생분해성 폴리머 입자의 림프절 내 주입

이 절차의 전반적인 목표는 직접 주사 기술을 사용하여 생체 재료 백신 입자를 림프절에 증착하는 것입니다. 먼저, 이중 에멀젼 방법을 사용하여 지질 안정화 고분자 입자를 합성합니다. 그런 다음 입자를 세척하고 크기, 화물, 적재 또는 안정성과 같은 재료 특성을 측정합니다.

다음으로, 마우스의 꼬리 기저부에 추적자 염료를 투여하여 염료를 림프절로 배출한 후 시각화할 수 있도록 합니다. 마지막 단계는 D 표지된 림프절을 확인하고 이 위치에 소량의 고분자 입자를 주입하는 것입니다. 조직학, 면역형광 및 컨포칼 현미경 검사를 사용하여 서혜부 림프절에서 입자의 존재 및 분포를 확인할 수 있습니다.

백신 접종을 위해 림프절과 생체 재료를 직접 주사하면 림프절 미세환경에서 백신 성분의 조합 및 용량을 엄격하게 제어할 수 있으며 이러한 조직에서 화물의 방출을 제어할 수 있습니다. 모든 백신이 림프절에 도달해야 효과가 있습니다. 따라서 생체 재료와 통합된 면역 신호가 국소 림프절 신호에 어떻게 영향을 미치는지 정의하는 것은 이러한 이벤트를 전신 면역 반응과 연결하는 데 중요합니다.

이 지식은 생체 재료 백신이 기존 경로를 따라 투여되는 방식을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 생체 재료의 림프절 내 전달은 림프절 조직에 대한 생체 재료의 영향을 연구하는 도구 역할을 하지만, 이 플랫폼은 암 및 자가면역 질환을 대상으로 하는 새로운 치료 백신 및 면역 요법을 개발할 수 있는 응용 기회도 제공합니다. 미세 입자의 경우 12 와트의 얼음 위에 고분자, 지질 및 기타 물 불용성 화물을 포함하는 유기상

물과 오일 에멀젼을 만들려면 1 밀리그램의 펩타이드 단백질 또는 기타 수용성화물을 포함하는 500 마이크로 리터의 증류 된 H2O 또는 H2O를 첨가하십시오. 30초 동안 계속 음행하십시오. 완전한 유화를 보장하기 위해 바이알을 에이터 팁 주위를 좌우로 부드럽게 흔듭니다.

지금 물 기름 유화액을 16, 000 분당 회전수에 3 분 동안 균질화한 H2O의 40 밀리리터로 따서 물 그리고 기름을 준비하십시오. 다음으로, 마그네틱 교반 막대를 추가하고 물 에멀젼에 물과 오일을 밤새 저어 하룻밤 동안 용매를 제거한 후 과도한 용매를 제거합니다. 40 미크론 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 에멀젼을 50 밀리리터 원뿔형 튜브 원심 분리기에 5 분 동안 붓고, 상층액을 디캔팅하고, 1 밀리리터의 물에 입자 펠릿을 재현탁 시키고, 부유 입자를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.

5분 원심분리로 입자를 수집합니다. 레이저 회절 또는 광 산란으로 입자 크기를 측정합니다. 분획 셀에 첨가된 물의 양은 10마이크로리터의 입자 현탁액을 분획 셀에 정렬하고 블랭킹하기에 충분한 수준입니다.

입자 크기 분석기 구획 도어를 닫습니다. 그런 다음 PLGA의 입자 크기를 측정합니다. 굴절률 1.60을 사용합니다.

소프트웨어 인터페이스를 사용하여 주입 하루 전에 숫자 기준으로 입자 직경을 계산할 수 있습니다. IACUC이 승인한 동물 프로토콜에 따라 마우스를 마취합니다. 발가락으로 마취의 깊이를 평가합니다.

핀치 반사 검사 및 호흡 모니터링 및 모니터링 하여 분당 100-120회의 호흡 속도를 보장합니다. 꼬리 밑부분과 뒷다리 부분의 털을 면도하십시오. 동물의 복부 쪽에서 털을 제거하고 뒷다리 관절 바로 위의 등 쪽으로 옆으로 털을 제거합니다.

각 염료 주입에 대해 마이크로 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 염료 용액을 마이크로센터 퓨지 튜브로 옮기고 31게이지 바늘을 통해 10마이크로리터 전체를 1밀리리터 인슐린 주사기로 흡입합니다. 이제 10 마이크로 리터의 염료 용액을 꼬리 바닥의 각 측면에 피하로 주입하여 주사 사이에 적재합니다. 순한 제모 크림을 바르고 남아 있는 털을 제거합니다.

뒷다리와 복부 사이 부위를 코팅하십시오. 3분 후, 젖은 장갑을 낀 손으로 따뜻한 H two oh를 묻혀 제모 크림을 피부에 부드럽게 문지릅니다. 즉시 반복하여 과도한 제모제를 제거하십시오.

그런 다음 부드러운 천이나 종이 타월에 따뜻한 물을 적시고 한 번의 동작으로 마우스의 아래쪽 부분을 닦습니다. 마우스를 열 lamp 회복한 다음 최소 12시간 동안 다시 누르고 있습니다. 마취된 마우스를 검사하여 각 서혜부 림프절로 미량 또는 염료가 배액되었는지 확인합니다.

림프절은 뒷다리, 허벅지, 복부 근처에 어두운 점으로 보여야 합니다. 이제 resus는 각 주입에 대해 원하는 주입 농도로 증류수의 입자를 재현탁합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 입자 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

10마이크로리터 전체를 1밀리리터 주사기에 부착된 31게이지 인슐린 바늘로 흡입합니다. 바늘로 염색한 림프절 주위의 피부를 피부와 90도 각도로 팽팽하게 당깁니다. 1mm 깊이까지 피부를 관통하십시오.

눈에 보이는 림프절 비대를 위해 전체 부피를 천천히 주입합니다. 마우스가 열 아래에서 회복되도록 합니다.amp 그런 다음 홀딩으로 돌아가거나 추가 테스트를 수행합니다. 먼저 입자 합성과 크기 분포를 확인합니다.

에멀젼 용매 증발 합성 프로토콜은 최종 에멀젼의 육안 검사를 통해 정성적으로 평가할 수 있습니다. 생성. 에멀젼은 눈에 보이는 응집체가 없는 균일한 현탁액이어야 합니다. 부품 입자 크기 분포는 레이저 회절 또는 동적 광 산란으로 확인할 수 있으며, 입자 샘플은 모노 모드 분포를 나타내야 합니다.

입자 합성에 대한 추가적인 정성적 평가는 형광 펩타이드 또는 친유성 염료와 같은 하나 이상의 형광 화물을 통합하도록 프로토콜의 수정을 통해 달성할 수 있습니다. 염료는 입자 주입을 위해 림프절을 찾고 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다 훈련 중에 마우스는 림프절 위치에 익숙해지기 위해 염료 주입 후 안락사 및 부검을 할 수 있습니다. 감염된 림프절의 t 세포 및 b 세포 영역 내 입자 분포는 절편화된 림프절과 염색된 림프절의 컨포칼 현미경 검사로 확인됩니다.

크기와 같은 입자 특성의 차이는 형광 현미경 검사에 의한 주입 및 이미징 후 림프절에서 관찰할 수 있습니다.이 기술을 마스터하면 이틀에 걸쳐 완료할 수 있습니다. 입자 합성 및 동물 준비는 첫날에 이루어집니다. 입자 세척 특성화 및 림프절 내 주입은 2일차에 수행됩니다.

이 동영상을 시청한 후에는 미량 또는 염료를 사용하여 마우스의 서혜부 림프절을 시각화하고 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 이전에는 불가능했던 수준의 제어 수준으로 생체 재료 백신 보균자를 림프절에 직접 비수술적으로 전달할 수 있습니다. 생체 재료의 직접 림프절 전달을 통해 과학자와 엔지니어, 면역학 및 백신 개발은 생체 재료, 백신 및 면역 신호와 림프절의 근본적인 상호 작용을 탐구하여 이러한 물질이 면역을 자극하고 형성하는 메커니즘을 새롭게 밝