Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

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Summary

Une technique utilisant haute résolution intavital microscopie 2-photons pour visualiser directement et de quantifier filtration gloemrular dans les glomérules de surface. Cette méthode permet la détermination directe des caractéristiques de perméabilité des macromolécules dans des états normaux et malades.

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Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).

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Abstract

Les maladies du rein impliquant la perte urinaire de grandes macromolécules essentielles, comme l'albumine sérique, ont longtemps été pensé pour être causés par des altérations de la barrière de perméabilité composé de podocytes, cellules endothéliales vasculaires, et une membrane basale de travail à l'unisson. Les données de notre laboratoire en utilisant intravitale microscopie 2 photons ont révélé une barrière plus perméable de filtration glomérulaire (GFB) qu'on ne le pensait dans des conditions physiologiques, avec récupération des filtré albumine se produisant dans un sous-ensemble au début de cellules appelées cellules des tubules proximaux (PTC) 1,2 3.

Les techniques précédentes utilisées pour étudier la filtration rénale et d'établir les caractéristiques de la barrière de filtration impliqué micropuncture de la lumière de ces segments tubulaires début de l'échantillonnage du contenu et analyse 4 fluide. Ces études ont déterminé la concentration d'albumine dans le liquide luminal être pratiquement inexistante; correspondant étroitementpour ce qui est normalement détecté dans l'urine. Cependant, la caractérisation des polymères de dextran avec des tailles définies par cette technique a révélé celles d'une taille similaire à l'albumine sérique des niveaux plus élevés dans la lumière tubulaire et l'urine; suggérant une perméabilité accrue 5.

Ce document est un aperçu détaillé de la technique utilisée pour visualiser et quantifier directement glomérulaire fluorescent perméabilité albumine in vivo. Cette méthode permet la détection de l'albumine filtrée à travers la barrière de filtration dans l'espace de Bowman (la chambre initiale de filtration urinaire), et permet également la quantification de l'albumine réabsorption par les tubules proximaux et la visualisation de suite transcytosis albumine 6. L'absence d'albumine fluorescent le long des segments tubulaires plus tard, en route vers la vessie met en évidence l'efficacité de la voie de récupération dans les segments des tubules proximaux plus tôt. De plus, lorsque cette technique a été appliquée pour déterminer la perméabilitéde dextranes ayant une taille similaire à des valeurs de perméabilité pratiquement identiques albumine ont été signalés 2. Ces observations appuient directement la nécessité d'élargir la portée de beaucoup de maladies rénales protéinuriques de modifications incluses dans la remise en état des cellules du tubule proximal.

Protocol

1. Conjugaison de sérum albumine de rat de sulfo-rhodamine 101 sulfonyle (Texas Red)

  1. Dissoudre 100 mg de Rat albumine sérique (RSA) dans 6.667 ml de 100 mM Sodium Bicarbonate pH 9,0; concentration finale de 15 mg / ml dans un tube conique de 50 ml.
  2. Lieu solution dans la glace / eau bécher et refroidir à entre 0 et 4 ° C.
  3. Ajouter 200 pi de qualité diméthylformamide élevé (DMF) anhydre à un flacon de 10 mg de Texas Red sulfonyle (TRSC); vortex sur le milieu pendant 15 sec.
  4. Solution RSA Vortex à moyen et ajouter le TRSC dissous.
  5. Wrap 50 ml conique en feuille (Parafilm peut être utilisé pour assurer un joint étanche est formé), lieu horizontalement dans un seau à glace w / glace seulement et le placer sur rocker à agiter solution lentement (éviter la formation de bulles), laissez réaction se poursuivre à 0 à 4 ° C pendant 1 heure.
  6. Assurez-5 L de solution saline à 0,9%, et mouiller un poids moléculaire de 50 kDa couper chambre off qui peut être soit a) membrane de dialyse avec clips, b) ditube de alysis comme dans un flotteur-a-lyseur, ou c) un tiroir-lyseur cassette (tous adaptés pour enlever RSRT non conjuguée).
  7. mélange réactionnel de place dans la chambre de dialyse et le lieu de la 5 L w / la solution saline à 0,9%, dialyser la nuit à 4 ° C avec une agitation douce à l'aide d'un barreau aimanté.
  8. Changer la solution de dialyse de 5 L en matinée et en fin d'après midi jusqu'à une nuit d'incubation résultats dans pratiquement aucun changement de couleur (Cela prend généralement ~ 48 h avec au moins 4 échanges). En outre, avec le seuil de rétention de 50 kDa être si près de la MW de RSA, 66kDa, il est possible de ne jamais produire une solution claire, ce sera dépend de la distribution de la taille des pores de la membrane; 60 h et 5 échanges est plus de suffisamment de temps.
  9. Mesurer le volume et diviser le poids initial de 100 mg par le volume de donner concentration approximative de TR-RSA; concentrations varient généralement de 10 à 13 mg / ml. Le colorant final: le rapport albumine doit être ~ 4:1, 1 fluorophore par 15,000 Daltons de MW de protéine. Conserver à 4 ° C; ne gèlent jamais la solution TR-RSA, telle qu'elle résulte fragmentation qui peut se produire va modifier les valeurs de perméabilité.

2. Préparer la platine du microscope inversé pour l'imagerie / Microscope Paramètres

  1. Lieu ~ 7.4 des morceaux de ruban autoclave (environ ¾ "de long) parfaitement empilés les uns sur les autres à l'intérieur d'un plat de 50 mm avec un fond de la lamelle 40 mm (lamelle plat à fond). Celles-ci doivent être placés plus près de l'un des bords de sorte que le bord de la bande va prendre contact avec le bord de courbure du rein, mais ne bloque pas le chemin de la lumière objective (Figures 1A et 1B); rats plus grands auront besoin de plus d'espace entre la bande et le bord du plat.
  2. Placer 2 Repti-Therm patins à côté de la scène aux côtés de l'antenne de 50 mm (figure 1A). Placez un réchauffement de l'eau veste couverture sur la scène.
  3. Maximiser l'efficacité lors de la collecte des images en assurant la tourelle a un objectif 10x air oR 20x (air ou l'eau) objectif et un objectif à immersion d'eau alimenté élevée, pour recueillir des images pour la quantification.
  4. Au cours de l'imagerie de la manière la plus efficace pour ajouter de l'eau à des objectifs est de faire tourner les sur le côté et ajouter de l'eau à l'aide d'une seringue de 1 avec un long morceau de tuyau PE-200 qui peuvent atteindre le haut des objectifs.
  5. Réglez l'intensité d'excitation du laser 10watt à ~ 15-20% en utilisant les filtres de densité neutre sur le logiciel. Les arséniure de gallium phosphure photodétecteurs non descanned sont fixés à 750 pour recueillir les émissions verts, et 625 pour recueillir les émissions rouges. Émission bleue (comme la tache Hoechst 33342 nucléaire) sont collectées à l'aide d'un détecteur de multialkaline nondescanned standard avec un réglage entre 750-800.
  6. Afin d'assurer la perception correcte des émissions de faible intensité à l'intérieur de l'espace de Bowman, assurez-vous que les limites inférieures des détecteurs sont réglés de manière à ne pas exclure ces valeurs. Marqueurs d'avertissement visuels indiquent si la sensibilitéréglage est trop bas, et ces valeurs est donnée une valeur d'intensité égale à zéro.
  7. Chargez une seringue de 1 à ~ 5-8 mg de la solution d'albumine fluorescent dilué avec 0,9% de solution saline stérile pour faire apparaître le volume total de 1 cc.

3. Exposer le rein dans un Rat Wistar Munich pour Intravitale 2-Photon Imaging

  1. Commencez avec un rat pré-anesthésiés en utilisant Pentabarbitol (50 mg / ml, solution, 120 g de poids corporel μl/100), Inactin (130 mg / ml, solution, 120 μ/100 g de poids corporel), ou isofluorane (5% induction, 1.5 à la maintenance de 2,5%), une ligne demeure veineuse d'accès (veineuse jugulaire ou fémorale soit), et le flanc gauche rasé juste en dessous de la cage thoracique juste au-dessus de la cuisse gauche.
  2. Placez le rat plat sur ​​le côté droit de sorte que l', côté rasé gauche est orientée vers le haut, assurez-vous qu'il soit à plat sur ​​la table, avec sa posture allongée et pas accroupi, avec les pattes avant de toucher les uns les autres et à l'arrière des pattes de toucher l'autre (Figure 2A). Très palper doucement à sentir le rein pour déterminer où il pond naturellement dans le rétropéritoine et tracer une ligne droite parallèle au corps (de la cage thoracique à la cuisse) à l'aide d'un Sharpie (figure 2A).
  3. Choisir la peau avec une paire de pince à griffes, et pincer la peau le long de la ligne tracée à l'aide d'une paire de pinces hémostatiques à écraser le tissu et d'éviter des saignements. Couper le long de l'incision à l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux. Broyage de la peau extérieure et les couches musculaires avant la coupe va considérablement réduire et éliminer typiquement saignement.
  4. Répétez cette procédure pour la couche musculaire externe, qui est mince.
  5. Pour l'incision dans la couche musculaire interne, qui va exposer le péritoine, re-palper le rein d'estimer la taille. Pincez une ligne d'incision plus petite que le rein, en assurant l'incision est juste sur le rein. Il est préférable de faire cette incision trop petite et l'agrandir si nécessaire. Si cela est fait trop grand, suture sera nécessaire.Cette dernière incision est critique; trop loin sur dans n'importe quelle direction va affecter la stabilité sur la scène et induire soit des artefacts de mouvement de la respiration (meilleur scénario) ou va étirer la perfusion pédicule rénal et réduire négativement rénale (le pire scénario).
  6. Localisez le rein (comme le montre la figure 2B) et l'adhérence de la graisse entourant aide d'une pince, en travaillant vers le pôle inférieur du rein dans une main sur la mode de la main.
  7. Une fois le pôle inférieur du rein est atteint, tirez doucement sur le rein à travers l'incision tout en serrant très légèrement en dessous du rein à extérioriser. Si l'incision est trop petit, écraser la couche musculaire et réduire l'élargir; répéter la procédure d'extérioriser rein.

4. Placer le Rat Wistar Munich sur la scène pour l'imagerie

  1. Placer le rein vers le bord du plat de la lamelle avec le rein légèrement tourné vers la dorsale (côté arrière) du rat de sorte que le côté ventral du rein is la prise de contact avec le plat à fond lamelle (figure 1A). Ajouter une solution chauffée, stérile 09.% De solution saline à l'antenne.
  2. Regardez à travers l'objectif 10x ou 20x et vérifier mouvement. Si un mouvement est détecté, rouler le rat sur ​​un peu de sorte que le thorax est plus loin de la boîte de fond de la lamelle, assurez-vous que le rein est aussi près du bord du plat sans étirement du pédicule rénal (figure 1B).

5. Acquisition d'images pour quantifier la perméabilité rénale de l'albumine

  1. Le calcul de la perméabilité glomérulaire (Glomeruluar coefficient de tamisage; CGC) de toute macromolécule nécessitera de prendre des images de référence de fond de glomérules individuels avant la perfusion de la molécule fluorescente. Si votre microscope est équipé d'une platine motorisée capable d'emplacements de marquage, trouver et centre glomérules individuels en utilisant l'objectif motorisé inférieur et marquer chaque emplacement. Un double passe fluorescéine / rhodamine épifluorescence filter est idéal pour cette procédure, bien que ce soit filtre d'émission fonctionnera (contraste de phase ou d'autres sources non-fluorescence d'éclairage ne fonctionnera pas). Glomérules apparaîtra comme des structures circulaires vides entourés de tubules proximaux ayant une autoflourescence jaune-orange inhérente lorsqu'il est vu à travers le filtre double passe.
  2. Si votre microscope n'a pas une platine motorisée, scannez le rein dans une configuration de trame avec l'objectif de faible puissance et de faire une carte rudimentaire où les glomérules individuels sont situés, en s'appuyant sur des repères naturels tels que les gros vaisseaux sanguins superficiels situés au-dessus de la capsule rénale ou patchs de graisse.
  3. Mettez la tourelle à l'eau puissance objectif à immersion supérieur et prendre les ensembles de données 3D de chaque glomérules en s'assurant que les boucles capillaires et l'espace de Bowman sont clairement visibles. Utilisant une palette pseudocouleur (autre que B / W quelque chose) permettra de visualiser ces structures.
  4. En se concentrant sur un vaisseau sanguin superficiel infuser lentement en til fluorescent s'assurant temps albumine est donnée pour permettre la distribution systémique. Pour les molécules à faible CGC, il est essentiel de maximiser les valeurs d'intensité dans le plasma, mais pas pour atteindre des niveaux qui vont saturer les photo-détecteurs au microscope. Cela augmente la détectabilité des molécules filtrées. Remarque: il existe généralement un laps sec 5-7 entre le moment où l'albumine fluorescent est introduit à la fois qu'il apparaît à l'écran (l'acquisition des images complètes à ~ 1 image / seconde).
  5. Laisser environ 10 minutes pour permettre à tous les petits fragments potentiels de poids moléculaire aient disparu avant l'acquisition de volumes 3D à des intervalles de 1 um à être utilisées dans le calcul de la CGC albumine. En règle générale, la souche de Munich rats Wistar de l'Simonsen a beaucoup moins de glomérules de surface, donc tout ce qui peut être visualisée sont imagés et quantifiés. La souche Frömter dispose d'un nombre beaucoup plus élevé si nous limitons le nombre chiffré à ~ 10.
  6. A la fin de l'étude, le rat est euthanasié par une surdose d'anesthésique l'IC utilisée dans l'étude. Un double pneumothoracotamy est effectuée pour assurer l'euthanasie.

6. Calcul de la CGC pour Fluorescent albumine à partir de volumes 3D

  1. Grâce à un logiciel de traitement d'image Metamorph charger des ensembles de données 3D pour chaque glomérules, à la fois l'ensemble de fond et mis en prise après la perfusion de l'albumine fluorescente.
  2. Dans le volume contenant le fluorescent albumine localiser une boucle capillaire superficiel avec suffisamment d'espace vide entre ses marges définies et le bord de la capsule de Bowman.
  3. Dans le volume de fond localiser le même plan focal qui doit contenir toutes les indications visuelles de l'image contenant l'albumine. Sélectionnez une région dans la boucle capillaire d'intérêt et noter la valeur moyenne de l'intensité. Ensuite, sélectionnez une région dans l'espace de Bowman et noter la valeur moyenne de l'intensité. Celles-ci seront utilisées comme valeurs de référence.
  4. Pour la quantification, sélectionnez la région similaire au sein de l'espace de Bowman dans le c albumineontenant image. Faites cela pour au moins deux autres régions à prendre une valeur moyenne de l'intensité moyenne à l'intérieur de l'espace de Bowman.
  5. Sélectionnez la boucle capillaire avec l'intensité de plasma lumineux et dessiner une région autour d'elle. Suivant en utilisant la fonction de seuil, mettre en évidence les valeurs de luminosité dans le plasma circulant, en évitant les rayures foncées qui circulent de RBC. Remarque les valeurs d'intensité moyenne de l'espace de plasma sélectionné. Il est important de choisir de préférence les zones claires de l'écran plasma, car les facteurs dans le sang ne servent qu'à provoquer et sous-estimation des niveaux de fluorescence plasma.
  6. Utiliser un tableur Microsoft Excel entrez les valeurs pour calculer la CGC où:

Figure 1

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Representative Results

La figure 3 montre un exemple d'une image prise à partir d'un glomérule de surface d'un Munich Wistar Frömter rat et les mesures prises pour déterminer la perméabilité de l'albumine fluorescente. La valeur CGC de l'albumine de 0,0111 dérivé pour cette glomérule chute individu au sein de la gamme vu dans cette souche de rats Wistar Munich lorsque dans l'état nourri 3. La stabilité observée dans ces images est due à la planification minutieuse et l'exécution des instructions décrites dans les figures 1 et 2. Comme indiqué précédemment, le placement de l'incision utilisée en extériorisant le rein est l'étape la plus cruciale dans la production des images stables libres de artefact de mouvement.

Figure 1
Figure 1. Un schéma détaillé de mise en place d'une orientationdu rat sur ​​la platine du microscope avant l'imagerie. déposer délicatement le côté du rein du rat vers le bas (comme indiqué en A) sur les coussins chauffants Repti-Therm avec le rein pose dans le plat de lamelle. Rouler vers l'extérieur du rein (*) de sorte que la face ventrale touche le fond de la lamelle couvre-objet et le contact est établi avec la bande autoclave (AT). Afin de minimiser la respiration mouvement induit, rouler le rat avant (**) de sorte que le thorax est hors de la zone située immédiatement au-dessus du plat de lamelle. Remplissez le plat avec stérile saline à 0,9% et la couverture avec chemise d'eau. Utilisez un thermomètre pour contrôler la température rectale et tourner les plaquettes Repi-Therm et désactiver au besoin. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 2. . Extériorisation de rein à Munich Rat Wistar avant le placement sur ​​la platine du microscope Un rat anesthésié est placé avec sa taille en haut à gauche; zone située entre la cage thoracique et la cuisse rasé (représenté en gris, A). Une fois incisions successives sont faites pour couper à travers la peau, couche musculaire interne externe puis comme indiqué par la ligne traversant le rein dans un fichier. Le rein avec de la graisse péri-rénale associée doit être visible (B). Utilisation d'une paire de pinces, de la graisse est pincé dans un mode main sur main jusqu'à ce que le plus polaire inférieure est atteinte (BE). Appuyez doucement sur ​​la zone située sous le rein tout en tirant sur ​​la graisse d'extérioriser. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 3. Images planes single extrait de volumes 3D montrant un glomérule d'un Rat Wistar Munich. Panneaux A et B montrent des images de fond et une prise ~ 12 minutes après l'injection de Texas Red Rat albumine sérique (TR-RSA) en noir et blanc. Notez l'absence intensité perceptible de boucles capillaires (CL) ou l'espace de Bowman (BowSp) dans l'image de fond (A). Groupe C montre une région prise à partir du panneau A pseudocouleur de mieux visualiser les faibles concentrations de fond d'intensité des tissus. Ici, une petite région est appelée dans une boucle capillaire (plus la région) et dans l'espace de Bowman pour estimer les niveaux d'intensité de fluorescence pré-existants qui doivent être soustraits des valeurs obtenues après la perfusion de l'albumine fluorescente. Panneaux D et E sont prisn à partir du panneau B et montré dans pseudocouleur. Trois petites régions d'intérêt tirés dans l'espace de Bowman sont utilisées pour calculer l'intensité moyenne de fluorescence albumine qui s'est déplacé à travers la barrière de filtration (D). Les valeurs moyennes d'intensité pour les différentes régions ont été signalés dans la zone en surbrillance Dans la boîte de dialogue (panneau D ') "Afficher la zone statistique". Pour calculer les valeurs d'intensité de plasma circulant dans les boucles capillaires (CL, dans le panneau E) une grande région est attirée sur les plus brillants boucle capillaire et les valeurs lumineuses le long de la surbrillance en utilisant une fonction de seuil (pixels montré une orange). Seules les valeurs d'intensité des pixels surlignés en orange seront rapportés indépendamment de la forme ou de la taille de la région environnante. Groupe E 'représente les valeurs d'intensité moyenne brutes de l'albumine dans les boucles capillaires; noter l'coché "Utiliser seuil pour des mesures d'intensité" boîte qui estvérifiée. Groupe F montre la progression des valeurs constituent gauche à droite en commençant par les valeurs de fond pour les boucles capillaires et l'espace de Bowman, qui sont soustraits des valeurs brutes obtenues dans les images. Une fois que les valeurs corrigées sont dérivés, la valeur de l'intensité de l'espace de Bowman est divisée par la valeur de l'intensité de la boucle capillaire pour obtenir le coefficient de tamisage glomérulaire qui est un rapport de la perméabilité; molécules imperméants ont une valeur de zéro (0), tandis que ceux qui sont librement filtrée avoir une valeur de un (1). Bar = 20 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4. L'absorption de filtre fluorescent albumine se produit principalement in le segment précoce des tubules proximaux, le S1. Panel A représente une coupe transversale d'un segment glomérule et S1 pris ~ 20 minutes après l'injection de la première Texas Red RSA bolus. L'espace de l'ouverture de la Bowman et l'absorption avide de l'albumine (rouge) est présentée dans le segment S1. Groupe B montre une 20 um projection 3D superficielle du même ensemble de données. Groupe C présente une projection 3D en utilisant une puissance inférieure objectif 20x environ 60 perfusion de poste min. Notez le même glomérule vu dans les panneaux A et B montre C (*) et les niveaux élevés de récupération albumine vu dans ce segment par rapport aux autres segments du tubule proximal. Bar = 20 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Les étapes soulignés ici représentent ce que nous croyons être celles qui vont produire des valeurs de perméabilité cohérentes et précises car elles contournent les pièges suivants:

  1. Diffusion: L'utilisation d'un dispositif d'émission des fluorophores rouges permettre une collecte plus efficace de la lumière depuis plus photons de longueurs d'onde sont moins enclins à se disperser. En utilisant soit des fluorophores émettant vert ou bleu va introduire une plus grande variation dans CGC c'est à cause de l'augmentation de la variabilité dans les valeurs d'intensité des boucles capillaires et l'espace de Bowman 3.
  2. profondeur de l'image: Bien que les ensembles de données 3D profondes sont généralement collectées (souvent entre 30-45 microns de profondeur totale), les supérieurs 10-15 microns représentent des profondeurs focales les plus appropriées pour déterminer les valeurs de la CGC. Encore une fois avec de plus grandes profondeurs vient une diminution de la sensibilité et une augmentation de la variabilité due à la diffusion de photons émis. Plus important cependant est l'éviction de boucles capillaires qui se produit deeper dans le glomérule. Ici, boucles capillaires sont poussés près du bord de la capsule de Bowman entourant l'espace de Bowman. Cela augmente les chances de sélectionner par inadvertance une zone directement sur l'un des nombreux podocytes qui entourent les boucles capillaires. Cela conduira à une sous-estimation de la CGC c'est parce que le vrai, l'intensité élevée de l'albumine filtrée ne sera pas rapportée. Remarque groupe B et D dans la figure 3 et la grande quantité d'espace présent entre le bord des boucles capillaires et le bord de l'espace de Bowman 3.
  3. L'échantillonnage: Sélection de plusieurs régions au sein de l'espace de Bowman assure la meilleure approximation de détecter les taux d'albumine filtrés. Il est également important d'éviter des domaines tels que la position 11 et 12 heures au-dessus des boucles capillaires. De mise au point à travers le volume 3D montre un ensemble de boucles capillaires pris presque transversalement juste au-dessous du plan focal. Cette zone donnerait une valeur CGC faussement élevée parsurestimer l'albumine filtrée. Inversement, il est important de choisir la partie la plus brillante du plasma à l'intérieur de boucles capillaires afin de déterminer au mieux les véritables niveaux de circulation fluorescent albumine. Ici sous-estimer ces niveaux permettra également d'augmenter la CGC en diminuant la valeur du dénominateur dans l'équation.

La validation de cette technique se fait par l'imagerie d'un composé librement filtrée avec un SGC d'un (1). Ici, les préoccupations qui sous-estimer systématiquement les taux plasmatiques d'albumine, en raison de limitations optiques étant responsable de la surestimation de la perméabilité albumine, sont annulés 3. En outre, après avoir déterminé une valeur CGC pour un dextran 70 kDa qui est pratiquement identique à celui obtenu en mesurant les niveaux de déminage / plasma urinaires et microponction prouvent intravitale microscopie 2 photons est capable de déterminer correctement la perméabilité des macromolécules fluorescentes 2. Enfin, la capacité de visualiser rapidement èmee glomérule et segments tubulaires le long du chemin filtrat, avec un haut degré de résolution, microscopie 2 photons se tient exceptionnellement bien placée pour quantifier l'importance de la barrière de filtration glomérulaire et PT dans la détermination protienuria et l'albuminurie.

Les protocoles décrits ici sont basées sur l'utilisation d'un système 2-Photon avec un stade inversé qui a des avantages dans la simplicité des procédures chirurgicales concernées et le placement de rat sur la scène. Pour plus d'informations sur l'utilisation d'un système 2-Photon avec un stade debout reporter au chapitre par Dunn et al. 7 dans les protocoles actuels en cytométrie (2007).

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les Drs Silvia B Campos-Bilderback et George J Rhodes pour l'achèvement des procédures chirurgicales impliquant le placement de lignes d'accès veineux. Ils aimeraient également remercier Sara E sevrage pour maintenir les colonies Munich-Wistar composé de deux Simonsen et souches Frömter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope Olympus America Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser Spectra-Physics Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors Hamamatsu Corp Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymar T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater ZooMed RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride Invitrogen/Molecular Probes Cat# T-353
Rat Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF Sigma Aldrich Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
  2. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20, (3), 489 (2009).
  3. Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23, (3), 447 (2012).
  4. Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
  5. Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191, (3), 237 (2007).
  6. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
  7. Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).

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