非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮

この手順の全体的な目標は、サンプルに電極を接触させることなく、色素電気泳動を使用して圧力駆動の流れに懸濁した細胞の並進運動を誘導することです。これは、最初に目的の細胞を低導電率バッファーに懸濁することによって達成されます。2番目のステップは、マイクロ流体デバイスにセル懸濁液をロードし、電極チャネルに導電性の高い流体を導入することです。

次に、準備したデバイスを高電圧電子機器に接続し、倒立顕微鏡に取り付けられたカメラから供給されるビデオによって細胞の動きの周波数応答を記録します。最後のステップは、ビデオ画像を分析して、細胞の電気的特性を定量的に予測することです。最終的に、非接触ダイ電気泳動を使用して、安価で簡単に製造できるマイクロ流体デバイスを使用して、さまざまな電気的特性を持つ細胞をラベルフリーの無損傷の方法で選別できることを示しています。

したがって、この方法は、死細胞から生細胞を選別する、腫瘍を分離する、細胞を開始する、ステージに基づいて癌細胞を分離する、薬物がさまざまな細胞に及ぼす影響を調べるなどのアプリケーションに役立ちます誘電特性。蛍光活性化細胞選別などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、バイオマーカーに基づく標識を必要とせずに、細胞を固有の生物物理学的特性に基づいて選別および特性評価できること、また、電極とサンプルとの間の接触を排除することによりサンプルの無菌性を維持できることです。このアイデアは、サンプルの汚染、電気分解の高価な製造など、従来の電気泳動デバイスに関連するいくつかの問題を回避する技術を開発したいと考えたときに最初に思いつきました。

哺乳類細胞の単離用。フォトレジストと深層反応性イオンエッチングを使用して、以前に報告された手順に従って、目的のチャネル設計をシリコンウェーハにエッチングし、テフロンの薄層を堆積させてウェーハからのマイクロデバイスの放出を改善します。ウェーハをアルミホイルで包み、こぼれを防ぎます。

ポリメチルアランまたはPDMSをエラストマーと硬化剤DGAの10対1の比率で約20分間混合し、ウェーハに注ぎます。次に、冷却後にスタンプのテフロンコーティングが損傷しないように、ウェーハを摂氏100度で45分間加熱します。アルミホイルをはがします。

外科用ブレードを使用してPDMSをトリミングし、チャネル入口出口にアクセス穴を開けます。ここではチューブのサイズに適したブラントパンチャーを使用し、1.5mmのブラントパンチャーを使用します。次に、テキストプロトコルの指示に従って、ガラス顕微鏡スライドをクリーニングします。

Scotch Magicテープを使用してPDMSデバイスをクリーニングします。顕微鏡で調べて、チャネルがきれいであることを確認します。次に、スライドとPDMSデバイスをエアプラズマに2分間さらし、デバイスのチャネル側をスライドガラスにしっかりと押し付け、デバイスとスライドの間に気泡が形成されないようにします。

テキストプロトコルで説明されているように、DEPバッファーと呼ばれる低導電率バッファーを準備します。ここでは癌性、後期マウス、卵巣表面上皮、またはコケL細胞を1ミリリットルあたり300万個の細胞でDEP緩衝液に懸濁し、蛍光膜を用いて細胞を死滅させた後に使用します。透過性色素は、dy細胞懸濁液の導電率を測定します。

導電率は約100マイクロジーメン/センチメートルである必要があります。導電率の測定が高すぎる場合は、サンプルをスピンダウンします。Resusはデプスバッファーに懸濁し、導電率測定を繰り返します。

このプロトコルの最も難しい側面は、電極チャネル内の気泡を避けることであり、電極チャネル内のサンプルチャネルの気泡はエレクトロホール接続を防ぎ、サンプルチャネル内の気泡は安定した流れを妨げる可能性があります。Cディップマイクロ流体チップをロードする前に、気泡を避け、安定した流れを確保するために、示されている手順を必ず実行してください。真空下で30分間置きます。

その間、シリンジポンプからマイクロ流体チップが配置される顕微鏡ステージまでの距離にまたがるように、フレキシブルチューブを切断します。6インチの長さのチューブが必要です。チューブをシリンジの針先に取り付けます。

次に、ターゲット収集サンプル量をチューブの断面積で割ることにより、アウトレットチューブに必要な長さを推定します。必要な長さのチューブをカットします。次に、細胞懸濁液を注射器に引き込みます。

チューブまたはシリンジに気泡がないことを確認してください。チップを真空から取り出したら、アウトレットチューブを挿入し、サンプルチャネルをすばやくプライミングします。チャネルに気泡が閉じ込められないように、プライミング時にシリンジを軽くたたきます。

電極チャネルをプライミングするための薄い絶縁バリアの破裂を避けるために、各流体電極チャネルの1つの出口に空のピペットチップをすばやく配置します。ピペットは、少量の臭素B.Andを含んでおり、電極チャネルの反対側の端に流体を導入するために軽くたたいてます。臭素Bを含むPBSが空のピペットチップの先端を目に見えて進行するまで、穏やかな圧力を維持し、電極ごとに繰り返します。チャネルRドミンBは蛍光性にのみ使用されます。

プライミング後の流体電極チャネルを視覚化します。各ピペットチップリザーバーにPBSを充填し、RドミンB.ピペットチップリザーバーでの気泡形成を避け、ピペットを静かに上下させて目に見える気泡を取り除きます。アウトレットチューブを取り外し、適切に廃棄します。

次に、新しいアウトレットチューブリザーバーを挿入します。ターゲットボリュームを収集します。デジタルカメラを搭載した倒立顕微鏡のステージにチップを配置します。

シリンジをシリンジポンプに取り付け、ワイヤー電極を流体電極チャネルリザーバーに挿入し、1時間あたり1ミリリットルで流体をポンプで送り込み、シリンジポンプとシリンジの間の良好な接触を確保します。チャネルの長さを目視検査して、セルの流れが妨げられず、気泡や漏れがないことを確認します。次に、流量を毎時5マイクロリットルに減らします。

安全のために。ファンクションジェネレータ、高電圧アンプ、オシロスコープの電源を入れ、目的の電圧と周波数に調整して、電子機器をテストします。ここで、これらのパラメータは200ボルトと20キロヘルツです。

許容可能な性能を確認したら、電源を切ります。次に、電極を高電圧アンプに接続します。安定した流れを達成したら、目的の周波数で目的の電圧を印加します この実験では、電圧は 5 〜 60 キロヘルツの周波数で 200 ボルト RMS です。

画像処理技術を用いて細胞応答のビデオファイルを記録し、チャネル内の細胞分布を定量化し、クロスオーバー周波数を特徴付けます。これを行うには、一定の電圧を維持し、実験の開始時と終了時、および実験の実行間でランダムに周波数を系統的に変化させます。電界を印加しないセルの分布である制御セルの分布を記録します。

新たな周波数を待機させた後、細胞が入口から監視対象位置に流れるのに必要な時間分だけ記録を開始し、テキストプロトコルに記載されているようにクロスオーバー周波数を特徴付けるための画像処理を行い、所望の混合物をDEP緩衝液中に総濃度300万粒子/ミリリットルで懸濁する。ここで、この混合物は、DEP緩衝液中に4マイクロメートルの蛍光ビーズを含むコケL細胞であり、前述の手順を実行する。CEPデバイスを調製するには、ターゲット細胞と背景粒子の2つの決定された交差周波数の間の周波数で実験を操作して、2つの粒子集団が反対方向にDEP力を受けるようにします。

アソートサンプルの内容物を収集するには、ターゲットボリュームの収集時に、グローブフィンガーを出口開口部に置き、チューブをそっと引っ張って、出口チューブを取り外します。収集したターゲットボリュームをリザーバーに注ぎ、さらに分析します。哺乳類のがん細胞では、ここで最も多く使用されているL細胞のように、5キロヘルツで陰性のDEPが観察され、強い陽性のDEPが観察されました。

60キロヘルツのMOS Lセルの直径は17.7±3.3マイクロメートルで、ビーズの公称直径は4マイクロメートルです。この手法は、細胞のクロスオーバー周波数を決定するだけでなく、MO'S L細胞とビーズの混合物によってここに示されている混合物を選別するためにも使用できます。この例では、MO'S L細胞が正の誘電泳動を経験する周波数で、4つのマイクロメートルビーズが示す負の誘電泳動を利用しています。

デバイスを200ボルトRMSと10キロヘルツで操作したとき、ここに緑で示されているセルとここに赤で示されているビーズの両方が混合され、50キロヘルツで負のDEPが発生しました。MOS L細胞のチャネル上部への移動が観察されましたが、ビーズはチャネルの下部に限定され、混合物を2つの成分に分離することができました。したがって、この手順に続いて、細胞培養や免疫蛍光イメージング、生化学的アッセイなどの他の手法を下流で実施して、誘電特性が細胞の物理的特性とどのように相関するかなどの追加の質問に答えることができます。

したがって、その開発後、この技術は、生物学者がマウス卵巣がんモデルを使用して、細胞の細胞骨格の代謝物誘発性変化がそれらの誘電特性とどのように相関するかを研究する道を実際に開きました。このビデオを見れば、非接触電気泳動を使用して細胞を濃縮し、選別する方法を十分に理解できるはずです。