Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pelet, S., Aymoz, D., Durandau, E. Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells. J. Vis. Exp. (80), e50637, doi:10.3791/50637 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De kwantificering van genexpressie op het eencellige niveau onthult nieuwe regulerende mechanismen verduisterd in de metingen uitgevoerd op populatieniveau. Twee methoden op basis van microscopie en flowcytometrie worden aangetoond hoe dergelijke gegevens kunnen worden verkregen. De expressie van een fluorescerende reporter geïnduceerd na activering van de hoge osmolariteit glycerol MAPK route in gist wordt gebruikt als een voorbeeld. De specifieke voordelen van elke methode worden gemarkeerd. Flowcytometrie meet een groot aantal cellen (10.000) en een directe maat voor de dynamiek van eiwitexpressie onafhankelijk van de langzame rijping kinetiek van het fluorescerende eiwit. Beeldvorming van levende cellen door microscopie is daarentegen beperkt tot het meten van de gerijpte vorm van de reporter in minder cellen. Echter, de datasets gegenereerd door deze techniek zeer rijk dankzij de combinatie van meerdere reporters en de ruimtelijke en temporele informatieverkregen van individuele cellen. De combinatie van deze twee meetmethoden kunnen nieuwe inzichten in de regulatie van eiwitexpressie leveren door signaalwegen.

Introduction

Signalering via transductie cascades vaak culmineert in de expressie van eiwitten. De karakterisering van deze expressieprofiel is een belangrijk element in het begrijpen van de functie van biologische wegen. De identificatie van het spectrum van up-gereguleerde eiwitten en de dynamiek van hun activering kan worden bereikt door verschillende technieken, zoals micro-arrays, Northern blots en Western-blots 1-3. Echter, deze technieken gemiddelde van de respons van een gehele celpopulatie. De fijne regeling van de expressie van eiwitten te begrijpen, is het wenselijk om metingen te verzamelen op enkele cel. Idealiter zouden deze metingen ook kwantitatieve gegevens vatbaar voor wiskundige modellen van de onderliggende route ontwikkelen.

Microscopie en flowcytometrie zijn twee technieken die ideaal zijn voor dergelijke kwantitatieve cel metingen leveren. De endogene labelen van proteïnen met een fluorescerend eiwit kan be gebruikt om hun expressie niveau 4 te kwantificeren. Aangezien de toevoeging van een grote fluorescente groep aan het uiteinde van het eiwit niet meer werkt kan weergeven, is het vaak wenselijk om specifieke expressie reporters basis van een promotor die de expressie van een fluorescente construct te genereren. Deze verslaggever eiwit is exogeen aan het cellulaire systeem en dus niet de signalering evenementen die plaatsvinden in de cel beïnvloeden.

Zowel microscopie en flowcytometrie zijn op grote schaal gebruikt in de signaleringsveld gist. Als voorbeelden, Colman-Lerner en collega gecorreleerd, in enkele cellen, de expressie van specifieke paring en constitutief tot expressie reporters door microscopie om de ruis in gist paring signaaltransductiecascade 5 kwantificeren Acar en collega's flowcytometrie om de regelgevingsnetwerk bestuderen die de expressie van GAL genen 6. In een eerdere studie 7, hebben we een combinati gebruiktop van deze twee technieken om de uitdrukking uitgang bestuderen van de hoge osmolariteit glycerol (HOG) route in gist. Dit mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) route wordt geactiveerd door hyper-osmotische stress. Het resulteert in de activatie van de MAPK Hog1, die naar de kern van de cel om transcriptie programma resulteert in de expressie van ongeveer 300 genen induceren. Om dit te bestuderen, hebben we een uitdrukking reporter gebaseerd op STL1 promoter (een gen dat specifiek geïnduceerd in respons op Hog1 activiteit 8) de expressie van een viervoudige Venus fluorescerend eiwit (p STL1-qV) ontworpen. Flowcytometrie metingen ontdekt de aanwezigheid van twee populaties van cellen op intermediair spanningsniveau (0,1 M NaCl) met slechts een fractie van de populatie de expressie fluorescerende reporter. We gebruikten microscopie om dit gedrag verder te onderzoeken en ontdekte dat dit geluid in eiwit expressie werd bestuurd door intrinsieke factoren 9. We could verder zien dat cellen met een vergelijkbaar niveau van Hog1 activiteit opvallend verschillende uitkomsten uitdrukking konden geven. De combinatie van deze twee technieken konden we aantonen hoe de langzame verbouwing van stress respons genen van invloed op de expressie uitkomst op de enkele cel niveau 7.

In dit document gebruiken we de expressie van het p-STL1 qV reporter geïnduceerd door hyper-osmotische shock als voorbeeld van de kwantificering van eiwitexpressie door microscopie en flowcytometrie. Dezelfde stam blootgesteld aan 0,2 M NaCl spanning werd onderzocht met beide technieken. Dit zal ons toelaten om een ​​aantal belangrijke verschillen in deze twee zeer complementaire technieken te markeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microscopie Metingen

  1. Inoculeer 5 ml synthetisch medium met gist.
  2. Groeien cellen bij 30 ° C gedurende de nacht.
  3. Meet de OD 600 van de overnacht cultuur de volgende ochtend.
  4. Verdunnen overnacht cultuur in 5 ml synthetisch medium om OD600 0,05.
  5. Groeien de verdunde cultuur bij 30 ° C gedurende ten minste 4 uur.
  6. Bereid 3-voudig geconcentreerd (0,6 M) NaCl-oplossing in synthetisch medium.
  7. Bereid een 1 mg / ml oplossing van Concanavaline A (ConA) in PBS.
  8. Het filtraat -200 pl ConA oplossing in de put dia.
  9. Laat staan ​​voor 30 minuten.
  10. Verwijder ConA oplossing.
  11. Voeg 150 ul H2O aan de put.
  12. Verwijder H2O
  13. Meet OD 600 van celkweek.
  14. Bereid 300 ul van celkweek bij OD 600 = 0,02 in een 1,5 ml microbuis.
  15. Ultrasone trillingen de cellen in een waterbad gedurende 45 sec.
  16. Vortex kort de microtube.
  17. Ultrasone trillingen de cellen in een waterbad gedurende 45 sec.
  18. Vortex kort de microbuis.
  19. Voeg 200 ul van celkweek aan de put.
  20. Wacht 30 minuten te laten de cellen naar de bodem van de put.
  21. Plaats de goed dia op de microscoop.
  22. Selecteer de belichtingsinstellingen voor de fluorescerende kanaal op te nemen.
  23. Selecteer de belichtingsinstellingen voor twee heldere veld beelden (een enigszins onscherp: 3 micrometer onder de focal plane te zorgen voor een goede segmentatie van de cellen).
  24. Selecteer de tijdsintervallen voor de time-lapse-meting
  25. Selecteer de velden die gezien op de foto.
  26. Start de verwerving van een paar frames.
  27. Pauzeer de overname van de 100 pi van 0,6 M NaCl medium toe te voegen.
  28. Resume beeldvorming.

2. Flowcytometrie Metingen

  1. Inoculeer 5 ml synthetisch medium met gist.
  2. Groeien bij 30 ° C gedurende de nacht.
  3. Maatregelde OD 600 van de overnacht cultuur de volgende ochtend.
  4. Verdunnen overnacht cultuur in 5 ml synthetisch medium OD 600 0.1.
  5. Groeien bij 30 ° C gedurende ten minste 4 uur tot een OD600 van 0,2-0,4 bereikt.
  6. Bereid cycloheximide oplossing 1 mg / ml in H2O
  7. Bereid 3-voudig geconcentreerd (0,6 M) NaCl-oplossing in synthetisch medium.
  8. Bereid een 1,5 ml microbuisjes met 100 ul van 0,6 M NaCl medium voor elk tijdstip te meten.
  9. Op tijdstip 0, voeg 200 ul celkweek aan elke microbuis.
  10. Incubeer onder schudden bij 30 ° C.
  11. Op tijdstip T, voeg 30 pl cycloheximide een microbuis.
  12. Herhaal stap 2.11 voor alle gewenste tijdstippen.
  13. Incubeer alle microbuisjes gedurende tenminste 45 minuten en tot 3 uur bij 30 ° C onder schudden.
  14. Bereid FACS buizen met 400 ul PBS.
  15. Ultrasone trillingen de cellen in een waterbad gedurende 1 minuut.
  16. Vortex kort de microtubes.
  17. Zooncaat op de cellen in een waterbad gedurende 1 minuut.
  18. Vortex kort de microtubes.
  19. Voeg 100 ul celkweek uit elke microbuisje naar de bijbehorende FACS buis.
  20. Selecteer de 488 nm laser excitatie en 530/30 nm banddoorlaatfilter voor detectie.
  21. Test niet tot expressie en volledig uitdrukken steekproef om te controleren of ze vallen in de gevoeligheid detector bereik.
  22. Meet 10.000 cellen voor elk verworven monster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microscopie

Gist cellen die de expressie reporter p STL1-qV (ySP9 7) zijn bevestigd aan de bodem van de put-glijbaan en onder de microscoop geplaatst. De cellen werden gestimuleerd door toevoeging van stress medium direct in de put tijdens de opnamesessie. Dit stelt ons in staat om een ​​paar beelden van de cellen te verwerven voor pathway inductie en volg hun lot na de stimulatie. In het onderhavige geval werden de cellen gevolgd ~ 2 uur met een tijdsinterval van 10 minuten. Figuur 1A is een afbeelding van niet fluorescerende cellen voor de inductie en Figuur 1B toont dezelfde cellen 2 uur na stress als de uitdrukking verslaggever geïnduceerd en fluorescerend geworden.

De kwantitatieve informatie die in deze beelden extract, een complex beeldanalyse proces moet worden uitgevoerd. Het omvat de segmentatie van de cellen aan objecten in de i definiërenmage, het volgen van deze objecten van het ene frame naar de volgende en de metingen van de kenmerken van deze objecten (vorm en intensiteit eigenschappen). Wij hebben onze eigen platform genaamd YeastQuant ontwikkeld om deze analyse uit te voeren 10. Een paar andere niet-commerciële software zijn beschikbaar om deze taken uit te voeren:. CellProfiler 11, CellID 12 of CellX 13 Figuur 1C toont de resultaten van een analyse uitgevoerd met YeastQuant. Elke rode spoor is de temporele evolutie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een enkele cel. De blauwe lijn geeft de mediaan van meer dan 500 cellen die werden gesegmenteerd en bijgehouden gedurende de 20 frames van vijf time-lapse filmpjes overgenomen van vijf verschillende gebieden van uitzicht vanuit dezelfde put. Het lichtblauwe gebied vertegenwoordigt de 25e en 75e percentiel van alle intensiteiten gemeten op een bepaald tijdstip.

Flowcytometrie

Voor flowcytometrie measuremouders, de celkweek werd gemorst in microtubes met de stress medium. Om de temporele evolutie van de p-STL1 qV expressie te bestuderen, werd de translatie geremd op verschillende tijdstippen (5 tot 10 minuten intervallen) met cycloheximide (Figuur 2). Dit medicijn blokkeert de synthese van nieuwe eiwitten, maar de rijping van het fluorescerende eiwit al uitgesproken wordt niet verstoord. Dus na 45 minuten tot een uur incubatie van de cellen kan worden gemeten in de flowcytometer waardoor kwantificatie van de hoeveelheid eiwit geproduceerd bij de cycloheximide toevoeging. Deze strategie omzeilt het probleem van fluorescente proteïne rijping en daarmee kwantificeert de werkelijke dynamica van fluorescente eiwitsynthese.

Vergelijking van de twee technieken

Figuur 3A vergelijkt de dynamiek van de expressie reporter gemeten met microscopie en flowcytometrie. Terwijl het fluorescentiesignaal begint te stijgen 30-40min na belasting met microscopie, de flowcytometrie metingen duidelijk aantonen dat de eiwitten al produceerden tussen 10 tot 15 minuten na de stimulus. Dit half uur vertraging wordt veroorzaakt door de langzame rijping van de fluorescerende eiwitten 14. Hoewel beide methoden kwantificeren van de fluorescentie-intensiteit van de cellen, moet men bedenken dat in dit onderzoek, zij niet dezelfde biologische proces te meten. Terwijl microscopie volgt de verschijning van het fluorescentiesignaal, de flowcytometrie daadwerkelijk kwantificeert de synthese van het eiwit. Het is essentieel om rekening te houden met deze rijpingstap bij het uitvoeren live cell imaging. In een situatie waarin een endogeen eiwit gelabeld met een fluorescerend eiwit, zal de endogene proteïne uitgedrukt en gezien vóór de fluorescentie van het label kan worden gedetecteerd.

Zoals hierboven aangegeven, beide technieken leveren aanvullende informatie. Flowcytometrie kan zeer snel een groot aantal cellen te meten (10.000 of meer). Derhalve kan leveren statistisch rijke datasets waar twee overlappende populaties kan worden geïdentificeerd of een paar zeldzame gebeurtenissen kan worden waargenomen. Microscopie geeft informatie over een beperkt aantal cellen (in de orde van 100). Echter, omdat deze dataset bevat temporele en ruimtelijke informatie en laat de correlatie van meerdere metingen in dezelfde cel, kan het zeer waardevolle inzichten in de onderzochte biologische proces bieden.

Figuur 1
Figuur 1. Meting van reporter expressie door microscopie. A en B. Afbeeldingen van cellen die het fluorescerende uitdrukking verslaggever p STL1-qV voor (A) en 2 uur na stimulatie met 0,2 M NaCl (B). C. Tijdsverloop van de griep orescence verschijning. De rode lijnen geven de gemiddelde cellulaire fluorescentie-intensiteit van een aantal representatieve enkele cel sporen. De blauwe curve geeft de mediaan fluorescentie van 550 eencellige sporen. Het lichtblauwe gebied vertegenwoordigt de 25e en 75e percentiel van de tl-expressie van de cel bevolking op elk tijdstip. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Meting van reporter expressie door flowcytometrie. Histogrammen van de cellulaire fluorescentie van cellen die de expressie fluorescerende reporter p STL1-qV behandeld met 0,2 M NaCl en geremd met cycloheximide op verschillende tijdstippen.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Vergelijking van de dynamiek expressie gemeten door microscopie en flowcytometrie. A. gemiddelde fluorescentie-intensiteit gemeten met flowcytometrie (getrokken lijn) en microscopie (stippellijn) als functie van de tijd voor drie biologische herhalingen. De fout balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. B en C. histogrammen van de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit bij 120 min na stress voor de microscopie (B) en 60 min na belasting voor flowcytometrie (C) voor de drie herhalingen. Klik hier omBekijk grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microscopie

De behandeling van het goed met ConA is een essentiële stap voor een goede beeldvorming van de cellen te waarborgen. Omdat ConA is slecht oplosbaar in PBS (5 mg / ml), het filtratieproces kan de verwijdering van grote aggregaten die in de ongefilterde oplossing zijn en storen de beeldvorming. Cellen hechten relatief sterk aan het behandelde oppervlak en de toevoeging van de inducerende oplossing niet de lokalisatie van de cellen te verstoren, waardoor een continu volgen voor en na de stimulus. Deze behandeling kan ook worden toegepast op kanalen en microfluïdische inrichtingen vloeien werden de cellen onderworpen aan een constante stroom 7,15. Als de put niet goed gespoeld met water na de behandeling, zullen de cellen niet goed hechten aan het glas, vermoedelijk omdat de ConA in oplossing direct bindt aan de cellen en voorkomt dat ze een sterke binding aan het glazen oppervlak te vormen. Na de wasstap, kan het goed droog blijven gedurende 3 -4 uur voor de toevoeging van de cellen zonder merkbaar beïnvloeden de binding van de cellen aan het glas.

De keuze van de belichtingstijd van de fluorescerende kanaal is een kritische instelling voor het succes van het experiment. Omdat de fluorescentie van de cel gedurende het tijdsverloop zal toenemen, is het belangrijk om vooraf te testen met een geïnduceerde monster wat de maximale belichtingstijd die kan worden gebruikt om verzadiging van de beelden tijdens de acquisitie voorkomen. Een andere parameter om rekening te houden bij de keuze van de belichtingstijd is het bleken van het fluorescerende signaal. Voor elk monster, moet men een trade-off tussen helderheid van het beeld en de degradatie van het signaal ten gevolge van het bleken tijdens de time-lapse te vinden. Het tijdsinterval tussen elke acquisitie beïnvloedt ook sterk het bleken van de fluorofoor. Omdat eiwit expressie is een relatief langzaam proces, we gebruiken meestal 10-15 minuten. intervallen. Als andere snellere processen moeten worden followed parallel aan de proteïne-expressie, is het misschien raadzaam om verschillende tijdstappen gebruikt in de hele time-lapse filmpje (1-2 min aan het begin en 5-15 min voor latere acquisities).

De regeling van de celdichtheid is een zeer belangrijke factor om rekening te houden. Als de dichtheid te laag is, zal slechts weinig cellen aanwezig in elk gezichtsveld resulteert in slechte statistieken voor de gegevensset. Indien de dichtheid te hoog is, kan de segmentatie, tracking en kwantificering van de cellen belemmeren, waardoor het moeilijk om de gewenste informatie uit de beelden. De zaaidichtheid bepalen, een extra parameter rekening te houden is de duur van het experiment. Indien een experiment duurt meerdere divisie cycli, is het raadzaam om te beginnen met een dun gezichtsveld dat geleidelijk vullen in het tijdsverloop van de beeldvorming door deling van de cellen en afwikkeling van cellen in oplossing. In het protocol, raden we ueen OD 600 van 0,02, afhankelijk van het type experiment voeren we gebruiken we OD600 van 0,05 voor een korte time-lapse filmpjes tot 0,005 langer degenen.

Het aantal geanalyseerde cellen duidelijk een belangrijke parameter voor de geldigheid van het experiment. Soms zo weinig als 20-30 cellen samengevoegd tot een gegevensset te genereren. Echter, om te beginnen met statistisch significante datasets, een honderdtal cellen of meer zijn waarschijnlijk noodzakelijk. De vergroting van het doel bepaalt de grootte van de afgebeelde en aldus het aantal afgebeelde cellen. Voor eiwitexpressie metingen, waarbij het doel is om de gemiddelde fluorescentie van de cel te meten, een hoge numerieke apertuur 40X immersie objectief is de beste oplossing die zowel goede signaal-ruisverhouding en een groot gezichtsveld. Als sub-cellulaire structuren te analyseren hogere vergroting (60x of 100x) zijn vaak nodig, wat resulteert in de meting van minder cellen. De komst van iGMOS camera met een maat detector bijna vier keer groter dan die van conventionele CCD duidelijk een voordeel om meer cellen per veld vinden.

Met een gemotoriseerde XY-fase, is het mogelijk om het parallel meerdere gebieden om het aantal cellen in het uiteindelijke dataset verhogen. Echter, er is een compromis tussen het aantal XY posities bezocht en de snelheid van de beeldopname. Afhankelijk van de snelheid van het toneel en het aantal verlichting opgenomen, is het meestal mogelijk om beeld tien posities in minder dan een minuut. Te kwantificeren snelle signalering gebeurtenissen, kan dit een beperkende factor geworden. Voor eiwitexpressie metingen waar fluorescentieveranderingen gebeuren langzamer tijdschaal is meestal niet een beperking. Ook omdat deze expressie-experimenten voor een paar uur en vanwege de langzame temporele resolutie vereist, wordt het voordelig om het meerdere monsters tegelijk. Meerdere naburige putten can worden geënt met wildtype en mutante cellen kunnen verschillende stimulus worden toegepast op elk putje of biologische duplo worden gemeten parallel. Scannen via alle putjes van een 96-wells plaat wordt routinematig bereikt met lucht doelstelling voor microscopie schermen 16. Door de lage abundantie van endogene eiwitten in gist, de kwantificering vereist olie-objectief met een hoge numerieke apertuur. Dit beperkt sterk het bereik dat kan worden afgelegd met de doelstelling. Toch we regelmatig image vier naburige putten door dicht bij hun gemeenschappelijke hoek. Het is echter moeilijker om de afbeelding een groter aantal putten. Doelstellingen water met automatische dispensers kan dit probleem te omzeilen ten koste van een klein verlies in helderheid.

Flowcytometrie

Het verzamelen van een voldoende aantal cellen is nauwelijks een probleem flowcytometers. Typisch 10.000-100.000 cellen kunnen worden verworven in een minuut. Echter, omdat er geen beeld van tHij cel wordt verkregen, is het belangrijk om goed de celpopulatie te analyseren selecteren. Gating van de cellen op basis van de gemeten voorwaartse en zijwaartse scatters kunnen laten individuele cellen dan clusters van cellen te selecteren en celresten uit de analyse verwijderd. In figuur 2, elk histogram vertegenwoordigt een populatie van ongeveer 5.000 cellen, die werden geselecteerd op verstrooiing eigenschappen van 10.000 gebeurtenissen gemeten.

Door het afbreken clusters van cellen in individuele cellen, sonicatie van de celkweek is een extra manier om de kwaliteit van de verkregen gegevens te verbeteren. Dit geldt voor microscopie waarbij clusters van cellen met zeer moeilijk te segmenteren zijn. De duur van deze stap moet experimenteel getest. We meestal voeren twee rondes van sonificatie in een waterbad van 30 seconden tot een minuut, gevolgd door vortexen van de celsuspensie. Langdurige sonicatie kan resulteren in de lyse van enkele cellen. Echter, hebben we niet observe een up-regulatie van stress responsieve genen door deze experimentele stap. Merk op dat de samenvoeging van de cellen is een achtergrond afhankelijke fenotype, bijvoorbeeld W303 cellen vertonen een sterkere neiging tot aggregatie dan S288C cellen.

Variabiliteit in enkele cel metingen

In figuur 3A, wordt de gemiddelde en standaardfout voor van drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd door flow cytometrie en microscopie uitgezet. De kleine verschillen tussen de drie krommen voort uit het feit dat de experimentele fouten relatief klein voor deze eenvoudige metingen en dat vele cellen gemeten (meer dan 5000 voor flowcytometrie, tussen 370-550 voor microscopie). De temporele evolutie van de microscopie curven is gladder dan die van de flowcytometrie gegevens. Een waarschijnlijke reden voor dit gedrag is de steekproef voorbereidingsproces. Voor microscopie, alle tijdstippen in een experiment het gevolg zijn van dezelfde spanning evenement, terwijl het voorde FACS, het monster voor elk tijdstip wordt individueel benadrukt. Kleine variaties in het volume van de stress en kweekoplossingen kan een klein verschil in genexpressie uitgang. Een alternatieve strategie zou zijn om 5 ml cultuur van cellen te benadrukken en te verwijderen hoeveelheden op de gewenste tijd te remmen met cycloheximide. Beide methoden werken goed, we gebruiken de microbuis bereidingswijze, want het biedt meer flexibiliteit en is ook zeer geschikt voor de metingen van dosis-respons curves waar meerdere NaCl-concentraties gemeten moeten worden in parallel.

Het lage geluidsniveau in die gemiddelde bochten echter niet overeen met het volledige gamma van variabiliteit aanwezig zijn op de enkele cel niveau. In figuur 3B en 3C, de histogrammen van de expressie gemeten met microscopie en flowcytometrie op een tijdstip uitgezet. Deze twee panelen illustreren ook dat de technische verschillen tussen herhaalde relatief klein, especially in vergelijking met de grote variabiliteit waargenomen in de expressie van individuele cellen. Het verschil in de vorm van de verdeling tussen de microscopie en flowcytometrie metingen voort uit het feit dat met flowcytometrie de totale cellulaire intensiteit wordt bepaald, terwijl in de microscopiebeelden de gemiddelde cellulaire intensiteit werd berekend. Deze laatste meting gemiddelden uit verschillen in celgrootte en dus resulteert in smallere distributies.

De twee technieken die hier gepresenteerd laten kwantitatief bestuderen gedrag van enkelvoudige cellen. Deze functie wordt meestal verborgen in de traditionele biologische metingen uitgevoerd op populatieniveau. Begrijpen hoe de variabiliteit in de respons van individuele cellen ontstaat kan belangrijke inzichten in de complexe regulatie van biologische processen te bieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs danken Matthias Peter en zijn groep aan het Instituut voor Biochemie aan de ETH in Zürich, waar deze methoden zijn ontwikkeld. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base ForMedium CYN6202
CSM amino-acid mix ForMedium DCS0011
Concanavalin A GE Healthcare 17-0450-01
Cycloheximide Fluka Aldrich Sigma C7698 Toxic
ySP9 W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34 pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope Nikon Ti-Eclipse
Microscope control software Micro-manager Ver 1.4.11
Incubation chamber LIS The Box
Fluorescence light source Lumencor SpectraX
Camera Hamamatsu Flash 4.0
Flow cytometer BD FACS calibur
Sonicator bath Telesonic TUC-150
8-well-slide Thermo Lab-tek 155409
96-well-plate Matrical bioscience MGB096-1-2-LG
FACS tube BD Falcon 352054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11, (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427, (6972), 370-374 (2004).
  3. Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425, (6959), 737-741 (2003).
  4. Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310, (5746), 310-314 (2005).
  5. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  6. Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435, (7039), 228-232 (2005).
  7. Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332, (6030), 732-735 (2011).
  8. de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23, (1), 229-237 (2003).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, (10), 1274-1282 (2012).
  11. Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7, (10), R100 (2006).
  12. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
  13. Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. (2012).
  14. Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7, (5), 557-562 (2003).
  15. Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (20), 7165-7170 (2008).
  16. Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, (9), 690-696 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics