Name: In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Leer in ovo-elektroporatie van HH-stadium 10 kippenembryo's voor genetische manipulatie van de neurale buis. Deze methode maakt snelle screening van genen in ruggenmergontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Eierbehandeling <ol><li> Eieren mogen worden bewaard bij 13 ° C tot een week voorafgaand aan de incubatie zonder een significant verlies van de levensvatbaarheid (een klein wijnkoeler is ideaal voor dit doel). </li><li> Voorafgaand aan de incubatie, laat de eieren op kamertemperatuur, plaats dan warm in een bevochtigde kip incubator ingesteld op 37,8 ° C (100 ° F). </li><li> We meestal electroporate embryo&#39;s ongeveer 48 uur na het begin van de incubatie, wanneer het embryo heeft Hamburger en Hamilton het podium 10 bereikt. </li><li> De tijd van incubatie kan variëren afhankelijk van de gewenste Hamburger en Hamilton het podium. Temperatuur is kritisch en afwijking van een optimale incubatie temperatuur zal veranderen incubatietijd en de afname van embryo levensvatbaar is. </li><li> Tijdens de incubatie, moeten de eieren worden gehouden op hun kant, zodat het embryo zal goed gepositioneerd voor elektroporatie. Het embryo zal drijven op de top van de dooier en het is nuttig om de top van het ei markeren met een potlood voor window, zodat je weet waar je moet knippen. </li></ol> Voorbereiding <ol><li> Warm Leibovitz L-15 media tot 37 ° C. Trek glas haarvaten in de naalden. Plaats elektroden en micromanipulator en sluit elektroden op de pulsgenerator. </li></ol> Window <ol><li> Behulp van een injectiespuit met grote naald, prik de schil aan het smalle uiteinde van het ei. </li><li> Wijst de naald voorzichtig naar beneden tot een verstoring van de dooier te voorkomen, verwijder dan ongeveer 5 ml albumine. </li><li> Dicht het gat met een klein stukje van de tape. </li><li> Bedek de bovenkant van het ei met een ander stuk van de band (ongeveer 4x4 cm). </li><li> Met behulp van gebogen schaar, en zorg ervoor dat u het embryo te verstoren, een gat net groot genoeg om een ​​raam in te werken bieden. </li></ol> Optioneel: visualiseer de neurale buis, inkt oplossing te injecteren met een 26 gauge naald onder de embryo (steek naald onder de embryo van buiten het bloed ring). Oost-Indische inkt moet worden verdund 1:05 met Hanks of vergelijkbare steriele gebufferde oplossing. Injectie en elektroporatie <ol><li> Breek de capillaire tip om de gewenste diameter met een pincet </li><li> Met behulp van de mond pipet, laad het capillair met plasmide / Fast groene kleurstof. </li><li> Positie van het embryo met het hoofd naar u toe en steek de naald in de neurale buis op een ondiepe hoek. </li><li> Injecteer het plasmide oplossing in het lumen van de neurale buis tot kleurstof vult de hele ruimte. </li></ol> Opmerking: Let erop dat u tip groter dan neurale buis met een diameter hebben. In het algemeen zal je kunnen vertellen of de optimale tip grootte is bereikt door hoe gemakkelijk of moeilijk het is om vloeistof te trekken in het capillair. Als er extreme weerstand, de opening is waarschijnlijk te klein en de tip moet weer hoger zijn opgebroken. Als er weinig of geen weerstand, de opening is te groot en een nieuwe naald worden gebruikt. <ol><li> Plaats een tot twee druppels steriele L-15 media op het embryo. </li><li> Onmiddellijk plaats de elektroden aan weerszijden van het embryo, parallel aan de neurale buis, en pols 5 keer op 10-24 volt voor 50 mseconds tussenpozen van 1 seconde. U ziet belletjes de buurt van de elektroden of het werkt naar behoren. </li><li> Verwijder voorzichtig elektroden, 5 druppels L-15 terug te brengen op de top van de embryo&#39;s en verzegel het ei met tape. Zorg ervoor dat het ei goed wordt afgesloten, omdat het drogen is een belangrijke bijdrage aan embryo verlies na elektroporatie. </li><li> Plaats de eieren terug in de couveuse, venster naar boven, en incubeer tot ze de gewenste H &amp; H podium. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor neurale buis elektroporatie van HH10 kippenembryo&#39;s. Naast het tonen van de techniek, is richtlijnen voor de opslag en behandeling van eieren ook voorzien. Deze techniek heeft een breed scala van toepassingen voor genetische analyse, en het gemak en de lage kosten van experimenten maakt ze haalbaar is voor vele labs.

<table><tbody><tr><td>Incubator voor kippeneieren</td><td></td><td></td><td>bevochtigd, ingesteld op 37.80&amp;#x00B0;C (100F). </td></tr><tr><td>Pulsgenerator </td><td>Genetronics</td><td>BTX T820</td><td>Blokgolfgenerator of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Elektroden</td><td></td><td></td><td>onze elektroden waren gemaakt van platina draad met een diameter van 0.25 mm, waren 5 mm lang en met een tussenruimte van 1 mm geplaatst</td></tr><tr><td>Verbindingskabels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiescoop </td><td></td><td></td><td>met een grote werkafstand</td></tr><tr><td>Glazen capillairen </td><td></td><td></td><td>en capillairtrekker of commerciële glazen naalden</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kippeneieren</td><td></td><td></td><td>bevrucht</td></tr><tr><td>Gebogen schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuit van 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naald met groot lumen </td><td></td><td></td><td>16-18G</td></tr><tr><td>Mondpipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indische inkt </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinespuit/spuit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-DNA </td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l in steriele TE of 1X PBS met 0.05% Fast Green kleurstof</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporations van hh stage 10 kippenembryo&#39;s

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Groot formaat en externe ontwikkeling van het kippenembryo al lang het tot een waardevol hulpmiddel in de studie van de ontwikkelingsbiologie. Met de komst van moleculair biologische technieken, is het kuiken uitgegroeid tot een nuttig systeem om genregulatie en functie te bestuderen. Door electroporating DNA of RNA-constructen in de zich ontwikkelende kippenembryo, kunnen genen worden uitgedrukt of neergeslagen om te analyseren in vivo genfunctie. Op dezelfde manier kan reporter constructen gebruikt worden voor het lot in kaart brengen of naar vermeende gen-regulatorische elementen te onderzoeken. In vergelijking met soortgelijke experimenten in de muis, kuiken elektroporatie heeft als voordeel dat het snel, eenvoudig en goedkoop. Deze video toont eerst hoe een venster te maken in de eierschaal om het embryo te manipuleren. Vervolgens wordt het embryo wordt gevisualiseerd met een verdunde oplossing van Oost-Indische inkt ingespoten onder het embryo. Een glazen naald en pipet worden gebruikt om DNA en snel groen kleurstof te injecteren in de zich ontwikkelende neurale buis, dan platina elektroden worden parallel geplaatst om het embryo en korte elektrische pulsen worden toegediend met een pulsgenerator. Tot slot wordt het ei afgesloten met tape en teruggeplaatst in een incubator voor verdere ontwikkeling. Daarnaast is de video is te zien juiste ei opslag en handling en bespreekt mogelijke oorzaken van embryo verlies na elektroporatie.

Kuiken in ovo electroporatie is een techniek die genetische manipulatie van de aviaire embryo mogelijk maakt. Voorkomende toepassingen van deze techniek zijn functionele analyse van genen en vermeende enhancer elementen. Deze video toont neurale buis elektroporatie in HH 10 kippenembryo&#39;s. Injectietechniek en de juiste eierbehandeling worden besproken.

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo&#39;s

De grote omvang en de externe ontwikkeling van het kippenembryo maken het al lange tijd tot een waardevol instrument bij de studie van de ontwikkelingsbiologie. Met de komst van ...

Het kuiken is een goed modelsysteem omdat de embryo's zeer vatbaar zijn voor manipulatie en hun grote omvang ze bovendien veel gemakkelijker hanteerbaar maakt dan andere embryo's. Elektroporatie-experimenten bij kuikens maken het daarnaast mogelijk om in korte tijd een groot aantal genen te screenen. Hallo, ik ben Marissa Blank.Ik ben een promovendus in het laboratorium van Kathy Millon van de afdeling Menselijke Genetica aan de Universiteit van Chicago. Vandaag zal ik u uitleggen hoe u in ovo elektroporatie bij kippen uitvoert; we zullen Hamilton stage 10 kippenembryo's elektroporeren, wat overeenkomt met ongeveer twee dagen embryonale ontwikkeling bij de kip. Deze procedure wordt in ons lab routinematig uitgevoerd, waarbij we meestal het effect bestuderen van respectievelijk overexpressie of knockdown van genen in het ruggenmerg, omdat we geïnteresseerd zijn in genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel.De techniek die ik u vandaag zal tonen, in ovo elektroporatie, bestaat uit verschillende stappen. De eerste stap is het maken van een venster in het ei. De tweede stap is het daadwerkelijk injecteren van DNA in het lumen van de neurale buis.De derde

in-ovo-electroporations-of-hh-stage-10-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken...

Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Werkwijze voor genoverdracht in kippenembryo's bij later stadium incubatie (ouder dan Hamburger Hamilton fase (HH) 22) beschreven. Deze methode overwint...

Gentransfer in Oudere kippenembryo&#39;s door<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporatie

Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien...

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Het gehoororgaan is betrokken bij het gehoor. Hier presenteren we een aangepaste in ovo micro-elektroporatiemethode, geoptimaliseerd voor het bestuderen van de proliferatie en differentiatie van auditieve stamcellen in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip.

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Leer in ovo-elektroporatie van HH-stadium 10 kippenembryo's voor genetische manipulatie van de neurale buis. Deze methode maakt snelle screening van genen in ruggenmergontwikkeling mogelijk.

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo's

Meer video's verkennen