Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

De gist mitochondriale nucleoid eiwit, Mgm101, is een rad52-soort recombinatie eiwit dat grote oligomere ringen vormt. Een protocol wordt beschreven aan oplosbare recombinant Mgm101 bereiden met behulp van de maltosebindingseiwit (MBP)-tagging strategie in combinatie met kationuitwisseling en size exclusion chromatografie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De MGM101 gen werd 20 jaar geleden geïdentificeerd voor zijn rol in het onderhoud van mitochondriaal DNA. Studies uit verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de Mgm101 eiwit betrokken is bij de reparatie van recombinational mitochondriaal DNA. Recente onderzoekingen hebben aangegeven dat Mgm101 is gerelateerd aan het RAD52 type recombinatie eiwitfamilie. Deze eiwitten vormen grote oligomere ringen en bevordering van de annealing van de homologe enkelstrengs DNA-moleculen. Echter, de karakterisering van Mgm101 gehinderd door de moeilijkheid in het produceren van het recombinante eiwit. Hier is een betrouwbare werkwijze voor de bereiding van recombinant Mgm101 beschreven. Maltose bindend eiwit (MBP)-gelabeld Mgm101 eerst tot expressie in Escherichia coli. Het fusie-eiwit wordt eerst gezuiverd door affiniteitschromatografie amylose. Na zijn vrijlating door proteolytische splitsing, wordt Mgm101 gescheiden van MBP door kationische uitwisselingschromatografie. Monodisperse Mgm101 wordt dan verkregendoor grootte-uitsluitingschromatografie. Een opbrengst van -0,87 mg Mgm101 per liter bacteriekweek kan routinematig verkregen. De recombinant Mgm101 heeft minimale verontreiniging van DNA. De geprepareerde monsters worden met succes gebruikt voor biochemische, structurele en single particle image analyses van Mgm101. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor de bereiding van andere grote oligomere DNA-bindende eiwitten die kunnen worden verkeerd gevouwen en giftig voor bacteriële cellen.

Introduction

Homologe recombinatie is belangrijk voor de reparatie van dubbelstrengige breuken (DSB) en InterStrand verknopingen en de her-initiatie van DNA replicatie van ingestorte replicatievorken 1. In conventionele homologe recombinatie, wordt de centrale reactie gekatalyseerd door de ATP-afhankelijke recombinases zoals RecA in prokaryoten en Rad51 en DMC1 in eukaryoten 1-3. Deze recombinasen vormen nucleoproteïne filamenten ssDNA, die essentieel zijn voor het initiëren homologieonderzoek en streng invasie in duplex DNA-matrijzen (figuur 1, linker paneel) 4-7 zijn. Naast de gebruikelijke regeling kan homologe recombinatie ook plaatsvinden in een RecA/Rad51-independent wijze (Figuur 1, rechter paneel). Zo kan de gist Rad59 eiwitten RAD52 en direct katalyseren het hybridiseren van complementaire ssDNA strengen die worden blootgesteld door wegsnijden van dsDNA onderbrekingen. Deze recombinatie proces, bekend als zingenle streng gloeien, over het algemeen niet gepaard homoloog koppeling met dsDNA templates. Na hybridisatie worden heterologe staarten verwijderd door exonucleasen en nicks worden geligeerd aan genoom continuïteit 8-10 herstellen. Reparatie door de enkele streng gloeien mechanisme wordt vaak vergezeld door deleties van genomische sequenties tussen direct herhaalde regio.

Rad52 behoort tot een diverse groep van recombinatie eiwitten die wijdverbreid onder bacteriofagen 11. Deze eiwitten zijn ook bekend als Single Strand Gloeien Proteins (SSAPs), op basis van hun activiteit bij het bevorderen van de annealing van de homologe enkelstrengs DNA-moleculen. De beste gekenmerkt bacteriofaag SSAPs zijn Redp en Erf uit de bacteriofagen λ en P22, RecT uit de profaag rac en de Sak eiwit uit de lactococcale faag ul36. De SSAPs structureel zijn typische β-β-β-α voudig, hoewel overeenstemming vrijwel undetectkunnen in de primaire sequenties. Ze maken allemaal grote homo-oligomere ringen van 10 - 14 voudige symmetrie in vitro 12-14. De functionele implicaties van deze karakteristieke hogere orde structurele organisatie is niet goed begrepen.

Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van het mechanisme van homologe recombinatie in het mitochondriaal genoom. We hebben eerder geïdentificeerd MGM101 het gen dat essentieel is voor het behoud van mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 bleek vervolgens worden geassocieerd met mitochondriale nucleoids en is vereist voor de tolerantie van mtDNA aan DNA-beschadigende middelen 16. Echter, de studie van Mgm101 werd weer gehouden in de afgelopen tien jaar door de moeilijkheid om recombinant Mgm101 produceren. We hebben onlangs in geslaagd in het produceren van oplosbare Mgm101 op grote hoeveelheden van E. coli met behulp van de MBP-fusie strategie. Dit heeft ons in staat aan te tonen dat Mgm101 aandelenbiochemische en structurele overeenkomsten met de rad52-familie van eiwitten 17,18. In dit rapport wordt een drie-stappen zuivering procedure beschreven, die homogeen Mgm101for biochemische en structurele analyses (figuur 2) produceert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eerdere studies hebben aangetoond dat de eerste amino-terminale 22 resten van Mgm101 worden gesplitst na invoer in mitochondria 19. Voor expressie in Escherichia coli, wordt het MGM101 open leesraam zonder de eerste 22 codons geamplificeerd door PCR en stroomafwaarts geplaatst van de malE sequentie die codeert voor het maltose bindend eiwit (MBP) in een gemodificeerde versie van de expressievector pMAL-C2E. Dit genereert het MBP-Mgm101 fusie met een linker met een splitsingsplaats voor PreScission protease (Figuur 3). Het plasmide wordt eerst gebouwd door het selecteren van E. coli transformanten zonder de IPTG en Xgal blauw / witte selectie. Het resulterende plasmide pMAL-C2E-MGM101 wordt vervolgens in de E. coli stam BL21-CodonPlus (DE3)-RIL door op ampicilline en chlooramfenicol resistente kolonies.

1. Uitdrukking, Inductie, Cell Lysis en DNase I behandeling

  1. Inoculeren verse transformanten in 10 ml LB medium (1% Bacto trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl) aangevuld met glucose (0,2%), ampicilline (100 ug / ml) en chlooramfenicol (50 ug / ml). Incubeer bij 37 ° CO / N onder schudden bij 200 rpm.
  2. Inoculeer de 10 ml precultuur in 2 liter van het aangevuld LB-medium zoals hierboven. Groeien de cellen bij 37 ° C onder schudden totdat OD600 0,5 bereikt.
  3. Induceren expressie van de MBP-Mgm101 fusie-eiwit door toevoeging van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een eindconcentratie van 0,3 mM. Kweek de cellen onder schudden bij 30 ° C gedurende 5 uur.
  4. Verzamel de cellen door centrifugatie met behulp van een Beckman JA-10 rotor (5.500 xg, 4 ° C, 10 min). Na weggooien van de supernatant, resuspendeer de celpellet in 30 ml lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 en 1 mM EDTA, pH 7,4) met proteaseremmers (25 uM leupeptine, 1 pM pepstatine A, 1 mM PMSF).
  5. Ultrasone trillingen celsuspensie op ijs gedurende 20sec met behulp van een ultrasone processor (Heat Systems; Model W-385) bij 50% inschakelduur, laat afkoelen op ijs gedurende 30 seconden, en herhaal 2x.
  6. Voeg 1 ml DNAse 1 stock bij 2 mg / ml. Schommel cellysaat bij 4 ° C gedurende 2 uur.
  7. Stel NaCl tot een uiteindelijke concentratie van 500 mM.
  8. Verwijder de celresten door centrifugatie bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten.

2. Zuivering met Amylose Affiniteitschromatografie

  1. Evenwicht 1.5 ml amylose hars (50% suspensie) in de lysisbuffer. Voeg de geëquilibreerd amylose hars het cellysaat. Schommel zachtjes bij 4 ° CO / N.
  2. Laad het lysaat-harsmengsel op een Econo-kolomchromatografie kolom in een koude kamer geplaatst. Laat de ongebonden eiwitten aan de kolom passeren door de zwaartekracht.
  3. Was de amylose hars met 300 ml van de wasbuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF).
  4. Herhaal het wassen met 150 ml wasbuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF).
  5. Voeg 5 ml elutiebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF, 10 mM maltose) van de kolom, incuberen bij 4 ° C gedurende 10 min, verzamelen het eluaat en herhaal voor meerdere keren.
  6. Combineer de eluaten Bepaal de opbrengst en zuiverheid van MBP-Mgm101 door het laden van een portie van het eluaat op een SDS-PAGE gel gevolgd door Coomassie-kleuring (figuur 4).

3. PreScission proteasesplitsing en kationuitwisselingschromatografie

  1. Voeg 50 eenheden van PreScission protease aan het MBP-Mgm101 eluaat. Voer de splitsing bij 4 ° CO / N en deze te blijven tijdens dialyse tegen dialyse buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF)
  2. Controleer de efficiëntie van splitsing op een SDS-PAGE gel (Figuur 5A).
  3. Laad de gekliefde MBP-Mgm101 door meerdere injecterenionen op een Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge is aangesloten op een Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC systeem.
  4. Start de kationenuitwisselingschromatografie door een stap zoutgradiënt van 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM en 1,000 mM NaCl die wordt gemaakt door het mengen van buffer A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfaat, pH 7,2, 1 mM PMSF) en buffer B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfaat, pH 7,2, 1 mM PMSF). Stel het debiet van 0,5 ml / min. Verzamel de Mgm101 fractie en controleer de zuiverheid van het eiwit op een SDS-PAGE gel (Figuur 5B).

4. Size Exclusion Chromatography

  1. Combineer de eiwitfracties van kationenuitwisselingschromatografie. Dialyseer het eiwit in GF equilibratiebuffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF).
  2. Concentreer het eiwit met Vivaspin 15R Ultrafiltratie spinkolom om het volume op ~ 1 ml verminderen spinnen bij 3000 xg bij 4 ° C.
  3. Laad Mgm101 ona gekalibreerde Superose 6 prep kwaliteit kolom geëquilibreerd met chromatografie buffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
  4. Start de grootte uitsluiting met de chromatografie buffer draaien bij een debiet van 0,5 ml / min.
  5. Het verzamelen van de fracties van het gezuiverde Mgm101 pieken. Laad aliquots van de fracties op een 12% SDS-PAGE voor het controleren van de uiteindelijke kwaliteit van het eiwit.
  6. Concentreer het eiwit met Vivaspin 6, dan snel bevriezen van de monsters in vloeibare N2 en bewaar bij -80 ° C.
  7. Gebruik Mgm101 monsters na 6-12 maanden ssDNA-binding assay (figuur 8) en structurele visualisatie door transmissie-elektronenmicroscopie (Figuur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 een RAD52-gerelateerde recombinatie eiwit in mitochondria. Rad52 is uitgebreid bestudeerd om zijn rol in het mitochondriaal DNA recombinatie (Figuur 1). Recombinant Mgm101 kunnen worden bereid door een drie-stappen-procedure (figuur 2). Dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van het MBP-tagging strategie waarmee Mgm101 worden uitgedrukt in een oplosbare vorm en vervolgens het label vrijgegeven door proteolytische splitsing (figuur 3).

In een typische voorbereiding, kan ongeveer 2-3 mg van MBP-Mgm101 fusie worden verhaald op 1 liter bacteriecultuur na amylose affiniteitschromatografie. Op een SDS-PAGE gel wordt MBP-Mgm101 gedetecteerd als een belangrijke band van ~ 70 kDa (Figuur 4). Verontreinigende andere eiwitten is minimaal als het hars voldoende wordt gewassen, vóór de elutie. Na splitsing door PreScission Protease worden MBP en Mgm101 gescheiden en weergegeven als banden van 42 kDa en 28 kDa respectievelijkSDS-PAGE (figuur 5A). Bij onvolledige digestie, zoals aangegeven door de aanwezigheid van een ~ 70 kDa band, wordt een uitgebreide digestie met extra PreScission Protease geadviseerd.

Voor de kationenuitwisselingschromatografie afgesplitste MBP-Mgm101 wordt MBP niet vastgehouden door de kolom vóór de toepassing van het zout (figuur 6). Doorgaans wordt Mgm101 geëlueerd met 500 mM zout zonder merkbare verontreiniging met MBP (Figuur 5B). Een kleine piek bij 300 mM is soms zichtbaar, hetgeen overeenkomt met een spoor hoeveelheid ongesplitste MBP-fusie Mgm101. Het is mogelijk dat Mgm101 in deze fractie is gebonden aan contaminerende DNA, die bindingsaffiniteit reduceert tot de kolom. Zo kationenuitwisseling is een noodzakelijke stap om besmetting DNA minimaliseren.

Figuur 7 toont de laatste stap van Mgm101 zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie. De Mgm101 oligomeren typisch elueren in een monodisperse piekvan ~ 400 kDa. Sommige mutante vormen van Mgm101 worden vaak gezien met verhoogde maten tussen V0 (leeg volume) en de 400 kDa piek. De reden hiervoor is nog onbekend. Mutaties die de oligomerisatie van Mgm101 kan de vorming van aggregaten die elueren in het V0 fracties induceren. Wij hebben echter nooit pieken die overeenkomen met monomere Mgm101 gezien. Mgm101 monomeren waarschijnlijk instabiel in oplossing.

De gezuiverde Mgm101 heeft een hoge bindingsaffiniteit voor ssDNA (figuur 8). De bindingsaffiniteit voor ssDNA kan worden geschat op basis van titratie van het vrije ssDNA op de gel. De Mgm101/ssDNA complex migreert slecht uit de bronnen. Een mogelijke verklaring is dat Mgm101 positief geladen is en de binding van meerdere subeenheden van Mgm101 om ssDNA neutraliseert de negatieve ladingen die de eiwit / DNA-complexen onbeweeglijk onder elektroforese omstandigheden maakt. Wanneer adequaat voorbereid, Mgm101 bindt ssDNA met een Kd van ~ 200 nM.

Figuur 9 toont de directe visualisatie van de structurele Mgm101 gezuiverd door negatieve kleuring transmissie elektronenmicroscopie. Vers bereid Mgm101 is voornamelijk aanwezig als grote oligomere ringen met een diameter van ~ 20 nm. In plaats daarvan, de leeftijd Mgm101 monsters vormen gecomprimeerd filamenten. Deze filamenten worden niet gevormd door de eenvoudige stapelen van de ringen. Er is duidelijk een spiraalvormig patroon in de filamenten. De voorwaarden die de filamentatie proces moduleren worden momenteel onderzocht. Het is raadzaam dat de eiwitkwaliteit gecontroleerd op SDS-PAGE na de incubatie bij 4 ° C voor de verouderde monsters voordat geanalyseerd met behulp van elektronenmicroscopie.

Figuur 1
Figuur 1. Vereenvoudigd schematisch diagram dat RAD52 fungeert als een mediator voor het laden van de Rad51 recombinase op de recombinatie locatie in een canonical homologe recombinatie pathway (linker paneel), en bevordert enkele streng gloeien onafhankelijk van Rad51 (rechter paneel).

Figuur 2
Figuur 2. Algemeen schema voor de bereiding van recombinante Mgm101. Mgm101 wordt eerst uitgedrukt in E. coli in een MBP-gefuseerde vorm. Bacteriële cellen worden gelyseerd door sonicatie. DNAse I digestie DNA toegepast om verontreiniging te verminderen. De MBP-fusie Mgm101 wordt dan gezuiverd van de DNA-verarmde lysaat met behulp van een amylosekolom. Na proteolytische splitsing, wordt Mgm101 vrijgegeven en gescheiden van MBP door kationuitwisselingschromatografie. Deze stap is noodzakelijk om besmetting verder verminderen door DNA. De geëlueerde Mgm101 residu wordt gezuiverd tot homogeniteit door het door een Superose 6 prep kolom rang.


Figuur 3. Fysieke kaart van de Mgm101-expressie plasmide pMAL-C2E-MGM101. De splitsingsplaats voor de PreScission protease tussen MBP en Mgm101 wordt aangegeven. De proteolytische splitsing opbrengsten MBP en Mgm101 met een molecuulgewicht van 42 en 28 kDa.

Figuur 4
Figuur 4. SDS-PAGE die de zuiverheid van het MBP-fusie-eiwit na Mgm101 amylose affiniteitschromatografie. De eiwitconcentratie wordt bepaald door de absorptie bij 280 nm en ongeveer 5 ug Mgm101 wordt op de gel geladen. De gel is gekleurd met coomassieblauw.

Figuur 5 Figuur 5. SDS-PAGE analyse van Mgm101. A) De release van Mgm101 van de MBP-Mgm101 fusie-eiwit na splitsing met de PreScission protease. Na digestie met protease O / N, een hoeveelheid die ongeveer 5 ug eiwit geladen op de gel. De gel wordt gekleurd door Coomassieblauw. Mgm101 migreert iets langzamer dan de verwachte grootte van 28 kDa, gezien de totale positieve lading van het eiwit onder de standaard SDS-PAGE toestand. B) Mgm101 na afscheiding van MBP door kationuitwisselingschromatografie.

Figuur 6
Figuur 6. Chromatogram toont de scheiding van Mgm101 van MBP door kationenuitwisselingschromatografie. De gekliefde MBP-Mgm101 wordt geïnjecteerd in een Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge meerdere keren. Een stap zout gradiënt van 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM en 1,000 mM NaCl wordt vervolgens toegepast. Klik hier om larer afbeelding te bekijken .

Figuur 7
Figuur 7. Chromatogram toont het elutieprofiel van Mgm101 oligomeren op een gekalibreerde Superose 6 prep kwaliteit kolom. Chromatografie wordt uitgevoerd door bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min. De geëlueerde Mgm101 wordt waargenomen als een piek van ~ 400 kDa. V0: void volume. Klik hier om larer afbeelding te bekijken .

Figuur 8
Figuur 8. Elektroforetische mobiliteit shift assay waaruit blijkt dat het gezuiverde Mgm101 heeft een robuuste bindende activiteit aan ssDNA. De 1,25 x 10 -3 MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8,0, 10% glycerol, 1 mM DTT, 50 ug / ml BSA, en 1 mM PMSF. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 min, worden de monsters geladen op een 6% acrylamide gel natieve en uitgevoerd in 0,5 X TBE buffer bij 4 ° C.

Figuur 9
Figuur 9. Electronenmicroscoop waaruit blijkt dat de structurele organisatie van verse (linker paneel) en leeftijd (rechter paneel) Mgm101. Negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie wordt uitgevoerd met een JEM-2100 transmissie-elektronenmicroscoop (JEOL) werkend bij 200 kV. Voor negatieve kleuring van oude Mgm101 wordt het eiwit bewaard bij 4 ° C in het GF buffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, en 0,2 mM PMSF) gedurende 4 weken voordat ze geanalyseerd. (Met dank aan dr. Stephan Wilkens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het is een uitdaging om een stabiele, inheemse recombinant Mgm101 eiwit uit E. coli mogelijk vanwege zijn onoplosbaarheid in bacteriële cellen. In dit verslag tonen we dat het MBP-fusie-strategie kan het eiwit op een redelijk hoog niveau tot expressie. Door negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie en gelpermeatiechromatografie, hebben we eerder aangetoond dat de MBP-fusie-eiwit vormt oligomeren uniform in vitro 18. Het is mogelijk dat de vouwen en oligomerisatie van Mgm101 langzamer kunnen in de bacteriële cellen in vergelijking met de mitochondriale matrix. De unoligomerized Mgm101 kan snel vormen aggregaten die giftig zijn in vivo. MBP-tagging kunnen houden Mgm101 in een oplosbare conformatie die productief oligomerization mogelijk maakt en vermindert de toxiciteit.

Een belangrijk criterium voor een goede kwaliteit Mgm101 voorbereiding is om een ​​minimale besmetting door DNA hebben. De A 280 / A 280 / A 260 verhouding onder dit niveau, uitgebreide digestie met DNAse I wordt aanbevolen. In de toekomst kan het nuttig zijn om te zien of digestie met nuclease S1 en RNase verder kunnen verlagen contaminerende nucleïnezuren.

We hebben eerder aangetoond dat de opslag van Mgm101 bij 4 ° C gedurende enkele weken induceert de vorming van lange spiraalvormige filamenten 17. Het mechanisme van de vorming van filament is niet goed begrepen. Over-filamentatie invloed op de oplosbaarheid van het eiwit. Daarom wordt het sterk aangeraden dat monsters van vers bereide Mgm101 eiwitten snel worden ingevroren in vloeibare stikstof, gevolgd door opslag bij -80 ° C. De DNA bindingsactiviteit van het eiwit ongewijzigd blijft na 6-12 maanden opslag under deze voorwaarden.

Dit protocol kan ook gebruikt worden om mutante eiwitten bereid dan Mgm101. De oligomerisatie staat en de stabiliteit van Mgm101 worden vaak beïnvloed door de mutaties. Milde mutaties kunnen een gedeeltelijke precipitatie van de gezuiverde eiwitten op de afsplitsing van MBP veroorzaken. In deze gevallen, waardoor het volume cultuur 6 liter kan voldoende opbrengst van de stabiele gezuiverde eiwitten van grootte-uitsluitingschromatografie mogelijk. Ernstige mutaties die oligomerisatie toestaan ​​dat de productie van de eiwitten in een MBP-gefuseerde vorm, maar het eiwit niet stabiel na verwijdering van MBP.

Kortom, de huidige protocol is betrouwbaar dat hoge expressie van grote Mgm101 oligomere ringen in E. maakt coli. Dit protocol kan worden aangepast aan de productie van Mgm101 orthologen 20, 21 en andere oligomere eiwitten, vooral wanneer de oplosbaarheid van deze eiwitten is laag in de bacteriële cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Stephan Wilkens voor hulp bij transmissie elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics