Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

Chemistry

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Summary

Peptides amides tertiaires (APE) sont une superfamille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides, des peptoïdes et les peptides N-méthylés. Nous décrivons ici une méthode synthétique qui combine à la fois divisée et-piscine et stratégies sous-monomères pour synthétiser un une bille bibliothèque d'un composé de PTA.

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Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

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Abstract

Peptidomimetics sont d'excellentes sources de ligands protéiques. La nature oligomères de ces composés nous permet d'accéder à de grandes bibliothèques de synthèse sur phase solide en utilisant la chimie combinatoire. Une des classes les plus étudiés de peptidomimétiques est peptoids. Les peptoïdes sont faciles à synthétiser et ont été montrés pour être résistant à la protéolyse et de la cellule-perméable. Au cours de la dernière décennie, de nombreux ligands de protéines utiles ont été identifiés par criblage de banques de peptoïdes. Cependant, la plupart des ligands identifiés dans les bibliothèques peptoïdes ne s'affichent pas une affinité élevée, à de rares exceptions. Cela peut être dû, en partie, à l'absence de centres chiraux et des contraintes conformationnelles des molécules peptoïdes. Récemment, nous avons décrit une nouvelle voie de synthèse pour accéder peptides amides tertiaires (APE). PTA sont une superfamille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides, des peptoïdes et les peptides N-méthylés. Avec des chaînes latérales sur les deux α-carbone et des atomes d'azote principaux de la chaîne,la conformation de ces molécules sont grandement limitée par encombrement stérique et 1,3 allylique souche. (Figure 1) Notre étude suggère que ces molécules d'ATP sont très structurés en solution et peuvent être utilisés pour identifier des ligands protéiques. Nous croyons que ces molécules peuvent être une source future de ligands protéiques de haute affinité. Ici, nous décrivons la méthode de synthèse combinant la puissance de deux split-et-piscine et stratégies sous-monomères pour synthétiser un échantillon d'un cordon d'un composé (OBOC) bibliothèque de PTA.

Introduction

Sont des composés peptidomimétiques qui imitent la structure des peptides naturels. Ils sont conçus pour conserver l'activité biologique, tout en surmontant certains des problèmes associés aux peptides naturels, y compris la perméabilité cellulaire et la stabilité contre la protéolyse 1-3. En raison de la nature oligomère de ces composés, de grandes bibliothèques de synthèse peuvent être facilement accessibles par des voies de synthèse de sous-monomères ou monomères 4-7. Une des classes les plus étudiées de peptidomimétiques est peptoids. Les peptoïdes sont des oligomères de glycines N-alkylés qui peuvent être facilement synthétisés en utilisant une stratégie de sous-monomère 8, 9. Beaucoup de ligands de protéines utiles ont été identifiés avec succès de criblage de grandes banques de peptoïdes synthétique contre des cibles de protéines 1, 10-14. Néanmoins, "hits" identifiés dans les bibliothèques peptoïdes archives rarement très haute affinité vers des cibles protéiques 1,10-14,22. Une major différence entre les peptoïdes et les peptides naturels est que la plupart des peptoïdes n'ont généralement pas la capacité de former une structure secondaire en raison de l'absence de centres chiraux et des contraintes conformationnelles. Pour résoudre ce problème, plusieurs stratégies ont été développées au cours de la dernière décennie, en grande partie en se concentrant sur ​​la modification des chaînes latérales contenues sur les principaux atomes d'azote de la chaîne 15-22. Récemment, nous avons développé une nouvelle voie de synthèse d'introduire des chaînes naturelles latérales d'acides aminés sur un squelette peptoïde pour créer peptides amides tertiaires 23.

Peptides amides tertiaires (APE) sont une famille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides (R 2 = H), les peptoïdes (R 1 = H) et les peptides N-méthylés super (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . (Voir Figure 1) Notre voie de synthèse emploie des acides aminés naturels comme source de chiralité et des chaînes latérales sur le45; carbone, et les amines primaires disponibles dans le commerce pour fournir les N-substitutions. Par conséquent, un espace chimique plus grande que celle des peptides simples, des peptoïdes ou des peptides N-méthylés peuvent être explorées. Spectres de dichroïsme circulaire ont montré que les molécules d'ATP sont très structurés en solution. Caractérisation de l'un des complexes protéiques PTA-montre bien que les contraintes de conformation de PTA sont nécessaires pour la liaison. Récemment, nous avons également découvert que certaines des molécules d'ATP possèdent une meilleure perméabilité cellulaire que leurs homologues de peptoïdes et de peptides. Nous croyons que ces bibliothèques de PTA peuvent être une bonne source de ligands de haute affinité pour les protéines cibles. Dans cet article, nous allons discuter de la synthèse d'un échantillon d'une bille un composé (OBOC) bibliothèque de PTA dans les détails avec quelques meilleures conditions pour le couplage et le clivage de ces composés.

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Protocol

1. Bases de Split-et-piscine Synthèse

Afin de générer efficacement un grand nombre de composés sur la phase solide, la synthèse split-and-pool est souvent utilisé comme une stratégie générale. Comme le montre la figure 4, de Tentagel perles sont d'abord séparée en trois parties. Chaque portion est mis à réagir avec un réactif différent, la génération du premier résidu sur des billes. Après la première réaction, les trois parties sont regroupées, mélangés, et ensuite divisés à nouveau en trois portions. Chaque partie sera à nouveau réagir avec un réactif différent, la génération du second résidu sur des billes. Après deux étapes split-et-piscine, neuf composés sont générés.

Dans la synthèse de sous-monomère, les perles sont d'abord divisées en plusieurs parties pour réagir avec différents acides bromo, en présence d'un réactif de couplage. Après lavage avec solvant, toutes les perles seront réunies et mélangées, puis de nouveau divisé en plusieurs parties pour réagir avec différentsdes amines primaires. Après amination, toutes les perles sont regroupées et lavées soigneusement, remplir un monomère complet sur chaque perle. Ce processus peut être répété jusqu'à ce que la diversité souhaitée est atteinte.

2. Préparation de l'acide bromure de Natural acides aminés

Dans la synthèse de sous-monomère, la synthèse de chaque monomère est divisé en deux étapes distinctes: 1. Couplage du bromure et de l'acide 2 amination avec des amines primaires (Figure 2).. Afin de synthétiser un amide tertiaire des peptides, des bromures d'acides chiraux avec des chaînes latérales sur le carbone alpha sont préparés à partir d'acides aminés naturels. Nous décrivons ici le procédé de transformation d'un acide aminé naturel dans le bromure d'acide correspondant avec une fidélité élevée stéréo. Nous utilisons l'alanine, par exemple; d'autres acides aminés, y compris la serine, la thréonine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'asparagine, la glutamine, la glycine, la valine, l'isoleucine, la phénylalanine peuvent également être transformés en acides bromes sous conditio semblablens. A noter que certains des acides aminés avec des groupes fonctionnels tels que le phénol, la guanidine et amine ont besoin d'être protégés avant la transformation. La configuration de la réaction est représentée à la figure 3.

Mesures de sécurité: Pour les réactions suivantes impliquant HBr, NaNÛ2 et autres produits chimiques corrosifs / toxiques, équipement de sécurité approprié comme des lunettes de protection, blouse de laboratoire et des gants résistant aux produits chimiques sont nécessaires. Toutes les réactions doivent être effectuées dans une hotte par le chimiste expérimenté.

  1. Ajouter 370 ml d'eau dans 630 ml de solution de HBr à 48% pour préparer 1 L d'une solution de HBr à 30%. Ajouter 500 ml d'éthylène glycol dans un récipient de bain de 1 L; ajouter de la neige carbonique pour maintenir la température à -10 ° C. Attention: solution de HBr 48% est fortement acide et corrosif, à manipuler avec précaution. Lire la fiche signalétique avant l'utilisation.
  2. Ajouter D-alanine (8,9 g, 0,1 mol) et du KBr (11,9 g, 0,1 mol) à un ml à trois cols de flacon à fond rond 250 avec un barreau d'agitation magnétique. Ajouter 100 ml, et le HBr à 30% préparée dans le til étape précédente. Placer le ballon dans le bain de glycol d'éthylène préparé à l'étape 2.1 et de maintenir la température à -10 ° C. Bulle d'argon à travers une aiguille longue à partir du fond de la fiole pendant 10 minutes comme le montre la figure 3. Agiter la solution avec la barre d'agitation magnétique à 300 tours par minute.
  3. Dissoudre NaNÛ2 (8,28 g, 0,12 mole) dans un bécher de 100 ml avec 20 ml d'eau. Ajouter la solution dans l'ampoule à brome à égalisation de pression et de sceller l'ampoule de coulée avec un septum. Tourner lentement la vanne de l'ampoule de coulée et de laisser la solution de NaNO 2 goutte dans le ballon. Commander la vanne pour régler le taux d'égouttage à environ 2 gouttes par seconde. Maintenir l'agitation à 300 tours par minute et garder le bullage d'argon à partir du fond de la fiole. Le ballon doit être conservé dans de l'éthylène glycol au bain de -10 ° C jusqu'à ce que tout NaNO 2 est ajouté. Attention: Cette étape génère de la chaleur et de gaz lors de l'ajout de NaNÛ2 solution. Taux d'égouttement doit être soigneusement concontrôlé et l'ensemble du système doit être ouvert par la sortie de l'argon.
  4. Gardez en remuant pendant 3 h plus et laissez la température se réchauffer de -10 ° C à la température ambiante. La solution obtenue doit être limpide à jaune clair; si la couleur est trop sombre, appliquer le vide pour éliminer les oxydes d'azote en excès et possible Br 2 généré lors de la réaction.
  5. Extraire le produit à partir de la solution avec 3 x 35 ml d'éther diéthylique à l'aide d'un entonnoir d'extraction. Mélanger la phase organique et laver avec de la saumure saturée. La phase organique peut également être lavé avec une petite quantité de NaHCO3 avant de laver avec de la saumure pour éliminer la couleur si elle est sombre. Sécher la phase organique sur Na 2 SO 4 pendant 6 heures.
  6. Filtrer le Na 2 SO 4 et évaporer le solvant sous vide, le produit brut devrait être obtenue aussi clair à huile jaune pâle. Le produit brut peut encore être purifié par distillation à 115 ° C, 3 mm Hg, ou parcolonne de silice avec un mélange 03:01 d'hexane: acétate d'éthyle.
  7. Le produit pur est obtenu sous forme d'huile claire, 6,6 g (rendement 74%), la densité = 1,69 g / ml, [α] D20 = 24 ° (méthanol), RMN 1 H (400 MHz, CDCl3) δ 4.41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). Dans le cas de (S)-2-bromopropanoic acide-d 4 (préparé à partir d 4-L-alanine), produit pur est obtenu sous forme d'huile claire, rendement 78%, densité = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (méthanol). RMN 1 H, aucun signal significatif de H est observée. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (devraient 154,97). Pour (S)-4-méthylpentanoïque acide 2-bromo (préparé à partir de L-leucine en utilisant la même procédure) produit pur est obtenu sous forme d'huile limpide, rendement 89%, [α] D20 = +37 ° (methanol), 1 H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 4.30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). Dans le cas de (S)-2-bromo-3-phenylpropanoic acide (préparée à partir de la L-phénylalanine en utilisant la même procédure) produit pur est obtenu sous forme d'huile jaune pâle, rendement 72%, [α] D20 = +17 ° (methanol), RMN 1 H (400 MHz, CDCl3) δ 7,38 - 7.19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H).

3. Marquage isotopique de l'alanine transaminase Utilisation

Dans la synthèse de la banque combinatoire, en particulier dans la synthèse split-and-pool d'une bille un composé (OBOC), les bibliothèques, la quantité de composé qui peut être obtenu à partir de chaque bourrelet est relativement faible. (Typiquement une pmol à 10 nmol). De plus, la spectrométrie de masse est largement utilisé pour l'identification et la caractérisation du composé final en raison de sa grande sensibilité. Pour utiliser la spectrométrie de masse pour déterminer la stéréochimie absolue aux centres chiraux des produits finaux de PTA, les énantiomères de l'acide bromo doivent être isotoPically étiquetés avant utilisation. Nous décrivons ici la méthode d'utilisation de transaminase et D 2 O à étiquette L-alanine.

  1. Dissoudre la L-alanine (300 mg, 3,36 mmol) avec 10 ml de D 2 O dans un tube de 50 ml en polyethylene. Ajouter α-cétoglutarate (10 mg, 0,068 mmol) en tant que co-substrat. Chauffer le tube à 37 ° C et ajuster le pD de 8.5 à 8.7 en utilisant une soution 1 M NaOD. Remarque: pD est déterminée par des bandelettes de test de pH. Traditionnel compteur électro pH équipée avec électrode de verre sélectif pour H + peut donner incorrect lire D +.
  2. Ajouter alanine transaminase (0,1 mg, CE 2.6.1.2 de coeur de porc, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) à la DP 08.05 à 08.07, 37 ° C la solution préparée à partir de l'étape précédente. Mettre le tube dans un incubateur à 37 ° et incuber toute la nuit avec une agitation douce, de 10 à 30 tours par minute est préféré.
  3. Après une nuit d'incubation, prendre 0,5 ml de la solution S D 2 et de vérifier la progression de la réaction par RMN 1H. Tous les signaux des protons d'unLanine, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), RMN 1 H 400 MHz, devrait être grandement supprimées en raison de deutération. Plus de 98% du proton doit être échangé pour le deutérium, comme décrit précédemment 23. Remarque: D 2 O peut être partiellement récupéré par distillation, si la réaction est effectuée à grande échelle (> 200 ml de D 2 O). Normalement, de 60% ​​à 80% de D 2 O peut être distillé à partir de la solution.
  4. Congeler la solution ci-dessus avec de l'azote liquide et lyophiliser l'aide d'un lyophilisateur pour obtenir blanc deutéré L-alanine poudre.

4. Synthèse des peptoïdes Linker Région

La région de liaison n'est pas nécessaire pour la synthèse de la bibliothèque de PTA. Toutefois, afin d'éviter le bruit de fond élevé dans la plage de poids moléculaire plus faible (100 à 600) de la spectroscopie de masse MALDI et d'améliorer l'ionisation des composés, un groupe de liaison peptoïde avec plusieurs résidus polaires est souvent utilisé. Cette peptoïdique linker peut être synthétisé par la procédure de synthèse peptoïdique standard. Ici, nous allons synthétiser un pentamère de N-méthoxy-éthyl glycine dans le segment de liaison (comme le montre la figure 5).

  1. Gonfler 90 um avec des perles de Tentagel RAM lieur (1 g, 0,27 mmol / g) dans 10 ml de DMF pendant 3 h dans un réacteur à seringue de 12 ml avec une agitation douce.
  2. Égoutter le DMF du réacteur et ajouter la solution de pipéridine dans le DMF 10 ml de 20% de déprotéger le groupe fmoc de l'amide linker Rink. Agiter les billes avec une solution de pipéridine à 20% pendant 30 min. Laver avec du DMF 5x pour enlever toute la pipéridine.
  3. Prenez quelques perles à partir de la seringue et le tester avec le test de chloranile. Perles devraient virer au brun foncé (test de chloranile positif pour amine primaire) si fmoc est déprotégé avec succès.
  4. Préparer les solutions suivantes: 1. 20 ml, 2 M solution acide bromoacétique / DMF; 2 20 ml, de solution 2 M DIC / DMF.; 3. 10 ml, 1 M methoxylethylamine / solution de DMF.
  5. Ajouter 5 ml de solution M d'acide / DMF 2 bromoacétique àles perles, secouez doucement. Ajouter ensuite 5 ml de solution 2 M DIC / DMF pour les perles; sceller la seringue avec le piston et le mettre sur le shaker. Agiter pendant 10 min.
  6. Laver les billes avec du DMF à fond. Ajouter 2 ml de solution 1 M méthoxyéthylamine / DMF préparés à partir de l'étape 4.4 pour les billes. Sceller la seringue avec le piston et le secouer sur l'agitateur pendant 30 minutes.
  7. Laver les billes avec du DMF 5x. Vérifiez quelques perles avec le test de chloranile, si positifs (perles deviennent bleus), puis passez à l'étape suivante. Sinon, répétez l'étape 4.6.
  8. Répétez les étapes 4.5 à 4.7, 4x pour compléter le pentamère.

. 5 Split-et-piscine Synthèse de PTA Bibliothèque avec (R) - et (S)-2-bromopropionique acides

Nous décrivons ici la synthèse d'une petite bibliothèque de PTA avec une diversité théorique de 9261 composés en utilisant la 1 g de perles de l'étape 4.8. Notez qu'un TentaGel perle 90 um contient environ 2,9 millions de perles par gramme; donc la redondance desla bibliothèque sera de 2,9 x 10 6/9261 = 312 copies. Nous allons utiliser l'acide bromoacétique, (R)-2-bromopropanoic et isotopique marqué (S)-2-bromopropanoic acide-d 4 comme les acides, et 7 amines différentes (A1 ~ A7, voir Figure 5 pour les détails) pour l'amination. réacteurs de seringue et un collecteur de vide sont utilisés pour effectuer la synthèse.

  1. Ajouter 10 ml de DCM 01:01: DMF à la seringue de l'étape 4.8; utiliser une pipette de 1000 pi avec une pointe de pipette tronquée de diviser toutes les perles 1 g uniformément dans trois réacteurs 5 ml de la seringue. Étiqueter comme B (acide bromo-acétique), R ((R)-2-bromopropanoic) et S ((S)-2-bromopropanoic acide 4-d). Lavez tous les 3 seringues avec du DCM 3x, et laver les seringues étiquetées avec R et S avec THF anhydre 3x, laver la seringue marqué avec B avec du DMF 3x.
  2. Seringue R et S. Couplage BTC d'acide bromopropanoic.
    1. Préparer une solution fraîche BTC / THF. Ajouter unnviron 200 mg de la CTB dans le flacon dans une hotte, sceller avec le bouchon. Peser la quantité de CTB dans le flacon. Calculer la quantité de solvant nécessaire et ajouter THF anhydre dans le flacon pour faire un / ml solution BTC / THF 20 mg.
    2. Préparer le acides bromo / mélange BTC. Ajouter (R)-2-bromopropanoic acide (89 ul, 0,95 mmol) et de (S)-2-bromopropanoic acide d-4 (89 ul, 0,95 mmol) dans deux petits flacons séparément. Pour chaque flacon, ajouter 5 ml de la solution à 20 mg / ml de CTB / THF ci-dessus. Sceller les deux flacons et les mettre dans le congélateur à -20 ° C pendant 20 min.
    3. Ajouter 1125 pi, 02h01 THF / DIPEA (750 pi THF, 375 pi DIPEA, 2,2 mmol) à la seringue R et S séparément. Mélanger les billes avec la pointe de pipette. Laissez-les reposer pendant 5 min.
    4. Prenez les deux refroidi acides bromo / mélanges BTC de l'étape 5.2.2, ajouter le 2,4,6-triméthylpyridine (356 pi, 2,7 mmol) à chacun des flacons. Un précipité blanc se forme immédiatement. Appliquer la suspension correspondant directementles perles rendu basique (seringue de R et S à l'étape 5.2.3) dès que possible et puis les mettre sur un agitateur à secouer moins de 120 tours par minute pendant 2 heures.
      Remarque: La solution dans les réacteurs de la seringue doit être une suspension jaunâtre pâle pendant tout le cours de la réaction. Une couleur plus foncée est une indication d'une chaleur excessive dégagée lors de l'addition initiale de la solution de chlorure d'acide. Ceci peut être résolu par un refroidissement plus bas ou le diluer les acides bromo / mélange BTC.
  3. Seringue B. Couplage de l'acide bromacétique à la DIC
    1. Préparer un frais de 20 ml, solution acide bromo-2 M / DMF. Préparer un 20 ml, solution à 2 M DIC / DMF.
    2. Ajouter 2 ml de solution M d'acide bromoacétique / DMF 2 à seringue B, secouer doucement. Ajouter 2 ml d'une solution 2 M DIC / DMF à la seringue B, secouer doucement.
    3. Mettez seringue B sur le même shaker comme seringue R et S
  4. Après 2 heures, prendre la seringue R, S et B de l'agitateur. Lavez les trois seringues à fond avec DCM 5x. Ensuite laver avec du DMF 5x. A noter que la seringue R et S ne peuvent pas être lavés avec du DMF, avant d'être lavée avec du DCM ou du THF en premier.
  5. Piscine toutes les perles de seringues R, S et B dans un réacteur de 12 ml seringue. Lavez toutes les perles avec du DMF 5x.
  6. Ajouter 10 ml de DCM 01:01: DMF à la seringue; utiliser une pipette de 1000 pi avec une pointe de pipette tronquée de diviser toutes les perles uniformément dans 7 différents seringues de 2 ml, étiqueter comme A1-A7.
  7. Amination. Préparer 10 ml, 2 solutions amine / DMF primaires M pour chacun des sept amines énumérées dans la Figure 5. Ajouter 5 ml d'EACsolution d'amine h à la seringue A1-A7 correspondant. Incuber les 7 seringues dans un incubateur à 60 ° C sous agitation pendant une nuit.
  8. Après incubation, laver toutes les perles soigneusement avec du DMF. Prenez un peu de billes de chaque seringue et vérifier avec le test de chloranile. Si les perles tournent au vert (positif) à moins de 3 minutes, passez à l'étape suivante. S'il est négatif, répétez l'étape 5.7 pour les seringues négatifs.
  9. Répétez les étapes 5.1 et 5.8 2x pour compléter le trimère. Étape facultative: Après chaque cycle, nous vous recommandons de vérifier la qualité de la synthèse par spectroscopie de masse comme décrit ci-dessous. Tous les 9261 composés sont synthétisés maintenant sur des billes de Tentagel que bibliothèque OBOC.
  10. Mass confirmation spectroscopique des APE.
    APE sont des oligomères fortement structurés et possèdent de nombreuses caractéristiques communes des peptides N-méthylés. L'un des problèmes communs de synthèse en phase solide de peptides N-méthylés est la dégradation de l'acide au cours de TFA clivage. Pour supprimer la dégradation de l'acide, le clivage de molécules comme la cyclosporine desupport solide est souvent réalisée à basse température. Nous avons comparé différentes conditions clivage pour cliver des molécules d'ATP à partir du support solide. Nous avons constaté que, en général, à basse température et la concentration de TFA réduite pourrait effectivement supprimer la dégradation de l'acide et de fournir des composés purs.
    1. Préparer 10 ml de solution 01:01 TFA / DCM dans un tube de 15 ml. Scellez le tube et le mettre dans un congélateur à -20 ° C pendant 20 min.
    2. Laver les billes qui doivent être clivées avec du DCM 5x. Agiter les billes dans du DCM pendant 15 minutes et laver les billes de nouveau avec du DCM 5x.
    3. Égoutter le DCM de la seringue. Utiliser un microscope optique et une pipette à pointe tronquée pour transférer chaque bille individuelle dans une plaque de 96 puits, une bille par puits.
    4. Recouvrir la plaque de 96 puits avec une lamelle. Mettre la plaque dans un congélateur à -20 ° C pendant 15 min.
    5. Prendre la solution 01:01 TFA / DCM refroidi provenant de l'étape 5.10.1 et ajouter 20 ul à chaque puits qui contient une bille. Mettez le couvre-retour et d'unité centralet la plaque à 96 puits sur un agitateur à 20 ° C le réfrigérateur.
    6. Agiter pendant 20 min. Prenez la plaque de 96 puits et de décoller sur la lamelle. Séchez le TFA / DCM de chaque puits par de l'air ou de l'argon au-dessus de soufflage. Si plus de 10 perles sont clivés, un speedvac peut être utilisé pour sécher le mélange TFA / DCM à partir de l'ensemble de la plaque. Notez que, à ce stade, pas tous les composés sont clivé les perles, mais les composés clivés devrait être plus que suffisant pour effectuer l'analyse de spectrométrie de masse.
    7. Ajouter 20 ul 06:04 ACN: H 2 O solution pour dissoudre les composés clivés de chaque puits. Repérer les 0,6 ul de chaque solution de composé avec 0,6 ul CHCA MALDI matrice sur la plaque MALDI.
    8. Utiliser la spectrométrie de masse MALDI pour déterminer le poids moléculaire et séquence (MS / MS) de chaque composé.

6. Chloranile test

  1. Préparer les réactifs suivants frais pour chaque test. Solution A: 2% chloranile (CAS: 118-75-2) dans le DMF. SolutionB: 2% acétaldéhyde (CAS: 75-07-0) dans le DMF.
  2. Mélanger 100 ul de solution A avec 100 ul de solution B avant le test dans un tube de 1,5 ml; déposer les perles dans et agiter doucement. Si les perles deviennent bleus dans les 5 min, il indique la présence d'une amine secondaire sur la surface des billes. Les amines primaires donnent une couleur brun foncé au lieu de virer au bleu.

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Representative Results

Ici, nous montrons trois spectres MALDI représentatifs d'un trimère de PTA de liaison. Comme le montre la figure 6A, lorsqu'il est clivé à température ambiante en utilisant 50% de solution de TFA / DCM, une dégradation significative est observée. Sur la figure 6A, un sommet 593 et 484 correspondent au segment de liaison et le trimère de PTA, respectivement, montrent que la molécule entière a été synthétisé avec succès le bourrelet mais dégradée lors du clivage. Lorsque clivé dans des conditions de basse température tel que décrit ci-dessus, la quantité de la dégradation induite par le TFA est fortement supprimée, comme indiqué sur la figure 6B. Le mécanisme de ce clivage a été décrite dans la littérature précédents 24, et il est censé passer par un intermédiaire oxazolidine. molécules d'ATP peuvent être séquencés par la SM / SM et le motif de fragmentation est similaire à celle des peptides et peptoïdes, comme le montre la figure 6C. molécules d'ATP synthétisées avec (S)-2-bromopropanoic acide-d généralement 4 give pic plus large sur MS et spectres MS / MS en raison de la présence de produits de deutération incomplets tels que la (S)-2-bromopropanoic acide d-3 (figures 7A et 7B). Cela pourrait être utilisé comme une indication de la présence du centre chiral de R (à partir de S inversé au cours de l'amination) durant la procédure de séquençage. Nous avons également constaté que les molécules d'ATP ont tendance à former des adduits plus sodiated que peptoïdique / peptide, donc de l'eau faible en sodium (eau déminéralisée) et un appareil de plastique sont préférés (figure 7C). Un autre sous-produit qui peut être observé dans la synthèse de l'ATP est l'acrylamide formé à partir de l'élimination du bromure au cours de l'amination (Figure 7C). Une fois que l'acrylamide est formée, la séquence se termine. Ceci peut être résolu par l'abaissement de la concentration de l'aminé primaire à 1 M dans le but de réduire la basicité de la solution. Nous vous recommandons d'effectuer le test de chloranile après chaque étape d'acylation et l'utilisation spectr masseoscopy pour vérifier le produit après chaque étape d'amination pour assurer la qualité de la bibliothèque.

Figure 1
Figure 1. Structural comparaison des peptides, peptoïdes, PTA et le peptide N-méthylé. PTA comprend peptide (R 2 = H), peptoïde (R 1 = H) et le peptide N-méthylé (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . B) Le PTA préfère trans conformation de liaison amide en raison de l'encombrement stérique entre les deux chaînes α-côté. C) Le PTA a également une conformation préférée en raison de 1,3 souche allylique entre N-substitution et de la chaîne α-côté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2. Synthèse sous-monomère de peptoïde (R ­ 1 = H) et PTA (R 1 ≠ H). Première étape est l'acide acylation de l'amine. La deuxième étape est l'amination avec des amines primaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Configuration de réaction. A 250 ml à trois cols à fond rond est placé dans un bain de glace glycol / éthylène sec. Le col intermédiaire est reliée à une pression de 150 ml d'égalisation ampoule à brome. Les cous gauche et droit sont scellés avec un adaptateur de commande d'écoulement et d'un septum wvec une longue aiguille qui permet la circulation d'argon passer à travers. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Bases de synthèse split-et-piscine. Perles blanches sont divisés en trois parties, traitées séparément avec le réactif A, B et C. Après la première réaction, les trois parties de billes sont mises en commun et mixte. Perles communs sont répartis à nouveau en trois portions et encore traités avec la même réactif pour chaque portion individuelle. Après la deuxième réaction, 9 composés différents sont synthétisés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 5. Vue d'ensemble de la structure Bibliothèque. Trois accords commerciaux préférentiels sont synthétisés après le lieur pentamère peptoïde. Diversité théorique, 3 3 X 7 = 3 9261. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Des spectres de masse MALDI typique d'un trimère de PTA. A) trimère PTA clivé par 50% de TFA / DCM à température ambiante. structure de PTA comme indiqué, [M +1] + = 1077, [M + Na] + = 1,098.9, PTA fragmentation de TFA clivage peut être clairement visible sur le spectre. B) Trimer clivageed de 50% de TFA / DCM dans des conditions optimisées, comme décrit dans le document. TFA-induire la dégradation de l'acide est considérablement supprimée. C) spectre du trimère de PTA MS / MS. Y7 faible (916) signal est observé, il s'agit d'un comportement typique de fragmentation pour les APE. Spectra analysé et généré par mMass 32. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
MALDI spectres de synthèse de la ZEP avec isotopique marqué monomère et typique des sous-produits Figure 7.. A) la comparaison des spectres MS de molécules d'ATP synthétisées par le bleu: (R)-2-bromopropanoic [M +1] + = 760 [M + Na] + = 787 [M + K] + = 803 et rouge: (S) - 2-bromopropanoic acide 4-d [M +1] + = 764 [M + Na] + = 783 [M + K] + = 799. B) MS / MS modèles de fragmentation des deux molécules indiquées en A). On notera que du fait de la présence de d 1, d 2 et d 3 épices (deutération incomplète de l'alanine), des molécules synthétisées par (S)-2-bromopropanoic acide-d 4 donne généralement des pics larges C) Rouge:. Spectre d'une PTA dimère et synthétisé clivé dans des conditions optimisées. Bleu:. PTA dimère synthétisé avec une solution 2 M de méthoxyéthylamine et clivé dans l'eau filtrée normale S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Peptides amides tertiaires (APE) sont une superfamille d'oligomères peptidomimétiques. Outre les peptides bien étudiés, peptoids et les peptides N-méthylés, une grande partie des composés de cette famille reste peu étudié, majorly raison d'un manque de méthode de synthèse pour accéder générales peptides N-alkylés. Ici, nous décrivons une méthode efficace pour synthétiser PTA avec des blocs de construction chiraux dérivés d'acides aminés. Auparavant, nous avons signalé à utiliser un nouveau sous-monomère route vers les bibliothèques de synthèse de molécules d'ATP 23. Nous avons montré que les APE sont des oligomères hautement structurés qui possèdent retient conformation par la colonne vertébrale. Lors d'un essai in vivo, des molécules ATP ont montré une meilleure perméabilité cellulaire et donc une meilleure activité 25. Cependant, à côté de tous les avantages, les APE viennent également avec des défis synthétiques, majorly de l'acylation d'amines secondaires à des positions encombrés. La chaîne α-côté qui fournit de conformationrestriction apporte également un encombrement stérique pour l'étape de couplage suivante. Afin de surmonter ces problèmes de synthèse, nous avons réalisé une étude d'optimisation extensive et BTC déterminé comme étant le meilleur agent de couplage pour cette réaction 23.

L'étape clé de la voie de synthèse est facilitée BTC acylation de l'amine secondaire. Au cours de ce processus, la CTB permet la génération d'un chlorure d'acide in situ 26,27. La plupart des autres réactifs de couplage, qui forment soit des esters actifs ou des anhydrides d'acides comme intermédiaires n'ont pas réussi à fournir des acylation propre pour la synthèse de l'ATP continue. L'existence d'unités de PTA précédentes altère considérablement l'efficacité de couplage de l'unité de PTA suivante en raison de l'encombrement stérique. Par conséquent, pour la synthèse de plusieurs accords commerciaux préférentiels, un intermédiaire très actif avec un petit groupe de départ est fortement préféré. Parmi toutes les conditions de couplage que nous avons testés, généré in situ chlorure d'acide par la CTB travaille le BESt dans notre main. Cependant, même avec les chlorures d'acides très actifs, nous recommandons d'éviter les amines encombrées très stériques tels que les amines primaires α-ramifié dans la synthèse bibliothèque à moins testé à l'avance. Amines aromatiques telles que anile conduisent souvent à la substitution incomplète et donc devraient également être évités. Au cours de l'étape de couplage BTC, la solution doit toujours être une couleur jaune pâle à l'orange; une solution de couleur foncée est une indication de la surchauffe et peut donner lieu à un rendement plus faible et une formation accrue de sous-produits. Cela peut généralement être résolu en outre le refroidissement de la solution de BTC, réduire la taille de la réaction et le transfert rapide de l'/ solution acide CTB activée. Outre la CTB, N-Ethoxycarbonyl-2-éthoxy-1 ,2-dihydroquinoléine (EEDQ) est un autre réactif de couplage qui fonctionne bien dans la synthèse de l'ATP. L'intermédiaire clé est un anhydride carbonique mélangé avec un groupe relativement restreint de départ. Dans le cas de la EEDQ, 3 équivalent de EEDQ est dissoute conjointement avec l'acide dans du DCM, puis apretors à billes à la température ambiante. La réaction se fait normalement dans les 2 heures avec une agitation légère. Cette réaction dégage du CO 2 au cours de la réaction; par conséquent, le système réactionnel ne doit pas être fermée.

Une autre étape clé est le clivage et la caractérisation de molécules d'ATP. Un schéma de fragmentation MS / MS distinctif a été observé lorsque le séquençage des molécules d'ATP par MALDI-MS/MS (Figure 6). Il se compose d'une faible intensité de la dernière ion y (en violet sur ​​la figure 6C et augmentation de l'intensité de y6, Y5, Y4, b2, b3) des ions. Motifs analogues ont été observés à partir de la fragmentation de peptide N-méthylé dans le précédent rapport 28. En raison de la stabilité accrue de l'oxazolidine intermédiaire, les peptides N-méthylés ont tendance à donner de fortes ions 28 b. Par ailleurs, il est bien connu que le peptide N-méthylés sont labile en milieu acide à la fois pendant le clivage TFA MALDI et la spectroscopie de masse 24,28, 29. Mécaniste étude a montré qu'en raison de la restriction de conformation sur l'épine dorsale, l'atome d'oxygène de carbonyle du résidu précédent est souvent à proximité du groupe carbonyle au niveau du site de clivage, ce qui favorise la formation de l'intermédiaire 29 oxazolidine. Pour les raisons mentionnées ci-dessus, les deux APE et les peptides N-méthylés doivent être clivé de supports solides à basse température en utilisant des concentrations contrôlées de TFA 26, 30. Dans notre expérience, la méthode de clivage le plus commode pour les résidus de PTA individuels se produit à -20 ° C avec une solution pré-refroidie, à -20 ° C de 50% de TFA / DCM. Cette procédure supprime grandement la formation de produits de dégradation acide.

Après la maîtrise de cette technique, une bibliothèque avec PTA monomère dérivé d'autres acides aminés naturels tels que la leucine, la phénylalanine, la glutamine, etc peut être synthétisé aussi bien. Une bibliothèque de PTA de haute qualité peut être projeté against diverses cibles protéiques à l'aide de nos protocoles précédemment publiés sur perle dépistage 31. Hit composés identifiés à partir de la projection peut être caractérisé par spectrométrie de masse et resynthétisé pour autre test utilisant le protocole décrit ci-dessus.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jumpei Morimoto et le Dr Todd Doran pour une aide précieuse. Ce travail a été soutenu par un contrat du NHLBI (NO1-HV-00242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

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References

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