Farvning protokoller for Menneskerettigheder bugspytkirteløer

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Videoen viser fremgangsmåder til karakterisering af humane pancreasøer med hematoxylin og eosin (H & E) og immunhistokemi (IHC). Pancreatiske sektioner fra hoved, krop og hale regioner farves med både H & E og IHC at bestemme ø endokrine sammensætning (insulin, glucagon og pancreatisk polypeptid), cellereplikation (Ki67) og inflammatoriske infiltrater (H & E, CD3). Den uncinate region er lokaliseret ved hjælp IHC for pancreatisk polypeptid.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (63), e4068, doi:10.3791/4068 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Estimater af ø-området og tal og endokrine celler sammensætning i voksne humane pancreas variere fra adskillige hundrede tusinde til adskillige millioner og beta masse i området fra 500 til 1500 mg 1-3. Med denne kendte heterogenitet, blev en standard behandling og farvning, der er udviklet således, at bugspytkirtlen regioner var klart defineret og holme karakteriseret ved hjælp af strenge histopatologi og immunolokalisering undersøgelser.

Standardiserede procedurer for behandling af human pancreas inddrives fra organdonorer er beskrevet i del 1 af denne serie. Bugspytkirtlen forarbejdes til 3 vigtigste regioner (hoved, krop, hale), efterfulgt af tværgående sektioner. Tværsektioner fra bugspytkirtlen hovedet er yderligere opdelt, som angivet baseret på størrelse, og nummereret alfabetisk at betegne underafsnit. Denne standardisering muliggør en fuldstændig tværsnit analyse af hovedet regionen inklusiv uncinate region, som indeholder sammensat øvævscellerprimært af pancreatisk polypeptid celler til haleregionen.

Den aktuelle rapport udgør del 2 af denne serie, og beskriver de procedurer, som anvendes til seriel sektionering og histopatologisk karakterisering af pancreas paraffinsnit med en vægt på ø-endokrine celler, replikation, og T-celle-infiltrater. Patologi af pancreas sektioner er beregnet til at karakterisere både exokrine, kanalsystem, og endokrine komponenter. Den exokrine rum er undersøgt for tilstedeværelsen af pancreatitis (aktiv eller kronisk), atrofi, fibrose og fedt samt kanalsystemet, især i relation til tilstedeværelsen af pancreatisk intraductal neoplasi 4. Øer evalueres for morfologi, størrelse og densitet, endokrine celler, inflammation, fibrose, amyloid, og tilstedeværelsen af ​​replikerende eller apoptotiske celler med H & E og IHC pletter.

Den sidste komponent er beskrevet i del 2 er levering af farvede slides som digitaliserede hele lysbilleder. De digitaliserede dias er arrangeret af tilfælde og bugspytkirtel region i en online-patologi database at skabe en virtuel biobank. Adgang til denne online samling i øjeblikket i alt til over 200 klinikere og forskere involveret i type 1-diabetes forskning. Den online database indeholder et middel til hurtig og fuldstændig deling af data og for efterforskerne at vælge blokke til paraffin eller frosne serielle sektioner.

Protocol

1. Microtomy for ufarvede Sektioner

  1. Opsæt vandbad og mikrotom som for standard paraffin microtomy. Brug positivt ladede dias og præ-label med sagsnummer, bugspytkirtel region (prøve) og dias nummer. Sted paraffin blok i mikrotomen patronen med kassetten etiketten på venstre side.
  2. Følg normale microtomy procedurer, afsnit i blok indtil væv ensartet er stødt på. Udarbejdelse af et bånd af serielle sektioner (4 um tykke, 3-6 afhængigt af antallet af oprindelige krævede pletter (se sag materialet skema, bilag 1)). Adskilte sektioner i båndet, afhente hver i orden, og sted på objektglas med henblik nummereret med blyant. Betegner, hvis en del er ubrugt ved nummerering sektioner i præcis den rækkefølge. Bevar den samme retning på diaset, som findes i kassetten med Slide Label orienteret til venstre. Tørre natten over ved stuetemperatur og derefter fortsætte med farvning eller distribution til efterforskerne.
  3. ResEAL overflade af paraffin-blok med tynde lag af paraffin til at bevare væv og arkivere ved stuetemperatur eller -20 ° C.
  4. For efterfølgende microtomy, opretholde nummerering for serielle sektioner på hvert niveau som ovenfor. Få 1 ekstra dias og pletter af H & E slide for hver ~ 100 pM niveau inden for hver blok.

2. H & E farvning

  1. Anbring den første serielle snit billede af hver blok i en slæde rack derefter i den første bakke i den automatiske farvningsanordning.
  2. Vælg standard H & E pletten programmet og fortsæt som normalt.
  3. Når du er færdig farvning, skal du fjerne dias fra Autostainer og sted i hætte for dækglas.
  4. Dækglas under anvendelse af standard teknik. Tør grundigt og mærke med en trykt etiket (se punkt 12).

3. IHC Set-up

  1. Vælg Dako programmet for dobbelt pletter og input antal dias. Forberede TBST og citratpuffere, antistoffer og andre Reagenser i henhold til angivne mængder (tabel 1). Læg reagensbakken og dias. Rotation af ren og affald linjer er programmeret i henhold til producentens anbefalinger.
  2. Hvis udførelsen af ​​disse analyser manuelt, forberede anslåede mængder. Inkuber dias i et fugtigt kammer for at undgå dias udtørring på ethvert trin. Følg samme procedure for hver reagenser som når det anvendes til Autostainer.

4. IHC Afparaffinering og Antigen Retrieval

  1. Sættes objektglassene i xylen i 5 minutter. Gentag én gang. Lad ikke objektglassene tørre ud på et senere tidspunkt, før angivet, da dette vil resultere i overdreven baggrunden og dårlig farvning.
  2. Overfør objektglas til 100% ethanol i 2 minutter. Gentag én gang.
  3. Sættes objektglassene i frisk fremstillet 3% H2O 2 i methanol i 10 minutter.
  4. Dip objektglassene i 90% ethanol og derefter placeres i 90% ethanol i 3 minutter.
  5. Overførsel glider til70% ethanol i 1 minut.
  6. Objektglassene skylles i afioniseret vand.
  7. Forvarme damper og citratbuffer i dampkogeren i 5 minutter.
  8. Føj dias til citrat buffer i dampkogeren og damp i 30 minutter.
  9. Umiddelbart overføre dias til vand og holde, indtil glider afkøles til stuetemperatur (ca. 20 minutter).
  10. Overfør objektglassene i Dako Autostainer stativer i henhold til farvning af sekvens (figur 1) og køre den dobbelte farvning programmet. De vigtigste trin i den automatiske farvningsanordnings programmet er angivet, så manuelle kørsler kan dublere.

5. Første primære antistoffer (Ki-67, CD3, pancreatisk polypeptid)

  1. Bloker objektglas med Sniper opløsning i 15 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  2. Inkuber slides i primære antistof i 30 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  3. Inkuberes med Mach2 gede-anti-muse (Ki-67) eller anti-kanin (CD3, pancreatisk polypeptid) peberrodsperoxidase (HRP) polymer til 30 minutes. Vaskes to gange med TBST.
  4. Anvende 3,3-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) til objektglas i 4 minutter. Vaskes to gange med vand.
  5. Slides inkuberet med bugspytkirtlen polypeptid afholdes på Dako, når de analyseres samtidigt og TBST anvendes til alle efterfølgende skridt, mens de resterende dias inkuberes med det andet sæt af primære antistoffer. Alternativt, til manuelle analyser, gå til pkt 6.

6. Anden primære antistoffer (insulin, glucagon)

  1. Inkuber slides i Deeb i 20 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  2. Blok med 10% normalt gedeserum i 20% avidin-blokker i TBST (insulin) eller Sniper (glucagon) i TBST i 20 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  3. Inkuberes med insulin eller glucagon primære antistof i 15 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  4. Insulin: Inkuber objektglassene i biotinyleret gede-anti-marsvine ved 1:300 fortynding i 30 minutter. Vaskes to gange med TBST. Inkuberes med standard vector ABC-AP reagens i 30 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  5. Glucagon: Inkuber objektglassene i buffer i 30 minutter efterfulgt af gede-anti-muse-alkalisk phosphatase (AP) polymer i 30 minutter. Vaskes to gange med TBST.
  6. Mens objektglas inkuberet i konjugater ved at opvarme LPR buffer til stuetemperatur. Tilsæt 1 dråbe væske permanent rød (LPR) pr 3 ml buffer umiddelbart før brug og plads i Dako reagensstativ. Inkuber slides i LPC i 4 minutter. Vaskes to gange med vand.
  7. Inkuber slides i hæmatoxylin i 1 minut. Skylles to gange med vand.
  8. Inkuber objektglassene i TBS pH 7,6 i 1 minut. Skylles to gange med vand.
  9. Unload dias fra DAKO Autostainer.
  10. Umiddelbart dehydrere objektglas farvet for pancreatisk polypeptid. For alle dobbelte farvede objektglas, og derefter tørre i mindst 1 time dehydrere.

7. Dehydrering

  1. Glassene anbringes i 80% ethanol i 1 minut.
  2. Dyp objektglassene i 95% ethanol. Hold objektglas i 95% ethanol i 30 sekunder.
  3. Overfør dias til 100% ethanol og holde 1 minut. Gentag.
  4. Dip dias i xylen.
  5. Hold objektglassene i xylen i 1 minut. Gentag.
  6. Straks monteres dækglas på dias med Cytoseal.

8. Slide Mærkning

  1. Indtast tilfældet identificere oplysninger, herunder orgel og bloknummer, pletter, og dato og print. Serial afsnit nummer er frivillig for de første slide pletter i hver blok. Efterfølgende niveauer er angivet med nummerering.
  2. Sæt etiketter på dias.

9. Slide Scanning

  1. Placer farvede objektglas i scanner bakke og scanne efter instrumentering.
  2. Organiser dias ved donor og vævstype (pancreas hoved, krop, hale, milt).
  3. Arkivere farvede objektglas ved stuetemperatur og de resterende ufarvede objektglas ved -20 ° C indtil anvendelse.

10. Representative Resultater

Disse farvningsprocedurer blev udviklet til JDRF netværk for Pankreatisk organdonorer med Diabetes (nPOD) til at give baseline karakterisering af paraffin og friske frosne blokke. Hver donor har en baseline karakterisering udføres består af farvning 2 blokke fra hver bugspytkirtlen region (hoved, krop og hale), og milten (figur 1, se også sag indsendelse formular, bilag 1). H & E farvning udføres under anvendelse af en automatiske farvningsanordning programmeret som en klinisk anlæg med klinisk kvalitet opløsninger anvendt hele vejen igennem. Som yderligere donorbistand blokke er sektioneret, hver har et dias taget for H & E for at vise vævsmorfologi. Når blokke er sektioneret igen, som til distribution til efterforskerne, vil dybere niveauer også dias taget for repræsentativ H & E dias til at dokumentere hele blokken væv morfologi samt nummerering serielle sektioner på hvert niveau. Farvede objektglas er mærket medtilfælde identifikation, bugspytkirtel region, bloknummer, pletter og dato (Figur 2) og scannet ind online patologi information management-system. Repræsentative billeder fra en kontrol donor er vist i figur 3 ved både lave og høje forstørrelser vise forventede resultater efter denne procedure. Objektglasset farvet med pancreatisk polypeptid (d, H) blev analyseret på en anden dag med assayet udføres manuelt og viser reduceret farvning intensitet hematoxylin kontrastfarve. Forskelle i farvningsintensitet af primære antistoffer eller kontrastfarve mellem assays skal undgås, især hvis du bruger billedet analyse ellers glider med krav om individuel farvekorrektion for at opnå den samme celle områder eller tæller.

Hvert laboratorium bør forvente at optimere antistof koncentrationer, lot-til-lot variation og andre reagenser og betingelser kan påvirke farvningsintensiteten og specificitet. Med købet af nye REAGents, er farvningsprocedurer valideres med kendte positive og negative kontrolprøver for at opnå den samme grad af pletten intensitet som med tidligere reagenser. Yderligere antistoffer optimeret i nPOD patologien kernen er tilvejebragt i tabel 2 som en referencekilde og er blevet anvendt til multilabeling immunofluorescens assays til konfokal mikroskopi.

Figur 1
Figur 1. Dako farvning nettet. Denne skematiske viser en rutinemæssig analyse fra en nPOD donor bugspytkirtlen udføres på en Dako Autostainer. De nPOD donorer er kodet med et 4-cifret identifikationsnummer. To glidebakkerne er vist med lysbilleder arrangeret af pletten. Alternative slide konfigurationer forventes afhængigt af antallet af donorer dias. Positive kontroller omfatter optagelse af et kendt positivt donor for de to dobbelte pletter og donor milt for Ki-67 og CD3. Negative kontroller er dobbelt og omfatter to SLIdes fra en donor pancreas blok inkuberet med immunoglobulin (Ig) fra værtsarten af ​​de primære antistoffer og to objektglas fra donor milt for insulin og glucagon.

Figur 2
Figur 2. Repræsentant dobbelt farvede billede. En typisk færdige billede vises med dias mærkning parametre og væv placering før den digitale scanning udføres.

Figur 3
Figur 3. Repræsentativ H & E og IHC pletter i pancreas sektioner. Snit fra pancreas fra en voksen kvinde organdonor (6096-04 Panhead) blev farvet og digitale udført scanninger som beskrevet i protokollen. Billederne blev opnået under anvendelse af ImageScope visning program hele sektionen (AD) og fra en ø-(EH). De forventede ø plet intensiteter for insulin, glucagon og pancreatisk polypeptid erobserveret for sektioner BD som afsnit D afgrænser denne pancreas hovedblokken indeholder en lille del af uncinate region eller ventrale pancreas Lap som alle øvævsceller indeholder hovedsageligt pankreatiske polypeptid-positive celler. Bemærk, at den hematoxylin kontrastfarve i panel D er for lys, medens hematoxylin kontrastfarve intensiteter i B og C er optimal. Paneler EH viser en ø fra den dorsale lap med den forventede fordeling af p-celler og α-celler. Enkelte pancreatisk polypeptid celler findes i den nedre venstre del af ø (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 + insulin, C, G-CD3 + Glucagon, D, H-pancreatisk polypeptid. AD, 0,2 x, EH-12.8x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Standardisering af IHC procedurer er kritisk for billedanalyse, især når der anvendes computer-baserede algoritme i store antal objektglas over tid. Den IHC farvning beskrevet i denne rapport vil gøre det muligt batch analyse af en given donors prøver ved hjælp af en Autostainer inden for en 8-timers arbejdsdag og er ændret fra en tidligere rapport 5. Digitaliserede hele dias billeder af hver farves slide stilles til rådighed for nPOD-tilsluttede efterforskere gennem web-baserede online patologi system. Efterforskere kan gennemgå donorer demografi, laboratorie-data og andre relevante kliniske historie sammen med de dias, og er i stand til at vælge blokke passer bedst til deres studier (se http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php for mere information) . En sådan et online patologi-system fungerer som en "virtuel biobank". En yderligere forbedring af dette system vil blive gennemført WHEreby objektglas etiketter inkorporere en stregkode til at spore serielle sektioner og niveauer for hver blok med en eventuel mål 3-D rekonstruktion af pancreas.

De to dobbelte farvningsprocedurer blev primært valgt for at bestemme ø β-celle-sammensætning (insulin) i samråd med cellulære replikation (Ki-67) i betragtning af betydningen af at forstå mekanismerne for voksne β-celle regenerering i type 1-diabetes 5,6. Som det andet dobbeltstrengede IHC Assayet udføres på serielle sektioner til den første, er hver ø kendetegnet både β-celle (insulin) og α-celle præparat (glucagon). Desuden er tilstedeværelsen af ​​T-lymfocytter (CD3) bestemt i forbindelse med α-celle-farvning af to hovedårsager. Basis af T-cellemedieret autoimmunitet i progressionen af ​​type 1 diabetes er klart forstås endnu arten af ​​de initierende midler (virus, bakterie, inflammatoriske celler) eller sammensætningen af ​​den kroniske infiltrat med resulCER β-celle dysfunktion og død er endnu ikke fastlagt (revideret i 7,8). Sekund, donorer med type 1 diabetes er en velkarakteriseret mangel på p-celler, således at kombinationen af CD3 og glucagon pletter sikrer identifikation af øer, selv når β-celletab er alvorlig 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne takker donorernes familier og de organudtagning involveret i denne forskning og Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, og Roshan Agarwal for deres eksperthjælp. Dette arbejde blev finansieret af Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) til støtte for Netværk for Pankreatisk organdonorer med Diabetes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) Fisher Scientific H325-500 Endogenous peroxidase blocking
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) Vector Laboratories AK-5000 AP conjugate
Antibody Diluent Invitrogen 003218 Primary antibody
Avidin blocker Vector Laboratories SP-2001 Block endogenous biotin
Biotinylated Goat anti-guinea pig Vector Laboratories BA-7000 Secondary antibody
Bluing Reagent Fisher Scientific 7301 Leica autostainer
Citrate buffer, pH 6.0 BioGenex HK086-9K Antigen retrieval
Clarifier 1 Fisher Scientific 7401 Leica autostainer
Cytoseal XYL Fisher Scientific 8312-4 Coverslip mountant
DAB Vector Laboratories SK-4100 HRP chromogen
DEEB Dako S2003 Endogenous AP blocking reagent
Eosin Y Alcoholic Fisher Scientific 71204 Leica autostainer
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Hematoxylin Dako S3301 Dako autostainer
Hematoxylin 7211 Fisher Scientific 7211 Leica autostainer
IgG (all host species for primary antibodies) Various Various Negative controls for primaries
Liquid Permanent Red (LPR) Dako K0640 AP chromogen
Mach2 AP Biocare Medical MALP521L Goat anti-Mouse AP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical MHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical RHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Methanol Fisher Scientific Various H2O2 diluent
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000 IHC blocking reagent
Sniper Biocare Medical BS966M IHC blocking reagent
TBST 20X Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT IHC buffer
Triology 20x Cell Marque 920P-06 Antigen Retrieval
Xylene Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Table 1. Specific reagents.
Name Company Catalog Number Comments
Paraffin
Amylase Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-46657 Mouse
Amylin Serotec MCA11267 Mouse
Carbonic anhydrase 19.9 Abcam ab15146 Mouse
Caspase-3, cleaved Cell Signaling Technology 9961 Rabbit
CD20 Dako M0755 Mouse
CD3 Dako A0452 Rabbit
CD34 Cell Signaling Technology 3569 Mouse
CD4 Dako M7310 Mouse
CD45 Dako M0754 Mouse
CD68 Dako M0876 Mouse
CD8 Dako M7103 Mouse
Chromogranin A Dako A0430 Rabbit
CK17 Dako M7046 Mouse
CK19 Dako M0772 Mouse
CK7 Dako M7018 Mouse
C-peptide Cell Signaling Technology 4593 Rabbit
Foxp3 e Bioscience 14-4776-80 Rat
Ghrelin Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-10386 Goat
Ghrelin Abcam ab85104 Rabbit
Glucagon Dako A0565 Rabbit
Glucagon Abcam ab10988 Mouse
Glucagon Bachem T-5037 Guinea Pig
Glut-1 Abcam ab40084 Mouse
Glut-2 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-9117 Rabbit
Insulin Dako A0564 Guinea Pig
Ki-67 Dako M7240 Mouse
Mafa Novus Biological NB400-137A Rabbit
Pancreatic polypeptide Invitrogen 18-0043 Rabbit
Pdx-1 Abcam ab47308 Guinea Pig
Proinsulin Novocastra NCL-proin-1G4 Mouse
Proinsulin Developmental Studies Hybridoma Bank GS-9A8 Mouse
Secretagogin Sigma-Aldrich HPA 006641 Rabbit
Smooth muscle actin Abcam ab5694 Rabbit
Somatostatin Dako A0566 Rabbit
Synaptophysin Dako M0776 Mouse
Fresh Frozen
CD11b Abcam ab6332 Rat
CD11c Serotec AHP1226 Rabbit
CD25 Novus Biological NB 600-564 Mouse
CD94 Abcam ab61874 Mouse
GAD65 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-130569 Mouse
HLA-ABC Dako M0736 Mouse
Table 2. Primary antibodies.
Name Company Catalog Number Comments
Aperio Scanscope CS Aperio Technologies Digital slide scanner
DAKO Autostainer Plus Dako IHC stains
Label Matrix printing software BioCarta LM7UP57 Slide label software
Leica XL Autostainer Leica Microsystems H&E stains
Premium Coverglass Fisher Scientific 12-548-5J Coverslip
Spectrum Information Manager Aperio Technologies Scanner software
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15 Positively charged slides
Vegetable steamer Black and Decker Various Antigen retrieval
Zebra TLP 3742 CDWG TLP3742 Slide label printer
Table 3. Specific supplies and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
  2. Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
  3. Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
  4. Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
  5. Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
  6. Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
  7. Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
  8. Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
  9. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics