Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een techniek gebruik te maken van hoge resolutie intavital 2-foton microscopie om direct te visualiseren en te kwantificeren gloemrular filtratie in oppervlaktewater glomeruli. Deze methode maakt het mogelijk voor de directe bepaling van de permeabiliteit eigenschappen van macromoleculen in zowel normale en zieke staten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nierziekten waarbij urine verlies van grote essentiële macromoleculen, zoals serumalbumine, hebben lange tijd gedacht te worden veroorzaakt door veranderingen in de permeabiliteit barrière bestaat uit podocytes, vasculaire endotheliale cellen, en een basaal membraan werken in koor. Gegevens van ons laboratorium met behulp intravitale 2-foton microscopie toonde een meer doorlaatbaar glomerulaire filtratie barrière (GFB) dan voorheen onder fysiologische omstandigheden gedacht, met het ophalen van gefilterde albumine die zich in een vroeg subset van cellen genoemd proximale tubulus cellen (PTC) 1,2, 3.

Vorige technieken om renale filtratie bestuderen en de vaststelling van de kenmerken van filtratie barrière betrokken micropuncture het lumen van deze vroege buisvormige segmenten bemonstering van de vloeistofinhoud en analyse 4. In deze onderzoeken albumine in de luminale vloeistof nagenoeg onbestaande, die nauw aansluitenwelke normaal in de urine. Echter, karakterisering van dextranpolymeren met gedefinieerde afmetingen van deze techniek bleek die van een soortgelijk formaat serumalbumine hadden hogere niveaus in het tubulaire lumen en urine; suggereert verhoogde doorlaatbaarheid 5.

Hierin is een gedetailleerd overzicht van de gebruikte techniek om direct te visualiseren en te kwantificeren glomerulaire fluorescerende albumine permeabiliteit in vivo. Deze methode maakt het mogelijk voor de detectie van gefilterde albumine in de filtratie barrière in Bowman's ruimte (de eerste kamer van urine-filtratie), en maakt het ook mogelijk kwantificering van albumine reabsorptie door de proximale tubuli en visualisatie van de daaropvolgende albumine transcytose 6. Het ontbreken van fluorescentie albumine later langs buisvormige segmenten op weg naar de blaas benadrukt de efficiëntie van het ophalen pathway in het oudere proximale tubulus segmenten. Bovendien, wanneer deze techniek werd toegepast op doorlatendheiddextranen met een vergelijkbare grootte aan albumine vrijwel identiek permeabiliteit gemeld 2. Deze waarnemingen direct ondersteunen de noodzaak om de focus van veel proteïnurie nierziekten te breiden naar opgenomen veranderingen in proximale tubulus cel regeneratie.

Protocol

1. Vervoeging van Rat serum albumine te Sulfo-Rhodamine 101 sulfonylchloride (Texas Red)

  1. Los 100 mg Rat Serum Albumine (RSA) in 6,667 ml van 100 mM natriumbicarbonaat pH 9,0, uiteindelijke concentratie 15 mg / ml in een 50 ml conische buis.
  2. Plaats oplossing in ijs / water bekerglas en koel tot tussen 0 en 4 ° C.
  3. Voeg 200 ul van hoge kwaliteit watervrij Dimethylformamide (DMF) naar een 10 mg flacon van Texas Red sulfonylchloride (TRSC); vortex op medium voor 15 sec.
  4. Vortex RSA-oplossing op middellange en voeg de opgeloste TRSC.
  5. Wrap 50 ml conische in folie (Parafilm kan gebruikt worden om een ​​goede afdichting te verzekeren wordt gevormd), plaats horizontaal / ice alleen en plaats op rocker om oplossing langzaam te ageren (vorming van luchtbellen te vermijden) in ijsemmer, laat reactie om verder te gaan op 0 tot 4 ° C gedurende 1 uur.
  6. Maak 5 L van 0,9% zoutoplossing, en bevochtig een 50 kDa moleculair gewicht afgesneden kamer die ofwel a) dialyse-membraan met clips kunnen worden, b) diANALYSE buis als in een float-a-Lyzer, of c) slide-a-Lyzer cassette (alle geschikt voor het verwijderen ongeconjugeerde TRSC).
  7. Plaats reactiemengsel in de dialyse kamer en in de container 5 L w / de 0,9% zoutoplossing, dialyseren overnacht bij 4 ° C met voorzichtig roeren met een roerstaaf.
  8. Wijzig de 5 L dialyseoplossing in de ochtend en in de late namiddag tot een overnacht incubatie resulteert in vrijwel geen kleurverandering (Dit duurt gewoonlijk ~ 48 uur met minimaal 4 uitwisselingen). Bovendien bestaat met MWCO van 50 kDa zo dicht bij het MW van RSA, 66kDa, kan men nooit een heldere oplossing, dit afhankelijk van de verdeling van de poriegrootte van het membraan zijn, 60 uur en 5 uitwisselingen meer dan voldoende tijd.
  9. Volume meten en verdeel het aanvankelijke gewicht van 100 mg van de volume concentratie van TR-RSA approximate geven, meestal concentraties bereik 10-13 mg / ml. De uiteindelijke kleurstof: albumine verhouding moet ~ 04:01, 1 fluorophore per 15,00 zijn0 Daltons van eiwit MW. Bewaren bij 4 ° C; NOOIT FREEZE de TR-RSA-oplossing, als gevolg fragmentatie die zich kunnen voordoen zal permeabiliteit waarden veranderen.

2. Voorbereiden van de Omgekeerde Microscoop Stage for Imaging / Microscoop Instellingen

  1. Plaats ~ 4-7 stukken autoclaaf tape (ongeveer ¾ "lang) perfect gestapeld op elkaar in een 50 mm schaal met een 40 mm dekglaasje bodem (dekglaasje onderste schaal). Deze moeten worden geplaatst dichter bij een van de randen, zodat de rand van de tape zal contact met de rand van de kromming van de nier, maar de doelstelling lichtpad (figuren 1A en 1B) niet blokkeren; grotere ratten zullen meer ruimte tussen de band en de rand van de schotel nodig.
  2. Place 2 Repti-therm pads naast het podium naast de 50 mm schaal (figuur 1A). Plaats een warming water jasje deken over het podium.
  3. Maximaliseren van de efficiëntie bij het verzamelen van beelden door het verzekeren van de objectieve turret heeft een 10x lucht or 20x (lucht of water immersie) objectief en een hogere aangedreven water immersie objectief om beelden te verzamelen voor kwantificering.
  4. Tijdens de beeldvorming de meest efficiënte manier om water toe te voegen aan de doelstellingen is om ze te draaien naar de kant en voeg water met een 1 cc spuit met een lang stuk van PE-200 buizen die de top van de doelstellingen kan bereiken.
  5. Stel de excitatie-intensiteit van de 10watt laser om ~ 15-20% met behulp van de grijsfilters op de software. De gallium-arsenide fosfide non-descanned fotodetectoren zijn ingesteld op 750 tot groene emissies, en 625 te verzamelen om rode uitstoot te verzamelen. Blauw-emissie (zoals de nucleaire vlek Hoechst 33342) worden verzameld met behulp van een standaard nondescanned multialkaline detector met een instelling tussen 750-800.
  6. Om de correcte inning van de lage emissie-intensiteit te verzekeren binnen de Bowman's ruimte, zorg ervoor dat de ondergrenzen van de detectoren zijn zo ingesteld als niet aan deze waarden uit te sluiten. Visuele waarschuwing markers zal aangeven of de gevoeligheidinstelling te laag is en deze waarden worden gegeven een intensiteit waarde van nul.
  7. Laad een 1 cc spuit met ~ 5-8 mg van de tl-albumine oplossing verdund met 0,9% steriele zoutoplossing om het totale volume op 1 cc.

3. Blootstellen van de nier in een München Wistar Rat voor intravitale 2-Photon Imaging

  1. Begin met een pre-verdoofde rat met Pentabarbitol (50 mg / ml oplossing, μl/100 120 g lichaamsgewicht), Inactin (130 mg / ml oplossing, μ/100 120 g lichaamsgewicht) of isofluorane (5% inductie, 1,5 tot 2.5% onderhoud), een inwonende veneuze lijn (ofwel halsader of femorale veneuze), en de linker flank geschoren van net onder de ribbenkast tot net boven de linker dij.
  2. Plaats de rat plat op haar rechterzijde, zodat de linker, geschoren kant naar boven, zorg ervoor dat het is plat op de tafel, met zijn houding langwerpig en niet gehurkt, met voorpoten tegen elkaar en achter poten raken elkaar (Figuur 2A). Heel voorzichtig palperen om de nieren te bepalen waar het natuurlijk legt binnen de retroperitoneum en trek een rechte lijn parallel aan het lichaam (van ribbenkast naar dij) met een Sharpie (Figuur 2A) voelen.
  3. Pak de huid met een paar getande tang, en neem de huid langs de getekende lijn met behulp van een paar hemostats om het weefsel te verpletteren en bloedingen te voorkomen. Knip langs de incisie met een paar chirurgische schaar. Breken de buitenste huid en de spieren lagen voorafgaand aan het snijden zal drastisch verminderen en typisch elimineren bloeden.
  4. Herhaal deze procedure voor de buitenste spierlaag, die dun.
  5. Voor de incisie in de binnenste spierlaag, die het peritoneum blootstelt, opnieuw palperen de nier te schatten formaat. Knijp een incisie lijn kleiner is dan de nieren, het verzekeren van de incisie is iets meer dan de nier. Het beste is om deze incisie te klein te maken en maken het groter indien nodig. Als deze te groot is, zal hechten vereist.Dit laatste incisie is cruciaal; te ver dan in elke richting zal beïnvloeden stabiliteit op het podium en induceren ofwel bewegende voorwerpen uit de ademhaling (best case scenario) of zullen de renale pedikel en negatieve verminderen nierperfusie (worst case scenario) rekken.
  6. Zoek de nieren (zie figuur 2B) en de grip omringende vet met forceps, werkt aan de onderzijde pool van de nier in een hand over hand mode.
  7. Zodra de onderste pool van de nier wordt bereikt, trek de nier door de incisie, terwijl heel zachtjes knijpen onder de nieren te exterioriseren. Als de incisie te klein is, verpletteren de spierlaag en snijd het te verbreden, herhaal dan de procedure om nier exterioriseren.

4. Het plaatsen van de Munich Wistar Rat in het werkgebied voor Imaging

  1. Plaats de nier naar de rand van het dekglaasje schaal met de nieren lichtjes gedraaid naar de dorsale (achterzijde) van de rat zodat de ventrale zijde van de nier is contact maken met het dekglaasje onderste schaal (figuur 1A). Voeg een voorverwarmde, steriele 09.% Zoutoplossing aan het gerecht.
  2. Kijk door de 10x of 20x objectief en controleer beweging. Als er beweging wordt gedetecteerd, rollen de rat op iets, zodat de thorax is verder weg van het dekglaasje onderste schaal, zorg ervoor dat de nieren wordt zo dicht mogelijk bij de rand van de schotel zonder strekken de renale pedicle (Figuur 1B).

5. Afbeeldingen ophalen om Renal Doorlatendheid albumine kwantificeren

  1. Het berekenen van de glomerulaire permeabiliteit (Glomeruluar zeefcoëfficiënt; SGR) van elke macromolekuul vereist het nemen van referentie achtergrond beelden van individuele glomeruli voorafgaand aan infusie van de fluorescente molecuul. Als uw microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde podium staat is het markeren van locaties, te vinden en het centrum individuele glomeruli met de onderste aangedreven objectieve en markeer elke locatie. Een dubbele pas Fluorescein / Rhodamine epifluorescente filter is ideaal voor deze procedure, hoewel beide emissiefilter zal werken (fase-contrast-of andere niet-fluorescentie lichtbronnen zal niet werken). Glomeruli verschijnt als lege cirkelvormige structuren omgeven door proximale tubuli met een inherente geel-oranje autoflourescence wanneer bekeken door de dual-pass filter.
  2. Als uw microscoop niet over een gemotoriseerde podium, scan de nier in een raster patroon met het lage vermogen objectief en maak een rudimentaire kaart van waar de individuele glomeruli liggen; vertrouwen op natuurlijke bezienswaardigheden zoals grote oppervlakkige bloedvaten zich boven de nierkapsel of vet vlekken.
  3. Schakel het torentje aan de hogere macht water immersie objectief en neem 3D data sets van elk glomeruli te zorgen dat de capillaire lussen en Bowman's ruimte zijn duidelijk zichtbaar. Met behulp van een pseudokleur palet (iets anders dan B / W) zal helpen om deze structuren te visualiseren.
  4. Focussen in op een oppervlakkig bloedvat langzaam doordringen in tHij fluorescerende albumine maken zeker de tijd wordt gegeven om voor systemische distributie. Voor moleculen met lage GSC is het essentieel om de sterktewaarden in het plasma maximaliseren maar niet tot een niveau dat de fotodetectoren verzadigd zal in de microscoop bereiken. Dit verhoogt detecteerbaarheid gefilterd moleculen. Opmerking: er is meestal een 5-7 sec tijdsverloop tussen het moment dat de fluorescerende albumine wordt ingevoerd om de tijd die op het scherm verschijnt (het verwerven van volledige beelden op ~ 1 frame / seconde).
  5. Laat ongeveer 10 minuten om eventuele kleine moleculair gewicht fragmenten te wissen voordat het verwerven van 3D-volumes op 1 micrometer intervallen te worden gebruikt bij de berekening van albumine SGR. Typisch, de Simonsen's stam van München Wistarratten heeft veel minder oppervlak glomeruli, dus alles wat kan worden gevisualiseerd worden afgebeeld en gekwantificeerd. De Frömter stam heeft een veel groter aantal dus beperken we het aantal gekwantificeerde tot ~ 10.
  6. Aan het einde van de studie de rat gedood door een overdosis van de anesthetic in de studie. Een dubbele pneumothoracotamy wordt uitgevoerd om euthanasie te verzekeren.

6. Berekenen van GSC voor TL albumine van 3D volumes

  1. Met behulp Metamorph beeldverwerking software te laden de 3D data sets voor elke glomeruli, zowel de achtergrond set en set genomen na infusie van de tl-albumine.
  2. In het volume met de tl-albumine zoek een oppervlakkige capillaire lus met voldoende ruimte lege ruimte tussen de gedefinieerde marges en de rand van het kapsel van Bowman.
  3. Op de achtergrond volume lokaliseren dezelfde focal plane waarin alle visuele aanwijzingen van de albumine afbeelding bevattende moet bevatten. Selecteer een regio binnen de capillaire lus van rente en noteer de gemiddelde intensiteit lezen. Vervolgens selecteert u een regio binnen de Bowman ruimte en noteer de gemiddelde intensiteit lezen. Deze worden gebruikt als achtergrondwaarden.
  4. Voor kwantificering, selecteert de vergelijkbare regio binnen de Bowman ruimte in de albumine containing afbeelding. Doe dit voor minstens twee andere regio's om een ​​gemiddelde waarde voor de gemiddelde intensiteit van binnen Bowman's ruimte innemen.
  5. Selecteer de capillaire lus met de helderste plasma-intensiteit en trek een streek eromheen. Vervolgens met behulp van de drempel functie, markeert de heldere waarden binnen het circulerende plasma, het vermijden van de donkere strepen die circuleren RBC's. Let op de gemiddelde intensiteit waarden van de geselecteerde plasma ruimte. Het is belangrijk om bij voorkeur selecteren de heldere gebieden van het plasma omdat factoren in het bloed zal alleen dienen oorzaak en onderschatting van plasma fluorescentieniveaus.
  6. Met behulp van een Microsoft Excel spreadsheet voert u de waarden bij het SGR waar berekenen:

Figuur 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 3 toont een voorbeeld van een afbeelding uit een oppervlak van een glomerulus München Wistar Frömter rat en de maatregelen om de permeabiliteit van fluorescente albumine te bepalen. De SGR waarde voor albumine van 0,0111 afgeleid voor deze persoon glomerulus vallen binnen het bereik gezien bij deze stam van München Wistarratten toen in de gevoede toestand 3. De stabiliteit gezien in dergelijke beelden door de zorgvuldige planning en uitvoering van instructies getoond in figuren 1 en 2. Zoals gezegd is de plaatsing van de incisie in exteriorizing de nier is de meest cruciale stap in de productie van stabiele beelden zonder bewegingsartefacten.

Figuur 1
Figuur 1. Een gedetailleerd schema van een oriëntatie positionerenvan de rat op de microscoop podium voorafgaand aan de beeldvorming. Leg de rat nier naar beneden (zoals in A) over de Repti-Therm verwarming pads met de nieren tot in het dekglaasje schotel. Rol de nier naar buiten (*) zodat de ventrale zijde raakt het dekglaasje bodem en contact wordt gemaakt met de autoclaaf tape (AT). Om ademhaling veroorzaakte bewegingen minimaliseren, rolt de rat vooruit (**), zodat de thorax is uit het gebied direct boven het dekglaasje gerecht. Vul de schaal met een steriele 0,9% zoutoplossing en bedek met water jas. Gebruik een thermometer om te controleren rectale temperatuur en draai de Repi-Therm pads aan en uit als dat nodig is. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2 : Src = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Figuur 2. . Uittreding van de nieren in München Wistar Rat voorafgaand aan plaatsing op microscoop podium Een verdoofde rat wordt geplaatst met zijn linker maat groter; gebied tussen de ribbenkast en bovenbeen geschoren (grijs weergegeven, A). Zodra sequentiële incisies worden gemaakt om dwars door de huid, buiten dan binnen spierlaag, zoals aangegeven door de lijn doorkruisen van de nier in A. De nier met bijbehorende nierkapsel vet moet zichtbaar zijn (B). Met behulp van een pincet, het vet is geknepen in een hand-over-hand mode totdat de onderste meest paal is bereikt (BE). Knijp voorzichtig in het gebied onder de nieren, terwijl trekken aan het vet te exterioriseren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

052/50052figure3.jpg "alt =" Figuur 3 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
Figuur 3. Enkel vlak beelden uit 3D volumes met een glomerulus van München Wistar Rat. Panelen A en B tonen achtergrondafbeeldingen en een genomen ~ 12 minuten na infusie van Texas Red Rat Serum Albumine (TR-RSA) in zwart-wit. Let op het gebrek aan waarneembare intensiteit van de capillaire lussen (CL) of Bowman's ruimte (BowSp) op de achtergrond afbeelding (A). Paneel C toont een regio uit paneel A in pseudocolor om beter de lage intensiteit achtergrond niveaus van weefsel te visualiseren. Hier is een kleine regio getekend in een capillaire lus (langer regio) en binnen Bowman's ruimte om reeds bestaande fluorescentie-intensiteit niveaus die moeten worden afgetrokken van de waarden verkregen na infusie van TL-albumine schatten. Panelen D en E zijn te nemenn uit paneel B en getoond in pseudocolor. Drie kleine gebieden plaats opgesteld Bowman ruimte worden gebruikt om de gemiddelde intensiteit van fluorescente eiwit voorkomt in de filtratie barrière (D) heeft bewogen berekenen. Gemiddelde intensiteit waarden voor de afzonderlijke regio's werden gemeld in het gemarkeerde gebied binnen de "Show Gewest Statistics" dialoogvenster (paneel D '). Om de in plasma circulerende intensiteit waarden binnen capillaire lussen (CL, in panel E) berekent een groot gebied wordt getrokken over de helderste capillaire lus en de heldere waarden langs de gemarkeerde met een drempel functie (aangetoond een oranje pixels). Alleen de intensiteit waarden van de pixels oranje gemarkeerd zullen worden gerapporteerd, ongeacht de vorm of grootte van de omliggende regio. Paneel E 'toont de ruwe gemiddelde intensiteit waarden van de albumine in de capillaire lussen; let op de checked "Gebruik Drempel voor Intensity Metingen" doos die isgecontroleerd. Paneel F toont de progressie van waarden vorm van links naar rechts te beginnen met de achtergrondwaarden van de capillaire Loops en Bowman's ruimte, die worden afgetrokken van de ruwe waarden verkregen in de beelden. Nadat de gecorrigeerde waarden worden afgeleid, is de Bowman ruimte intensiteit gedeeld door de capillaire Loop intensiteitswaarde de glomerulaire zeefcoëfficiënt die een verhouding van permeabiliteit verkregen; impermeant moleculen een waarde van nul (0), terwijl degenen die vrij gefilterd hebben een waarde van een (1). Bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4
Figuur 4. Opname van gefilterde fluorescerende albumine komt voornamelijk in de vroege segment van proximale tubuli, de S1. Paneel A toont een dwarsdoorsnede van een glomerulus en S1 segment taken ~ 20 minuten na infusie van de eerste Texas Red RSA bolus. Het openen van de Bowman ruimte en fervent opname van de albumine (rood) is getoond in de S1-segment. Paneel B toont een ondiepe 20 urn 3D projectie van dezelfde gegevensset. Paneel C toont een 3D-projectie met een lager vermogen 20x objectief ongeveer 60 minuten na infusie. Opmerking dezelfde glomerulus gezien in panelen A en B getoond in C (*) en de hogere niveaus van albumine retrieval gezien dat segment versus andere proximale tubulus segmenten. Bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De stappen benadrukt hier vertegenwoordigen wat we voelen zijn degenen die zal produceren consistente en nauwkeurige permeabiliteitswaarden omdat ze omzeilen de volgende valkuilen:

  1. Verstrooiing: Het gebruik van een rood emitterende fluoroforen zorgen voor een efficiëntere inning van het licht omdat fotonen langere golflengte minder geneigd zijn te verstrooien. Met behulp van hetzij groen of blauw emitterende fluoroforen zullen grotere variatie in de GSC's vanwege de verhoogde variabiliteit in intensiteit waarden uit de capillaire lussen en Bowman ruimte 3 te introduceren.
  2. Diepte Afbeelding: Hoewel diepe 3D data sets worden meestal verzameld (vaak tussen de 30-45 micron in totaal diepte), de bovenste 10-15 micron vertegenwoordigen de meest geschikte orgaan dieptes tot SGR waarden te bepalen. Opnieuw met diepere diepten komt een vermindering van de gevoeligheid en een toename in variabiliteit gevolg van de spreiding van geëmitteerde fotonen. Belangrijker echter is de verdringing van capillaire lussen die optreedt dOUDER binnen de glomerulus. Hier worden capillaire lussen, nauwgezet geduwd om de rand van de capsule van Bowman Bowman's omringende ruimte. Dit verhoogt de kans op onbedoeld selecteren van een gebied direct boven een van de vele podocytes dat de capillaire lussen omringen. Dit zal leiden tot een onderschatting van de GSC's omdat de ware, hogere intensiteit van de gefilterde albumine niet zal worden gerapporteerd. Note Paneel B en D in figuur 3 en de grote hoeveelheid aanwezige ruimte tussen de rand van de capillaire lussen en de rand van Bowman ruimte 3.
  3. Sampling: Selecteren verschillende regio's binnen Bowman ruimte verzekert de beste benadering voor het opsporen gefilterd albumine niveaus. Het is ook belangrijk op gebieden zoals de 11 en 00:00 positie boven de capillaire lussen te vermijden. Focussen door de 3D volume onthult een reeks van capillaire lussen gevangen bijna dwars net onder de focal plane. Dit gebied zou een vals verhoogde SGR waarde te geven dooroverschatting van de gefilterde albumine. Omgekeerd is het belangrijk om het helderste gedeelte van het bloedplasma in capillaire lussen selecteren best bepalen de werkelijke niveaus van circulerende fluorescente albumine. Hier onderschat deze niveaus zal ook GSC door verlaging van de waarde van de noemer van de vergelijking.

Validatie van deze techniek geschiedt door het afbeelden van een vrij gefiltreerd verbinding met GSC van een (1). Hier zorgen dat consequent onderschatten albumine plasmaspiegels, vanwege optische beperkingen verantwoordelijk voor overschatten albumine permeabiliteit, worden teniet gedaan 3. Daarnaast hebben vastgesteld GSC waarde voor een 70kDa dextran die vrijwel identiek met die verkregen door het meten urineklaring / plasmaniveaus en micropuncture bewijzen intravital 2-photon microscopie correct kan bepalen de doordringbaarheid van fluorescente macromoleculen 2. Tenslotte, het vermogen om snel e visualiserene glomerulus buisvormige segmenten langs het filtraat pad met een hoge resolutie, 2-photon microscopie uniek klaar staat het belang van de glomerulaire filtratie barrière en PT protienuria het bepalen en kwantificeren albuminurie.

De hierin beschreven protocollen gebaseerd op het gebruik van een 2-Photon systeem met een omgekeerde fase, die voordelen heeft in de eenvoud van de chirurgische procedures bij rat en plaatsing op het podium. Voor informatie over het gebruik van een 2-Photon-systeem met een rechtopstaande stadium verwijzen naar het hoofdstuk door Dunn et al.. 7 in Current Protocols in Cytometry (2007).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Drs Silvia B Campos-Bilderback en George J Rhodes bedanken voor het invullen van chirurgische procedures waarbij plaatsing van veneuze lijnen. Zij zouden ook graag Sara E Spenen bedanken voor het handhaven van de München-Wistar kolonies bestaande uit zowel Simonsen en Frömter stammen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope Olympus America Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser Spectra-Physics Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors Hamamatsu Corp Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymar T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater ZooMed RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride Invitrogen/Molecular Probes Cat# T-353
Rat Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF Sigma Aldrich Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
  2. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20, (3), 489 (2009).
  3. Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23, (3), 447 (2012).
  4. Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
  5. Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191, (3), 237 (2007).
  6. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
  7. Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics