Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een punch biopsie van de huid wordt vaak gebruikt om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) te kwantificeren voor de diagnose van perifere polyneuropathie 1,2. Momenteel is het gebruikelijk om 3 mm huid biopten te verzamelen van het distale been (DL) en proximale dij (PT) voor de beoordeling van lengte-afhankelijke polyneuropathieën 3. Echter, vanwege de aard van multidirectionele IENFs, is het een uitdaging om te onderzoeken overlappende zenuwstructuren door de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvorming. Alternatief zou driedimensionale (3D) beeldvorming een betere oplossing voor dit dilemma.

In het huidige rapport presenteren we methoden voor de toepassing van 3D-beeldvorming om pijnlijke neuropathie (PN) te bestuderen. Om IENFs identificeren, zijn huid monsters verwerkt voor immunofluorescent analyse van eiwit-genproduct 9,5 (PGP), een pan neuronale marker. Op dit moment is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathie behulp IENFD ontmoedigen diagnosticerenbepaald door immunohistochemie met PGP helderveld microscopie 4. In de huidige studie, dubbele immunofluorescentie-analyse pasten wij aan totale IENFD identificeren, PGP en nociceptieve IENF, door het gebruik van antilichamen die tropomyosine-receptor-kinase herkennen A (Trk A), de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroeifactor 5. De voordelen van co-kleuring IENF met PGP en Trk A antilichamen ten goede aan de studie van PN door duidelijke kleuring PGP-positieve, nociceptieve vezels. Deze fluorescerende signalen kunnen worden gekwantificeerd om nociceptieve IENFD en morfologische veranderingen van IENF geassocieerd met PN bepalen. De fluorescerende beelden worden overgenomen door confocale microscopie en verwerkt voor 3D-analyse. 3D-imaging biedt rotatie capaciteiten om verder te analyseren morfologische veranderingen geassocieerd met PN. Samen genomen, fluorescerende co-kleuring, confocale imaging en 3D-analyse duidelijk ten goede aan de studie van PN.

Introduction

Momenteel is het gebruikelijk voor artsen om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) kwantificeren van de huid stansbiopsieën, die kan worden gebruikt om kleine vezels neuropathieën 3, 6-8 diagnosticeren. Biopten worden genomen uit de distale been (DL), 10 cm boven de laterale malleolus, en de proximale dij (PT), 20 cm onder de voorste iliaca wervelkolom 9. Alle IENF worden geëtiketteerd met proteïnegen product 9,5 (PGP), een pan neuronale marker 10-12. Momenteel is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathieën middels diagnosticeren IENFD bepaald door kleuring met PGP helderveld microscopie 6. Daarnaast hebben verschillende onderzoeksgroepen gebruikt immunofluorescerende protocollen voor PGP immunohistochemie 7-9. Kleine vezels neuropathie wordt vaak geassocieerd met neuropathische pijn. Om de rol van IENF essentieel voor pijn verwerking verder begrijpen we een techniek ontwikkeld om samenwerking label totale IENF met vezels die pijn produceren. Nociceptieve IENF, specifiek Aδ en C-vezels, kan worden bestudeerd door de co-etikettering van IENF met PGP en de nociceptieve marker, tropomyosine-receptor-kinase A (Trk A) 5. TrkA is de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroei-factor die essentieel is voor de ontwikkeling van nociceptie. De Trk A-positieve nociceptieve zenuwvezels zijn peptidergisch vezels die express substance P (SP) en calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP). Voorheen Lauria en collega's paste de dubbel-labeling techniek om PN, co-labeling PGP-positieve IENF met een nociceptieve marker 10 bestuderen. In onze eerdere studie hebben we aangetoond dat Trk A-positief IENF, maar niet Trk A-negatieve IENF werden opgereguleerd in een diermodel van pijnlijke diabetische neuropathie 5. Deze co-labeling techniek biedt de mogelijkheid om te vergelijken kwantificering van nociceptieve IENFD aan IENFD en het vermogen om morfologische veranderingen geassocieerd met PN bestuderen totaal. De mogelijkheid om nociceptieve IENF en bedrij visualiserenre kwantificering van totaal IENFD tot nociceptieve IENFD kan objectief bewijs voor de aanwezigheid van pijn en mogelijk inzicht in de ernst van pijn bij PN. Deze techniek is ook toepasbaar op huid van diermodellen. In vergelijking met eerdere studies, het huidige protocol beschrijft methoden voor 3D beeldanalyse, het creëren van de mogelijkheid om fouten die kunnen optreden in 2D beeldanalyse voorkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deel A: Immunohistochemistry

Bereiding van 96-well plaat en voorkoming van achtergrondkleuring Punch skin biopsies verzameld van proefpersonen en gedurende 12-24 uur in fixeeroplossing (2% paraformaldehyde bij 0,75 M L-lysine-oplossing (pH 7,4) en 0,05 mM natriumperjodaat) bij 4 ° C zoals eerder beschreven 8. Monsters worden vervolgens cryoprotected in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 20% glycerol bij 4 ° C gedurende 1 week, ingebed in fixeermiddelen optimale snijtemperatuur (OCT), vervolgens in coupes 50 urn dikke secties op een cryostaat. Het hieronder beschreven protocol is geschikt voor 8 huidsecties, het maximum aantal huidsecties mogelijk vrij zwevende immunohistochemie ondergaan in een 96-well plaat.

DAG 1:

1. Preventie van niet-specifieke immunoreactiviteit in de hoornlaag

  1. Label 96-well plaat zoals getoond in figuur 1. Voeg 150 ul van Image-IT FX Signal (Image-IT), effectief voor het blokkeren achtergrondkleuring 11,12, in elk putje in rij 1 van de 96-well plaat.
  2. Voeg 150 pi 1X PBS aan elk putje in rij 2 en 3 van de 96-well plaat.
  3. Verwerven twee 50 micrometer secties per patiënt: een sectie van de biopsie genomen op DL, een sectie van de biopsie genomen bij PT. Een entnaald (LeLoop) wordt gebruikt om delen van de ene spoel naar de volgende morfologische schade te voorkomen. Zachtjes elke 50 pm sectie overdragen, met behulp van een entnaald, in een individuele welzijn van Rij 1, met daarin Afbeelding-IT. Incubeer secties in Beeld-IT voor 30 min bij RT op een vlakke rocker.
  4. Spoel secties tweemaal met 1X PBS (rijen 2 en 3) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats wells plaat op een vlakke rocker tussen spoelingen.

2. Bereiding van 5% BSA Blocking Solution en 1% spoeloplossing

  1. Terwijl biopsie secties zijn incuberen in Beeld-IT, bereiden 5% blokkerende oplossingtie (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex oplossing totdat BSA volledig oplost).
  2. Voeg 150 ul van 5% BSA blokkerende oplossing in elk putje van Row 4.
  3. Met behulp van een entnaald, secties te zetten in afzonderlijke putjes van 5% BSA blokkerende oplossing. Incubeer secties in 5% BSA blokkerende oplossing voor 1-2 uur bij kamertemperatuur op een vlakke rocker.

3. Bereiding van 1% BSA-oplossing en spoelen Verdunning van Primaire antilichamen

  1. Terwijl secties incuberen in 5% BSA blokkerende oplossing, bereid 1% spoeloplossing (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-BSA Vortex oplossing tot volledig opgelost).
  2. Terwijl secties incuberen in 5% BSA blokkerende oplossing primaire antilichamen verdund in 1% spoeloplossing.
    1. Voor acht secties (8 x 150 = 1200 pi pi) in totaal 1.200 gl nodig. De primaire antilichamen worden bereid in 1500 pl (ongeveer 20% extra volume).
    2. Verdunningen van het primaire antilichamen: PGP, 1:500; Trk A,1:500 in 1% BSA spoeloplossing.

4. Incubatie van Sectioned Biopsieën in primair antilichaam

  1. Voeg 150 pi van het verdunde primaire antilichamen in de aangegeven putjes van de 96-well plaat (rij 5).
  2. Overdragen secties van 5% blokkerende oplossing (rij 4) in de daarvoor bestemde primaire antilichaam putten (rij 5).
  3. Sluit de 96-well plaat met parafilm en aluminium folie om uitdrogen te voorkomen en blootstelling aan licht.
  4. Incubeer de 96-well plaat O / N bij 4 ° C op een vlakke rocker.

DAG 2:

5. Spoel Biopsieën in 1% BSA Spoelen Solution

  1. Voeg 150 ul van 1% BSA spoeloplossing in elk putje in rij 6, 7 en 8.
  2. Spoel secties driemaal met 1% BSA spoeloplossing (rijen 6, 7, en 8) gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur. Bedek goed plaat met aluminiumfolie en plaats op vlakke rocker tussen spoelingen.

6. Verdunning van secundaire antilichamen

<ol>
  • Terwijl secties worden geïncubeerd in de laatste spoelgang van 1% BSA spoeloplossing (rij 8), secundaire antilichamen verdund in 1% BSA spoeloplossing:
    1. Voor acht secties (8 x 150 = 1200 pi pi) in totaal 1.200 gl nodig. De secundaire antilichamen worden bereid in 1500 pl (ongeveer 20% extra volume).
    2. Verdunningen van de secundaire antilichamen: voor PGP (Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn, 1:250), voor Trk A (Alexa Fluor 647 ezel anti-geit, 1:250) in 1% BSA spoeloplossing.
  • 7. Incubatie van Sectioned Biopsieën in secundair antilichaam

    1. Voeg 150 pi van het verdunde secundaire antilichamen in de aangegeven putjes van de 96-well plaat (rij 9).
    2. Overdragen secties van 1% BSA blokkerende oplossing (rij 8) in secundaire antilichaam goed (rij 9).
    3. Sluit de 96-well plaat met parafilm en aluminium folie om uitdrogen te voorkomen en blootstelling aan licht.
    4. Incubeer secties in de aangewezen secundaire antilichamen O/ N bij 4 ° C op een vlakke rocker.

    8. Spoel Biopsieën in 1% BSA Spoelen Solution

    1. Voeg 150 ul van 1% BSA spoeloplossing in elk putje in rij 10, 11 en 12.
    2. Spoel secties driemaal met 1% BSA spoeloplossing (rijen 10, 11 en 12) gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur. Bedek goed plaat met aluminiumfolie en plaats op een vlakke rocker tussen spoelingen.

    9. Voorbereiding van de Microscope Slides en montage Sectioned Biopsieën

    1. Terwijl biopsie secties worden incuberen in de laatste spoeling van 1% BSA spoelvloeistof (rij 12), bereiden objectglaasjes.
    2. Plaats 50 gl 1% BSA spoeloplossing op een dia tegelijk.
    3. Verwijder coupes van 1% BSA spoeloplossing (rij 12), en plaats deze in de 50 ul druppel van 1% BSA spoeloplossing op de aangewezen microscoopglaasje. Na het optimaliseren van de positie van de sectie, verwijder overtollig 1% BSA spoelen oplossing met een bulbed glazen pipet, het nemen van voorzorgsmaatregelenom te voorkomen dat het monster aan te raken.

    OPMERKING: Zorg ervoor dat sectie is nog niet voorbij gevouwen; het monster moet vlak zijn tegen het oppervlak van de microscoop dia.

    1. Plaats 1 druppel Verleng Gold antifade montage reagens met DAPI bij de biopsie op de microscoop dia. Neem een ​​22x22 mm microscoop glas dekglaasje en plaats deze voorzichtig over biopsie en een druppel Verleng Gold antifade reagens met DAPI neerzetten. Herhaal dit voor elke sectie.
    2. Laat objectglaasjes droog O / N bij RT in het donker.

    OPMERKING: Verwijder eventuele luchtbellen met behulp van een pipet tip. Veeg overtollige Verleng Gold antifade reagens.

    Deel B: confocale Imaging

    10. Confocale Imaging

    1. Afbeelding fluorescentie signalen met behulp van een Olympus FluoView 500 laser scanning confocale microscoop met een 40X olie-immersie (1.3 NA) objectieve en zoom twee keer met FluoView versie 5.0 software. Gebruik Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 647 de 543-nm HeNe green laser en 633 nm HeNe-laser Red respectievelijk wekken. De Alexa Fluor 488 signaal wordt door een groene opzoektabel (LUT) en het Alexa Fluor 647 door een rode LUT.
    2. Stel de confocale openingen voor elke detector bij 400 urn tot signaalversterking. Sequentiële scans moeten worden genomen met een resolutie van 1024 x 1024 te signaalscheiding maximaliseren.
    3. Leg drie-dimensionale z-series met 1,2 urn z-stappen van (gebaseerd op de optimale scaneenheid berekend door de software FluoView) met Kalman gemiddeld (twee frames).

    Deel C: Drie-dimensionale visualisatie en animatie

    11. Driedimensionale (3D) Visualisatie en Animatie

    1. Open FluoView bestanden in Imaris x64-software (versie 7.3, Bitplane AG) te visualiseren het 3D-beeld sets.
    2. Het scherm aanpassen als nodig is om het contrast van de zenuw specifiek signaal te versterken.
    3. Maak een surface naar de dermale-epidermale grens visualiseren. Gebruik de Contour instrument in gelijkspel modus om de grens te trekken.
    4. Wijs een semi-transparante oppervlak aan de grens om de onderliggende fluorescentiesignalen bekijken.
    5. Stilstaande beelden van de 3D-fluorescerende signalen naar Snapshot beelden van de 3D-film te maken.
    6. Gebruik de functie Animation om een ​​3D-film te maken. De beelden kunnen worden gedraaid 360 graden een paar keer om elk signaal apart en samengevoegde zien (figuren 2, 3 en 4). Stel animatie om films bestaande uit 200 frames geanimeerd op 15 frames per seconde te maken. Opslaan elke film als een rauwe AVI-bestand.
    7. Druk de uiteindelijke AVI-film met VirtualDub-software (versie 1.9.4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    We pasten het huidige protocol naar de morfologie van IENF in PT en DL huidbiopsies bestuderen van patiënten met PN. De huid, uit drie onderwerpen, werd verzameld aan de Universiteit van Utah aan de pathomorphology geassocieerd met PN demonstreren. De onderwerpen zijn onder meer: ​​Case 1: een 51-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 14 maanden; pijn score: 51); Case 2: een 56-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 108 maanden; pijn score: 47), en arrest van 3: een 66-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 42 maanden; pijn score: 46). Neurologische anamnese en onderzoek, met inbegrip van kwantitatieve sensorische tests en studies van de zenuwgeleiding, werden uitgevoerd om perifere neuropathie beoordelen. Pijnscores werden bepaald op basis van de 0-100 visuele analoge pijnschaal.

    Met dit protocol, kunnen wij de 3D ​​structuur van IENFs in de menselijke huid (fig. 2) te onderzoeken. In figuur 2 (figuur 3) te bestuderen. 3D beeldvorming van axonale zwellingen, weergegeven in figuur 3, toont aan dat deze bulten bolvormige structuren verdeeld langs IENFs. Bovendien kunnen deze werkwijzen bestudeerd worden vertakking in IENFs (figuur 4). 3D-beelden van vertakking in figuur 4 tonen dat morfologische veranderingen plaatsvinden met de aanwezigheid van PN. Zoals eerder beschreven, werd het dermale-epidermale grens bepaald op basis van morfologie en oriëntatie van zenuwen en de pixel intensiteit tussen dermis en epidermis 8. De blauwe tracing, afgebeeld in de figuren 2, 3 en 4Geeft het dermale-epidermale grensvlak.

    Figuur 1
    Figuur 1. Schematische voorstelling die de setup voor een 96-wells plaat voor huidbiopsie immunohistochemie.

    Figuur 2. Driedimensionale (3D) beelden van IENF. Vertegenwoordiger 3D-beeld van (A) PGP-positieve IENF, groen gelabeld, wat neerkomt op in totaal IENF (eerste 360 ° rotatie) en (B) Trk A-positieve IENF, gelabeld rood, wat neerkomt op nociceptieve IENF (tweede rotatie van 360 °), en (C ) een samengevoegde afbeelding te tonen PGP-positieve, nociceptieve IENF (derde rotatie van 360 °) in een huid monster van Case 1. Bar = 20 micrometer. Klik hier om de film te bekijken.

    Figuur3. Driedimensionale (3D) beeld van axonale zwellingen in IENF van PN. Vertegenwoordiger 3D-beeld van axonale zwellingen (pijlpunten) langs IENFs, gelabeld door PGP met een groen signaal, en binnen de subdermale plexus in een huid monster van Case 2. Bar = 10 micrometer. Klik hier om film te bekijken.

    Figuur 4. Driedimensionale (3D) beeld van axonale vertakkingen in IENF van PN. Vertegenwoordiger 3D-beeld van axonale vertakkingen (pijlpunten) langs IENFs, gelabeld door PGP met een groen signaal, in een huid monster van Case 3. Bar = 20 micrometer. Klik hier om film te bekijken.

    Onderdelen van 5% BSA blokkerende oplossing: Bedrag dat nodig is voor 12,5 ml
    1X PBS 8.125 ml
    0.1% Triton X-100 (TX-100) [Final Concentratie: 0.03%] 3,75 ml
    Bovine Serum Albumine (BSA) 0.625 g
    TOTAAL 12,5 ml

    Tabel 1. 5% BSA blokkerende oplossing.

    Componenten van 1% spoeloplossing: Bedrag dat nodig is voor 12 ml
    1X PBS 8.625 ml
    0.1% TX-100 [Final Concentratie: 0.03%] 3.25 ml
    Bovine Serum Albumine (BSA) 0,125 g
    TOTAAL 12 ml

    Tabel 2. 1% BSA blokkerende oplossing.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Meting van IENFD is op grote schaal gebruikt om de mate van perifere neuropathieën 13,14 bepalen. Momenteel is de meest gebruikte protocol meet alleen de dichtheden van zenuwvezels die de basale membraan van de epidermis doordringen, het niet in aanmerking nemen axonale vertakkingen en / of morfologische veranderingen van de zenuwen. Bovendien heeft de huidige IENFD analyse niet aangetoond IENFD correleren met de aanwezigheid van pijn in PN 15.

    We eerder gemeld dat verhoogde aantallen nociceptieve IENFD worden geassocieerd met pijngedrag in db / db muizen, een muismodel van type 2 diabetes 5. In dat verslag, dat we voor het eerst toegepast een dubbele immunofluorescent protocol om nociceptieve IENF studeren. In de huidige studie, ons protocol vergroten zo de menselijke huid van patiënten met PN. De dubbele immunofluorescent analyse geeft metingen van zowel de totale IENF en nociceptieve IENF, de subset van IENFs die bemiddelenpijn. Deze nociceptieve IENF zijn meestal positief voor Trk A en andere nociceptieve neuropeptiden 5. Vergelijkbare dubbele immunofluorescentie-analyse voor pijnlijke neuropathieën is beschreven door Lauria en collega's 10. Zij meldden verminderde IENFD voor transient receptor potential kationkanaal onderfamilie V lid 1 (TRPV1) bij patiënten met pijnlijke neuropathieën. Het huidige protocol zou een alternatieve benadering voor het meten van nociceptieve IENFD op basis van onze gegevens bij dieren 5 bieden.

    Het huidige protocol biedt een 3D-benadering voor het bestuderen IENF structuur. In combinatie met dubbele immunofluorecent analyse, het huidige protocol biedt methoden om de morfologie van nociceptieve IENFs onderzoeken. Eerdere studies hebben geen melding gemaakt van een associatie tussen dichtheden of vertakking van nociceptieve IENF met PN. Hier tonen we een protocol voor het bestuderen van axonale vertakkingen en zwelling in IENFs van de menselijke huid. Onze 3D-analyse suggereert dat dit methode kunnen worden gebruikt om de morfologische veranderingen van IENF in PN bestuderen. Bovendien zou 3D beeldvorming van de huidige protocollen IENFD meting verbeterd door het vermijden van fouten die worden geassocieerd met verminderde visualisatie van overlappende structuren geassocieerd met 2D-beeldvorming.

    Axonale zwelling wordt gedefinieerd als een vergroting van een axonale gedeelte met een diameter groter dan twee keer die van de oorspronkelijke axonale kaliber 16. Deze structuur bevat fragmenten van axonale cytoskelet en onderdelen van axonale transport. Axonale zwelling wordt beschouwd als een vroeg kenmerk van axonale neuropathie 6,16,17. Echter, 3D analyse van axonale zwelling structuren niet gerapporteerd in de literatuur. Zoals weergegeven in figuur 3, kan 3D beeldvorming belangrijk inzicht voor axonale zwelling verbonden PN.

    Het is goed gekarakteriseerd dat axonale vertakkingen begeleidt het herstel van zenuwletsel 18. Debeschikbare methodiek voor het kwantificeren van axonale vertakkingen is nog beperkt op basis van 2D-beeldvorming. Zoals in figuur 4, kan axonale vertakkingen worden bemoeilijkt door de kronkelige aard van de regenererende zenuwen. Bijgevolg kon de vertakking punten worden verduisterd door de omgeving zenuwvezels om de correctheid van kwantificering beïnvloeden. De 3D-beeldvorming analyse van ons protocol biedt verbeterde visualisatie voor de details van de vertakking zenuwen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Geen belangenconflicten te verklaren.

    Acknowledgements

    Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor Neurology Research & Discovery en The A. Alfred Taubman Medical Research Institute van de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en beeldanalyse Kern van de Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door de National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases. De auteurs willen graag Robinson Singleton en Gordon Smith (Universiteit van Utah) bedanken voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters aan de initiële ontwikkeling van de nociceptieve biomarker immunohistochemie techniek ondersteunen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
    Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
    Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
    Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
    Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
    Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
    Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
    96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
    Microscope Cover Glass 22x22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
    Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
    Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
    Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164, (2), 172-178 (1999).
    2. Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28, (3), 276-285 (2007).
    3. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55, (12), 1513-1520 (1998).
    4. Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14, (5), 655-659 (2001).
    5. Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45, (1), 280-287 (2012).
    6. Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54, (3), 273-285 (2009).
    7. Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37, (1), 50-60 (2008).
    8. Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200, (2), 190-198 (2011).
    9. Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261, (1), 25-33 (1990).
    10. Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11, (3), 262-271 (2006).
    11. Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182, (7), 4056-4064 (2009).
    12. Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58, (2), 207-218 (2010).
    13. Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3, (1), 23-28 (2001).
    14. Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18, (5), 591-597 (2005).
    15. Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29, (4), 883-887 (2006).
    16. Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61, (5), 631-636 (2003).
    17. Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29, (3), 420-427 (2004).
    18. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics