Dissection, de la culture, et de l'analyse des * These authors contributed equally

Neuroscience

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Summary

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

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McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

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Abstract

Le processus par lequel la région antérieure de la plaque neurale donne lieu à la rétine des vertébrés continue d'être une préoccupation majeure de la recherche clinique et fondamentale. En plus de la pertinence médical évident pour la compréhension et le traitement des maladies de la rétine, le développement de la rétine des vertébrés continue à servir de système modèle important pour la compréhension et élégant type cellulaire et la différenciation neuronale détermination 1-16. La rétine neurale comprend six types de cellules discrètes (ganglion, photorécepteurs amacrines, horizontal, les cellules bipolaires, et les cellules gliales de Müller) disposés en couches stéréotypés, un motif qui est largement conservée parmi tous les vertébrés 12,14-18.

Tout en étudiant la rétine de l'embryon intact le développement est clairement nécessaire pour comprendre comment cet organe complexe se développe à partir d'une saillie du cerveau antérieur dans une structure en couches, il ya beaucoup de questions qui profitent vientm employant des approches utilisant la culture cellulaire primaire de présumées cellules rétiniennes 7,19-23. Par exemple, en analysant les cellules de tissus prélevés et dissociés à des stades différents permet de discerner l'état de la spécification de cellules individuelles à différents stades de développement, qui est, le sort des cellules en l'absence d'interaction avec les tissus voisins 8,19-22 ,24-33. Culture de cellules primaires permet également au chercheur de traiter la culture avec des réactifs spécifiques et analyser les résultats au niveau unicellulaire 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un système modèle classique pour l'étude des le développement neural précoce 19,27,29,31-32,40-42, sert de système particulièrement adapté à la culture des cellules rétiniennes primaires 10,38,43-45.

Présomption de tissu rétinien est accessible dès les premiers stades de développement, immédiatement après l'induction neurale 25,38,43. En outre, étant donné eà chaque cellule de l'embryon contient une réserve de jaune d'œuf, les cellules rétiniennes peuvent être cultivées dans un milieu très simples définis constituées d'une solution saline tamponnée, éliminant ainsi les effets de confusion d'incubation ou d'autres sérums à base de produits 10,24,44-45 .

Cependant, l'isolement du tissu rétinien à partir des tissus environnants et le traitement subséquent est un défi. Ici, nous présentons une méthode pour la dissection et la dissociation des cellules de la rétine dans Xenopus laevis qui seront utilisés pour préparer des cultures de cellules primaires qui, à leur tour, être analysés pour l'activité de calcium et de l'expression des gènes à la résolution de cellules individuelles. Bien que le sujet présenté dans cet article est l'analyse des transitoires calciques spontanées, la technique est largement applicable à un large éventail de questions de recherche et des approches (Figure 1).

Protocol

Toutes les expériences sont réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation au College of William and Mary. Stades de développement mentionnés dans le présent protocole sont conformes à Nieuwkoop et Faber 46.

1. Dissection

  1. Laisser le milieu de culture cellulaire et de magnésium de calcium libre moyen (CMF) s'équilibrer à la température ambiante. Vous devrez également 0,1 X de Marc jour Ringer (ROR) pH 7,4-7,6.
  2. Stériliser les éléments suivants en appliquant une lumière UV pendant 30 min sous une hotte à flux laminaire de culture cellulaire. (Vaporisez chaque élément avec l'éthanol à 70% avant de les placer dans la hotte.)
    • 35 mm en plastique des boîtes de Pétri.
    • 60 mm en plastique des boîtes de Pétri.
    • 35 mm de surface Nunclon plats.
    • Tubes de 1,5 ml microtubes.
    • p1000 micropipette (1.000 micropipette ul).
    • Aérosol résistants P1000 conseils (1.000 pi conseils aérosols micropipette résistants).
    • Alcoolstylo résistant.
    • Dissection fine pince.
    • * 15 ml tubes coniques (uniquement pour l'activité de calcium imagerie).
    • * Uniquement pour l'imagerie de l'activité de calcium.
  3. Une fois que le capot a été stérilisée aux UV et des solutions ont amenés à température ambiante, mettez le flux d'air laminaire dans la hotte, arroser des gants et des bouteilles médias avec de l'éthanol à 70% et des médias lieu bouteilles dans la hotte.
  4. Intérieur de la hotte préparer la suivante avec une micropipette p1000 pour chaque plaque de cellules, assurant un étiquetage approprié.
    • Un plat de 60 mm de Petri en plastique contenant 10 ml milieu de culture cellulaire - Plaque de dissection.
    • Une boîte de 35 mm de surface Nunclon contenant 2 ml milieu de culture cellulaire - Plaque de culture. (Vaisselle en plastique ne sont pas encore Nunclon traités avec des colles.)
    • Un vide 1,5 ml microcentrifugeuse tube Tube explantation de dissociation.
    • * Un faucon conique de 15 mlle tube contenant 15 ml milieu de culture cellulaire. Pour laver l'excès Fluo4-AM lorsque l'activité de calcium imagerie.
  5. Intérieur de la hotte, préparer la suivante avec une micropipette p1000 pour chaque séance de dissection (plus d'une rétine peut être disséqué en une seule séance).
    • Un plastique 35 mm boîte de Pétri contenant 2 ml CMF - Rincer la plaque explantation.
    • Un plastique 35 mm boîte de Pétri contenant 2 ml CMF - explantation dissociation plaque.
  6. Extérieur de la hotte préparer ce qui suit:
    • Un plat de 60 mm de Petri en plastique pour plaque de cellules contenant 10 ml de 0,1 X MMR - plaque de maintien.
    • Un plat de 60 mm de Petri en plastique pour plaque de cellules contenant 10 ml de 0,1 X MMR - Plaque frères et sœurs.
    • Un plastique 60 mm boîte de Petri par séance de dissection contenant 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (tricaïne) - Plaque Anesthésie.
  7. plaque explantation de dissociation (se traduisant par une solution de trypsine 0,1%), agiter pour mélanger et mettre de côté.
  8. Si la dissection d'un embryon qui est plus jeune que le stade 30, ajouter 10 mg collagénase B à la plaque de dissection (résultant en une solution à 1 mg / ml de collagénase B), agiter pour dissoudre et mettre de côté.
  9. Sélectionnez un embryon de la scène désirée, transfert à la plaque de maintien avec une pipette de transfert non stérile et retirer la membrane vitelline (si l'embryon n'a pas encore éclos) à l'aide de pinces fines.
  10. Transfert à l'identique plusieurs embryons mis en scène à la plaque de frères et soeurs avec une pipette de transfert non stérile.
  11. Si l'embryon est l'étape 25 ou plus tôt, passez directement à la dissection, autrement transférer l'embryon à la plaque Anesthésie aide d'une pipette de transfert non-stérile et laisser la reposer jusqu'à ce que l'embryon de mouvement et réponse à des stimuli cesse. Cela pourrait prendrejusqu'à une minute.
  12. Procéder à la dissection (figure 2) sous un microscope à dissection (objectif 4X, oculaire 10X).

Pour l'étape embryons 25 ans ou moins:

  1. Transfert d'embryon à la plaque de dissection avec une pipette de transfert non stérile.
  2. L'utilisation de deux paires de pinces fines, faire une coupe sagittale médiane sur la face ventrale de l'embryon, en commençant à l'extrémité postérieure et tout au long de la glande de ciment dans la partie antérieure de l'embryon.
  3. Soigneusement ouvrir l'embryon en saisissant un des bords de la découpe et d'étalement de gauche et de droite. Il en résulte un embryon avec la face dorsale de la plaque de parement en dissection, et avec l'ectoderme ventral écartées pour révéler l'endoderme et du mésoderme intérieur.
  4. Commencez à retirer l'endoderme et le mésoderme (figure 2A et 2B). La première couche et la plus importante de ce tissu est très "moelleux" en apparence avecgrandes cellules et peu d'organisation évidente.
  5. Après avoir retiré cette couche, la notochorde et les somites deviennent visibles. Pour un meilleur contraste, déplacez l'embryon à un séparé 60 mm boîte de Petri en plastique contenant 10 ml milieu de culture cellulaire et 100 pi de solution à 1% de bleu du Nil Sulfate (dans l'eau) pendant 2-3 min avant de les transférer vers la plaque de dissection. Cette tache l'ectoderme, somites, et notochorde pour faciliter l'identification et l'orientation.
  6. En se concentrant sur ​​la partie antérieure de l'embryon, retirez soigneusement la notochorde et tout en restant mésoderme exposer le cerveau et les vésicules optiques (figure 2C).
  7. Une fois le cerveau et les vésicules optiques sont entièrement exposées, utilisez la pince pour couper le tube neural et l'ectoderme sous-jacente juste derrière le cerveau.
  8. Mettez cette partie (le cerveau et les vésicules optiques) de telle sorte que plus l'ectoderme est sur le dessus.
  9. Prendre soin de ne pas endommager les vésicules optiques sous-jacentes, soigneusement redéplacer l'ectoderme (figure 2D).
  10. Enfin, en utilisant une pince, séparer les vésicules optiques du cerveau (figure 2D et 2E).

Pour les embryons de plus que l'étape 25:

  1. Alors que l'embryon se trouve dans la plaque Anesthésie, enlever la partie ventrale de l'embryon avec une pince.
  2. Pour un meilleur contraste, déplacez l'embryon à une boîte de Pétri de 60 mm en plastique contenant 10 ml 0,1 X MMR et 100 pi de 1% du Nil Bleu Sulfate pendant 2-3 min avant de les transférer sur la plaque de dissection. Cette tache le bleu ectoderme.
  3. Une fois dans la plaque de dissection, tirez l'ectoderme recouvrant la rétine (ou vésicule optique pour la scène embryons 26-30) (figure 2F et 2G). Si Nil Bleu Sulfate a été utilisé, l'ectoderme seront colorés en bleu, mais le tissu sous-rétinienne ne sera pas.
  4. Retirer la rétine ou vésicule optique soigneusement avec forceps (figure 2H, 2I, 2J et). Il est utile de tenir l'embryon en place avec une paire de pinces et enlever la vésicule optique rétine ou de l'autre.

2. La dissociation des tissus et des cellules Placage

Remarque importante - Lors du transfert de tissus, ne permettent pas la rétine ou vésicule optique de toucher les limites de l'air-liquide, si cela survient, les cellules se lysent.

  1. Une fois la vésicule optique ou de la rétine a été disséqué, transférez à l'explantation Rincer la plaque avec une micropipette P100 à l'aide d'aérosols conseils résistants et laisser reposer pendant 30 sec.
  2. Transfert 80 ul de trypsine 0,1% au FCM de la plaque explantation de dissociation du métro explantation de dissociation.
  3. Avec une micropipette P100 et aérosols conseils résistants, transférer la rétine ou de la vésicule optique explantation Rincer la plaque à l'explantation Dissociatisur le tube, en évitant le transfert des explants solution de rinçage.
  4. Laissez le tissu de dissocier dans le tube explantation de dissociation pendant 1 heure à température ambiante. Une rétine a été utilisé par plaque, toutefois, on note qu'il est possible d'utiliser plus d'une plaque par l'affirmative souhaite augmenter le nombre de cellules par plaque.
  5. Pour plaque de cellules, d'abord lentement retirer 40 ul de la solution du tube explantation de dissociation et jeter l'aide d'une micropipette P100 et aérosols conseils résistants. L'utilisation d'un ensemble p100 à 40 pi et aérosols conseils résistants, transférer les cellules (maintenant que le tissu a dissocié) à la plaque de culture. Lors de l'aspiration des cellules sur la plaque, introduire à la pipette lentement et maintenir les cellules dans une petite zone au centre de la plaque.

Remarque: Si plusieurs images de cellules sont à prendre tout au long de l'expérience, fixer une grille (Cellattice) à la face inférieure de la plaque de culture

  1. Laisser les cellules tranquille pendant au moins 1 heure à adhérer à la plaque Nunclon. Passé ce délai, elles doivent être traitées avec beaucoup de douceur ou ils pourraient se détacher.
  2. Des cellules de culture à l'étape voulue en observant les embryons jumelles, qui sont élevés à la même température que les cellules. Si les cellules vivantes ne sont pas utilisés pour une manipulation supplémentaire, ils peuvent être fixés dans une solution MEMFA en ce moment.

Remarque importante: La plupart de nos expériences sont fixés dans 6 heures du étalement des cellules. La longévité des cellules en culture dépend de l'étape à laquelle le tissu a été disséquée et la quantité de jaune encore présent dans les cellules, les cellules disséqués à partir de cadet (stades neurula) rester en bonne santé en culture pendant 5-6 jours tandis que les cellules acquis de âgées embryons (nage des têtardsétapes) resteront viables en culture pendant 2-3 jours.

3. 47-49 imagerie calcique

Ce protocole utilise sensible au calcium microscopie Fluo4-AM et confocale à quantifier les transitoires de calcium dans des cellules individuelles. Toutes les étapes en utilisant Fluo4-AM doit être effectuée loin de la lumière, comme Fluo4-AM est sensible à la lumière. Tous les lavages doivent être ajoutés ou supprimés à l'aide d'une micropipette P1000 et aérosol-résistant conseils. Pipetage doit être effectuée lentement et en direction du bord de la plaque pour éviter de perturber les cellules. Le support n'est pas changé parce que les cultures sont généralement fixés dans les 6 heures de cours de dissection. À plus long terme des cultures, les médias devraient être changés tous les jours.

  1. Fluo4-AM est stocké à -20 ° C, et nous vous suggérons de stockage en 5 aliquotes. Avant utilisation, décongeler une partie aliquote de 5 ul de Fluo4-AM abri de la lumière et ajouter 2 pi de Pluronic F-127 directement à cette aliquote.
  2. Après culture des cellules pendant la durée souhaitée (au moins1 h), supprimer 1 ml du milieu de culture de cellules à partir de la plaque de culture. Ajouter à la Fluo4-AM et Pluronic, mélanger par pipetage doux.
  3. Lentement transférer l'intégralité de cette solution vers le bord de la plaque de culture de cellules à imager et laisser les cellules de cette solution au repos pendant 1 h à absorber la Fluo4-AM.
  4. Pour laver l'excès Fluo4-AM du milieu de culture cellulaire, compléter la série de lavage suivante:
    • Retirer 1 ml de milieu de la plaque.
    • Ajouter 3 ml de milieu de culture de cellules fraîches (à partir de 15 ml du tube conique) de la plaque.
    • Effectuer deux lavages supplémentaires, à chaque fois lentement enlever 3 ml d'une solution à partir de la plaque et en ajoutant 3 ml de milieu de culture de cellules fraîches.
  5. Les cellules doivent maintenant être dans 4 ml de milieu de culture cellulaire et contiennent Fluo4-AM. Fluo4-AM est clivé par voie enzymatique fois à l'intérieur de la cellule, l'empêchant de sortir de diffusion de la cellule ou dans les compartiments membranaires liées. Avant de charger la plaque sur la scène du microscope confocal pour l'imagerie, tracez une ligne verticale rouge avec un marqueur permanent sur le plat tout en gardant le couvercle pour empêcher les particules de marquage de contaminer la culture. La ligne verticale est tirée vers le bas du côté de la boîte de Pétri (la base de la boîte de Petri, et non le couvercle). Son but est de déterminer l'orientation de la plaque de culture en ce qui concerne le champ de vision afin que l'orientation et un alignement précis des cellules individuelles peut être rétablie à un stade ultérieur.
  6. La plaque est maintenant prêt pour le chargement sur la platine du microscope confocal pour l'imagerie. Visualisez les cellules en utilisant les réglages du champ lumineux sur un microscope confocal à balayage laser (objectif 20X). Trouvez une zone de cellules denses qui ne contient pas de grumeaux, de préférence avec un champ de vision qui contient les numéros de la grille importants sur la lamelle Cellatice pour faire trouver le même champ de vue plus facile plus tard, quand l'imagerie de la culture après en sihybridation tu. Avant l'imagerie, concentrer vers le bas à travers la culture et à prendre une image de champ lumineux de la grille au-dessous des cellules de suivre la position et l'orientation de la culture cellulaire. Ceci permet de réalignement des cellules pour analyse ultérieure.
  7. Soulevez le plan focal et capturer une image en champ clair des cellules avant l'imagerie calcique commence (figure 3A).
  8. Une fois que le plan médian des cellules est mise au point, la plaque est prête pour l'imagerie de l'activité de calcium. Paramètres varie en fonction de la demande et le microscope. Nous imager les cellules à l'aide d'un laser Argon nm 488 pour 1, 2 ou 12 h avec les paramètres suivants:
    • 1 images h:
      • Laser Argon 488 nm numérise à 4% de sa puissance maximale sur 30 mW.
      • Numériser une fois toutes les 4 secondes (900 balayages par heure).
    • 2 images h:
      • Laser Argon 488 nm numérise à 4% de sa puissance maximale sur 30 mW.
      • Numériser une fois tous les8 sec (450 balayages par heure).
    • 12 images h:
      • Laser Argon 488 nm numérise à 2% de sa puissance maximale sur 30 mW.
      • Numériser une fois toutes les secondes 48 (75 balayages par heure).

Ces paramètres se traduira par un ensemble de 900 images image fixe pour chaque période. Activité de calcium peut être enregistrée en analysant les niveaux de fluorescence sur les images cours du temps (figure 3B) avec l'utilisation d'une application de traitement d'image tel que ImageJ 50.

4. Fixation des cellules

  1. Suite à l'imagerie, les cellules peuvent être fixées pendant 30 minutes en éliminant 3 ml d'une solution à partir de la plaque et en ajoutant 1 ml de 2X MEMFA le reste de 1 ml de milieu de culture.
  2. Après fixation, retirez MEMFA et déshydrater les cellules avec une série de 5 lavages min, chacune d'un volume de 1 ml:
    • 25% d'éthanol dans 1X tampon phosphate salin (PBS).
    • 50% d'éthanol dans du PBS 1X.
    • <éthanol li> 75% en sdd H 2 O (eau stérile distillée désionisée).
    • Remplacer le dernier lavage avec 1 ml d'éthanol à 100% et la plaque de conserver à -20 ° C.

Remarque: Le méthanol peut aussi être utilisé pour les nettoyages et pour le stockage.

5. Hybridation fluorescente in situ (FISH)

Les cultures peuvent être déterminés en utilisant le protocole standard pour Xenopus FISH comme décrit 51 avec des modifications pour la culture cellulaire tel que décrit par le laboratoire Anderson 52. Les modifications apportées au protocole d'Anderson Lab sont énumérés ci-dessous. Tous les lavages sont effectués sur les 35 plaques Nunclon mm en volumes d'environ 1 ml, sauf indication contraire. Les solutions sont tels que définis dans Sive et al. 53, à moins d'indication contraire.

Important: Ne pas utiliser marqué à la fluorescéine sondes d'ARN lors de l'exécution d'hybridation in situ sur des cellules imagées pouractivité de calcium. Anticorps anti-fluorescéine se lie à Fluo4-AM résiduelle dans les cellules et provoquer un signal positif dans toutes les cellules dans la culture.

Jour 1: perméabilisation et hybridation

  1. Lavages de réhydratation doivent être classés au solvant de déshydratation utilisé pour le stockage. Pour nos expériences, lavages à l'éthanol ont été classés dans du PBS 1X.
  2. Après réhydratation, laver les cellules trois fois supplémentaires dans du PBS 1X pendant 5 min chacune à la température ambiante.
  3. Mélanger 25 ml de 0,1 M de triéthanolamine (pH 8,0) avec 62,5 ul d'anhydride acétique dans un tube Falcon et mélanger rapidement jusqu'à dispersion complète comme indiqué dans le protocole Anderson Lab 52. Incuber les cultures dans ce mélange pendant 10 min à température ambiante. Après le traitement d'anhydride acétique, laver les cellules dans du citrate de sodium 1X saline (SSC) pendant 5 min à température ambiante.
  4. Enlever le dernier lavage SSC et le remplacer par HCl 0,2 M (en sdd H 2 O) pendant 10 min à perméabiliser les cellules. </ Li>
  5. Laver HCl avec deux lavages dans du PBS 1X pendant 5 min.
  6. Prehybridize dans le tampon ISH à 60 ° C dans un bain-marie à agitation pendant un minimum de 6 heures, mais ne prehybridize nuit car cela diminue fortement du signal.
  7. Hybrider une nuit à 60 ° C pendant 8-14 h à 750 pl de sonde dilué (1:250 dilution à partir d'une sonde purifiée). La sonde purifiée gammes de concentration de 1,0 à 1,5 pg / pl.

Jour 2: Retrait de la sonde non liée et incubation d'anticorps

  1. Retirer la sonde et rincer les cultures pendant 5 min dans 0,2 x SSC à 60 ° C. Laver en eau douce 0,2 X SSC pendant 1 heure à 60 ° C.
  2. Retirez les cultures du bain d'eau et de leur permettre de s'adapter à la température ambiante pendant 5 min.
  3. Rincer à 0,2 X SSC à température ambiante pendant 5 min.
  4. Laver pendant 15 minutes dans du PBS 1X avec 0,1% de Triton-X-100 (PBT).
  5. Pour inactiver les peroxydases endogènes, se laver pendant 1 heure dans un 2% de H 2 O 2 en PBT.
  6. Bloquer dans le réactif de blocage de 2% dans un tampon acide maléique (MAB) pendant 1 heure à température ambiante. Nous avons trouvé que cette méthode de blocage augmente la sensibilité par rapport aux méthodes antérieures de blocage dans 20% de sérum de mouton en PBT.
  7. Incuber les cultures dans 1 ml de réactif 2% Blocage du MAB contenant une dilution 1:1000 d'un anticorps conjugué à POD nuit à 4 ° C.

Jour 3: Suppression des anticorps non lié et le développement de fluorescence

  1. Retirez solution d'anticorps et rincer 3 fois dans du TBST pendant 5 min à température ambiante.
  2. Laver 4 fois dans TBST pendant 15 min à température ambiante tout en continuant à balancer à une vitesse lente.
  3. Laver deux fois en PBT à température ambiante pendant 10 min.
  4. Appliquer 750 ul de 1:200 à la fluorescéine tyramide ou 1:25 Cy3 tyramide dilué dans du PBT. Incuber pendant 5 min à température ambiante et ajouter 2,5 ul de 0,3% H 2 2. Rock pendant 40 min pour permettre de signal pour se développer.
  5. Laver au moins 4 fois pendant 15 minutes dans chaque TBST à température ambiante avec basculement.
  6. Une fois que le signal a pleinement développé, se laver pendant 5 min dans 1X PBT.
  7. Fixez-le dans 1X MEMFA pendant 1 heure à température ambiante et conserver dans du PBS 1X à 4 ° C.

6. Résultats POISSONS image et co-enregistrer les données d'imagerie de calcium

  1. À la fin de la FISH, plaques de culture cellulaire sont imagés pour déterminer les cellules d'afficher un signal positif de fluorescence pour une sonde donnée. Utiliser la lamelle Cellattice pour trouver le champ de vision exacte étudié au cours de l'imagerie de calcium et d'aligner la plaque de l'orientation des trames d'image de calcium.
  2. Focus sur le plan médian de cellules et de prendre une seule image haute résolution en utilisant le laser hélium-néon nm HeNe 543, 15% de son maximum de puissance 1 mW (figure 3C).
  3. Dans le cadre d'origine 900 une série d'images prises à partir du protocole d'imagerie calcique,identifier les cellules individuelles en tant que régions d'intérêt (ROI) grâce à l'utilisation d'un programme de traitement d'image (par exemple ImageJ 50). Extraire des données de retour sur investissement de fluorescence comme un ensemble de points de données représentant des valeurs de paires de temps de fluorescence (Figure 4).
  4. Superposer l'image FISH résultats avec le ROI identifiés à partir des images de calcium (figure 3D).
  5. Enregistrez chaque ROI comme positif pour la sonde, la sonde négative ou inconnue - dans le cas où la cellule correspondant à la ROI ne peut plus être trouvée dans le champ de vision de l'image FISH.
  6. Processus ROI données de fluorescence en utilisant des scripts d'analyse statistique (tel qu'il est conçu par MATLAB ou autre langage de programmation) afin de comparer les niveaux d'activité de calcium entre les différents stades disséqués (figure 5A et 5C) ou de cellules positives pour les sondes FISH différents (figure 5B et 5D). Tous les scripts utilisés dans notre laboratoire sont disponibles gratuitement sur demande.

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Representative Results

Des exemples de succès disséqués vésicules optiques (étape 25) et la rétine (stade 35) sont présentés dans les figures 2E et 2J. Bien que ce protocole peut être utilisé à différents stades de développement, il est essentiel d'obtenir que le tissu rétinien pour assurer l'exactitude pour d'autres expériences. Retirez délicatement l'épiderme à tous les stades et s'assurer que vos pinces à ne pas percer le tissu rétinien. Dans l'étape 35 ans ou plus, la lentille peut être considérée comme une couche transparente sur le dessus de la rétine et peut être enlevé par grattage prudent en utilisant une pince.

Une culture de cellules avec succès plaqué primaire est montré sur la figure 3A. Lorsque la dissociation des tissus, il est important de ne pas laisser l'explant rétinienne dans la solution de rinçage pour plus longtemps que le temps d'incubation recommandée de 30 sec pour empêcher le tissu de dissocier dans la solution de rinçage. En outre, assurez-vous que le tissu est autorisé à dissocier dans la solution de trypsine pendant une heure(Âgés embryonnaire et les stades larvaires peuvent nécessiter même plus) pour permettre une répartition homogène des cellules dans la plaque de culture. Une fois que les cellules sont plaquées, faire preuve de prudence lors du déplacement de la plaque et l'évolution des solutions pour éviter de laver les cellules de la plaque.

Les figures 3B et 3C montrent des images de balayage activité de calcium et des expériences d'hybridation fluorescente in situ (FISH), respectivement. Les cellules qui apparaissent vert clair dans l'image de calcium sont des cellules qui subissent un pic transitoire du taux de calcium intracellulaire à la suite de la libération des réserves de calcium internes. Les cellules peuvent ensuite être analysées pour l'expression des gènes en utilisant FISH et profils d'expression génique peut être corrélée à des modèles d'activité de calcium dopage en superposant les images (figure 3D). En utilisant une combinaison de Python et Matlab son exécution (disponible gratuitement sur demande), les données sont obtenues par l'analyse de l'activité de fluorescence de chaque indirégion d'Al d'intérêt (ROI) dans le cours de l'imagerie. Un exemple de l'activité de calcium pour une cellule individuelle (ROI) en 1 h de l'imagerie est illustré à la figure 4, un pic est visible à environ 57 min de l'imagerie. Dans le tableau 1, les données représentatives pour le pourcentage de cellules positives pour différentes sondes sont affichées, alors qu'il n'existe pas de données spécifiques à cette expérience rapportée dans la littérature (le point de nos expériences en cours est de déterminer ces pourcentages), nos résultats sont cohérents avec données de types similaires d'expériences relatives à l'activité de calcium dans la moelle épinière 17,55,56.

Paramètres utilisés pour l'analyse incluent le nombre, la fréquence et l'amplitude des pics. Figure 5 fournit des résultats représentatifs de l'imagerie calcique et expériences FISH dans des cellules embryonnaires de la rétine au moyen de sondes pour xVglut1, Ptf1a et xGAD67. En utilisant MATLAB son exécution, le nombre de pointes pour each ROI est déterminé et le nombre de pointes est en moyenne pour toutes les ROI dans l'expérience. Le nombre moyen de pics de chaque expérience peut ensuite être compilé avec d'autres expériences, d'où la moyenne d'un groupe d'expériences. Parcelles de distribution cumulative peut être créé pour afficher la répartition du nombre moyen de pointes pour toutes les expériences au sein d'un groupe. Scripts MATLAB sont ensuite utilisés pour l'analyse statistique des données.

La figure 5 montre des données représentatives suite à l'analyse MATLAB. En bref, nos résultats montrent que l'activité de calcium est régulée par le développement, avec un pic de dopage au stade 35 (p <0,002) (figures 5A et 5C). En termes de corrélation avec l'activité calcique des cellules positives pour une sonde spécifique, alors il n'y avait pas de différences statistiquement significatives, mais il y avait une tendance (p = 0,08) pour les cellules positives pour xGAD67 (un marqueur de cellules différenciées GABAergiques) pour afficher HIGHE r niveaux d'activité de calcium de dopage que les cellules positives pour un marqueur ou pour Ptf1a glutamatergique, un gène codant pour un facteur de transcription du gène corrélé avec le phénotype GABAeric promotion. Bien que préliminaires, ces données suggèrent qu'il peut y avoir des cellules GABAergiques, qui se développent d'une manière indépendante de Ptf1a ou cette spécification neurotransmetteur dépendante de l'activité n'agit pas au niveau de Ptf1a.

Figure 1
Figure 1. Schématique de la procédure. Une fois le tissu rétinien est disséqué et dissocié, culture de cellules primaires peut être utilisé pour une grande variété d'applications.

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Figure 2. Photos de dissection. Embryons ont été colorées en bleu du Nil Sulfate de contraste accru. AE: Étape 24. FJ: Étape 35. Abréviations:. Ov, vésicule optique; fb, le prosencéphale, sc, la moelle épinière; moi, mésoderme, de même, somites; glande ciment cg,;; chier, lentille re, la rétine, l'épithélium; ep Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Images de culture cellulaire avec ROI encerclé. A. Fond clair. Image B. suite Fluo-4 (AM) à un traitement ROI encerclé. L'image FISH C (les flèches indiquent des exemples de cellules positives pour la sous-unité alpha du canal calcique voltage gated Cav2.1). D. Superposition du champ lumineux, Fluo-4 et images FISH.

7/4377fig4.jpg "alt =" Figure 4 "fo: content-width =" 3.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
Figure 4. Exemple d'activité de calcium pour une seule cellule (ROI). Représentation graphique de la fluorescence (en unités relatives de fluorescence, rfu) en fonction du temps (en minutes) d'une image Fluo4 de calcium par fluorescence.

Figure 5
Figure 5. Affichage des résultats dopage de calcium par étape et la sonde. A. Nombre moyen de pointes de calcium à des stades 30 (n = 4), 35 (n = 8), et 38 (n = 13). B. Nombre moyen de pointes de calcium par culture chez les différentes sondes utilisées pour l'hybridation in situ à l'étage 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), et Ptf1a (n = 4). Parcelle C. Répartition cumulative du nombre moyen de crampons par la culture à des étapes 30, 35, 38. D. cumulatif DISTRIBUTIONle tracé du nombre moyen de crampons par culture de cellules identifiées comme présentant un signal positif pour l'hybridation in situ des sondes au stade 35;. xVglut1, xGAD67 et Ptf1a Cliquez ici pour agrandir la figure .

Sonde Étape n (plaques) n (cellules) Positif pour cent
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
Ptf1a 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

Les cellules du tableau 1 pour cent. Positifs.

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Discussion

Avec ses types cellulaires bien caractérisées qui sont conservées dans tous les vertébrés, la rétine fournit un modèle utile pour l'étude des processus cellulaires qui régissent moléculaire spécification du type cellulaire et la différenciation. Culture de cellules primaires donne une puissante méthode pour étudier un grand nombre de processus, y compris l'expression des gènes, la dynamique des protéines et du calcium et de l'activité électrique au niveau de la résolution cellule unique. Nous présentons ici une technique simple pour la culture de cellules primaires à partir disséqué le tissu rétinien présomptif Xenopus laevis, un organisme prête particulièrement bien à de telles études étant donné que la rétine présomptif est facilement accessible depuis les tout premiers stades de développement et que la culture de cellules primaires peut se produire dans un milieux définis constitués d'une simple solution saline.

Bien que facilement adaptable à la plupart des paramètres de laboratoire, il ya plusieurs étapes qui nécessitent une attention particulière. Dissections doivent être effectuées avec une pince fraîchement aiguisées. Jeunes stades (<r. 30) bénéficient d'un traitement avec de la collagénase B mélangé avec le milieu de culture cellulaire. Toutes les étapes impliquant le transfert de tissus ou de cellules provenant d'un média à un autre doit être effectuée avec un soin particulier pour empêcher le tissu ou les cellules d'entrer en proximité de l'interface air-solution. La pipette contenant le tissu doit être entièrement immergée dans beaucoup de liquide et les cellules ou le tissu expulsé très lentement. Après que les cellules ont été plaquées, tous les transferts de fluides, y compris, Fluo4-AM outre, et milieu de culture cellulaire, ou lavages de fixation, doit être exécuté avec soin, étant donné que les cellules peuvent être facilement délogés. Comme avec toute la culture cellulaire, la stérilité est à craindre, si les soins doivent être prises pour stériliser tous les matériaux. Enfin, laisser les explants rétiniens dissociées reposer pendant les délais prévus dans le milieu de dissociation est essentielle pour la fixation des cellules de succès et d'éviter les grumeaux.

Au cours dela condition dissection et la culture décrite dans ce protocole, les deux nécrose et l'apoptose sont très limitées (moins de 5-10% des cellules). La perte de cellules sur la plaque (apoptose) est rarement remarqué au cours de pré-et post séances d'imagerie confocale. Gestion des cultures cellulaires avec soin est la clé de la viabilité cellulaire. Solution changements doivent être effectués très lentement et régulièrement pour empêcher la nécrose cellulaire et l'apoptose. Bien que les expériences pour délimiter le rapport précise des types de cellules rétiniennes sont actuellement en cours, nous notons qu'une variété de types de cellules rétiniennes semblent être représentés dans les cultures et que les cellules gliales de Müller (qui ont une morphologie distincte) ne sont pas dominants dans les cultures .

Un problème potentiel lors de l'analyse des plaques après des expériences d'hybridation in situ, c'est que certaines des cellules peuvent avoir déménagé, mais cela peut être adressée à l'utilisation de programmes de suivi cellulaires. En outre, inhérente à la technique de culture cellulaire primaire, une limitation majeure est ee perte évidente d'un motif spatial qui est présent dans le tissu intact. L'identité de chaque cellule doit être établie en utilisant des analyses moléculaires plutôt que par la position dans le tissu. Toutefois, cette fonctionnalité fournit également l'occasion d'analyser l'état de la spécification des cellules très précisément et en l'absence de la poursuite des interactions cellule-cellule. Il permet également au chercheur de traiter sélectivement les cellules présentant des facteurs de croissance ou d'autres composés et analyser précisément les effets sans l'influence des signaux provenant des cellules voisines. Bien que nous ayons utilisé cette dissection de la rétine et primaires technique de culture cellulaire pour mettre en corrélation avec l'imagerie calcique marqueurs spécifiques du phénotype de neurotransmetteur, cette technique est adaptable à un large éventail d'autres applications en aval, y compris des enregistrements électrophysiologiques et simples analyses d'expression génique de cellules par RT-PCR ou «prochaine -gen "analyse du transcriptome (figure 1).

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous remercions gracieusement le Dr John Hayes pour son exécution; Drs. Eric Bradley et Christopher Del Negro à l'aide de la microscopie confocale, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garofalo, Rebecca Lowden, et Liz MacMurray pour leur travail dans le développement du projet et de fournir des données préliminaires, le Dr Greg Smith pour leurs suggestions utiles pour l'analyse statistique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (NINDS IR15N5067566-01) à la norme MSS et du Howard Hughes Medical Institute Science Education Subvention au Collège de William et Mary.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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