'un colorant CFSE. Les cellules présentent lumineux de couleur verte démontrant l'étiquetage succès. Grossissement, 10 x.

Figure 2
Figure 2. Confirmation chargement CFSE par cytométrie en flux. A) des cellules non chargées, B) CFSE chargé cellules et c) comparer l'intensité de fluorescence dans des cellules CFSE chargés par rapport à vide. Notez qu'il ya plusieurs ordres de grandeur de différence dans l'intensité de fluorescence entre les cellules marquées et non marquées.

Figure 3
La figure 3. Gliomasphere Un représentant dérivée d'une cellule chargée par CFSE 6 jours après l'étalement. Certaines cellules présentent une coloration CFSE très lumineux. Grossissement, 63 x.

"Figure Figure 4. Représentant cytométrie de flux parcelles / histogrammes pour l'isolement de rapides et lents cellules en division 6 jours après coloration CFSE. Une réactivité) FSC vs SSC montrer à la population cellule entière, B) SSC vs PI à exclure les cellules mortes ou endommagées, C) FSC vs SSC à la porte d'une population cellulaire homogène en direct, D) Démontrer la présence de cellules CFSE de retenue 6 jours après le marquage CFSE comme en témoigne une plus grande intensité de la fluorescence par rapport au contrôle négatif. L'histogramme montre également que l'intensité CFSE pourri au fil du temps. E) Histogramme affichant la stratégie de déclenchement pour identifier les cellules CFSE de retenue (top 5%) et les cellules CFSE dilution (en bas de 85%).

Figure 5
Gliomaspheres Représentant Figure 5. Générées à partir de cellules-bas (CFSE) et des cellules B) lente séparation (CFSE haut). Grossissement:. 10x et 20x respectivement C) représentant le nombre de cellules obtenues à partir de division rapide ou lent dérivé des cellules de culture au temps de passage. P <0,05, test t. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Un nombre croissant d'études ont démontré l'importance d'une lente séparation sous-compartiment des cellules dans le cancer qui contribuent à la formation de tumeurs et 2-8 la résistance au traitement. Par conséquent, il est essentiel de décrire et de standardiser les méthodes expérimentales permettant l'étude de cette sous-population spécifique de cellules ou plus généralement de comparer des sous-populations avec des taux de croissance différents. Utilisation CFSE pour identifier et isoler des sous-fractions de cellules en fonction de leur taux de division cellulaire est un point de départ pour approfondir la caractérisation de ces fractions cellulaires spécifiques, contribuent à faire progresser notre compréhension de l'hétérogénéité décrits dans les tumeurs. Dans ce protocole, nous avons donné l'exemple de l'identification et l'isolement d'une population au sein de la division lente glioblastome, mais ce protocole peut également être appliquée à d'autres cellules tumorales, y compris et sans s'y limiter, les cancers du sein, du pancréas et de la peau. L'analyse en aval de ces populations peut être effectuée et peuvent inclure des fonctDes études comparant ional potentiel prolifératif 2, la capacité de formation de tumeur 2, la sensibilité au traitement, et (épi) génétiques des comparaisons. Cette méthodologie peut également être utilisé avec des systèmes non-cancéreuses et peut être appliqué, par exemple, pour somatiques tige / cellules précurseurs.

Points critiques techniques relevant de la procédure à suivre dissociation suffisant de cellules avec de la trypsine, et la remise en suspension de cellules suffisante dans les milieux de coloration pour établir une densité convenable et assurer une coloration homogène. Un petit échantillon de cellules colorées fraîchement doit être vérifiée par cytométrie en flux pour assurer un étiquetage homogène caractérisé par un profil gaussien de type étroit (voir la figure 2B). Dans le cas de l'étiquetage initial hétérogène, un pré-tri peut être effectué afin d'améliorer la résolution des pics à plus restreint de fluorescence CFSE. Toutefois, il convient de s'assurer que cette pré-tri ne pas sélectionner pour des tailles spécifiques. L'utilisation de l'iodure de propidium (PI) l'étiquetage est important pour identifier des cellules vivantes et mortes de l'enlèvement de la population / endommagée de la grille de travail, du fait de la polarisation qui peut introduire des cellules mortes dans les applications en aval. Il est intéressant de noter l'intensité particulièrement élevée de fluorescence de l'étiquetage CFSE et son potentiel à saigner dans les autres canaux lors de l'utilisation fluorochromes voisins dans le spectre, comme la phycoérythrine fluorochrome (PE). Il est important de noter que des expériences de marquage multiplex avec CFSE et conjugués au fluorochrome anticorps peuvent exiger un processus d'indemnisation au moment de l'acquisition ou de l'analyse. Soyez sûr d'avoir tous les contrôles nécessaires qui comprennent des cellules non colorées (fournir le niveau d'auto-fluorescence), seules les cellules colorées et votre combinaison spécifique. Plusieurs couleurs étiquetage en combinaison avec CFSE fonctionne mieux avec des fluorochromes tels que Pacific Blue ou allophycocyanine (APC). Si le but de l'expérience est de quantifier le nombre absolu de divisions cellulaires sur une période de temps définie, le SCFE intensité moyenne de fluorescence (IMF) doit être mesurée à un minimum de deux temps différents points 2 avec le premier chargement d'au moins 24 heures après CFSE. Intensité CFSE s'effondre dans les 24 premières heures en l'absence de la division cellulaire, mais se stabilise ensuite et diminue par rapport à la division cellulaire. Il est également nécessaire d'inclure une commande avec des cellules CFSE non prolifératives chargés fournissant la base pour la décroissance d'intensité CFSE pas lié à la division cellulaire.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Centre de la Floride pour la recherche tumeurs cérébrales, l'Preston A. Wells Jr. centre de thérapie tumeur au cerveau et le National Institutes of Health (1R21CA141020-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) Stem Cell Technologies 05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) Stem Cell Technologies 05753
%0.05 trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Sigma-Aldrich T6522
Penicillin/Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122
T25 flask Nalge Nunc international 136196
T80 flask Nalge Nunc international 178905
15 ml tubes BD Biosciences 352096
50 ml tubes BD Biosciences 352070
EGF R&D Systems 2028-EG
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Molecular Probes, Life Technologies C34554

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References

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