Split-and-pool Syntese og karakterisering av Peptide Tertiær Amide Library

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Peptid tertiære amider (Ptas) er en superfamilie av peptidomimetika som inkluderer, men er ikke begrenset til peptider, peptoids og N-metylert peptider. Her beskriver vi en syntetisk metode som kombinerer både split-and-pool og sub-monomer strategier for å syntetisere en ett-perle ett sammensatt bibliotek av PTAs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Peptidomimetika er gode kilder til protein ligander. Den oligomeric naturen av disse forbindelsene gir oss tilgang til store syntetiske biblioteker på fast fase ved hjelp av kombinatorisk kjemi. En av de mest studerte klasser av peptidomimetika er peptoids. Peptoids er lette å syntetisere og har vist seg å være proteolyse bestandige og celle-gjennomtrengelig. I løpet av det siste tiåret, har mange nyttige protein ligander blitt identifisert gjennom screening av peptoid biblioteker. Men de fleste av de ligander identifisert fra peptoid bibliotekene ikke vise høy affinitet, med sjeldne unntak. Dette kan skyldes delvis mangel på kirale sentre og conformational begrensninger i peptoid molekyler. Nylig, beskrev vi en ny syntetisk rute for å få tilgang peptid tertiære amider (Ptas). PTAs er en superfamilie av peptidomimetika som inkluderer, men er ikke begrenset til peptider, peptoids og N-metylert peptider. Med sidekjeder på både α-karbon-og hovedkjede nitrogenatomer,konformasjon av disse molekylene er sterkt begrenset av sterisk hindring og allylisk 1,3 belastning. (Figur 1) En studie antyder at disse PTA-molekyler er sterkt strukturert i løsning, og kan brukes til å identifisere protein ligander. Vi tror at disse molekylene kan være en som fremtidig høyaffinitets-protein ligander. Her beskriver vi syntetisk metode som kombinerer kraften i både split-and-pool og sub-monomer strategier for å syntetisere en prøve ett-perle ett-forbindelsen (OBOC) bibliotek av PTAs.

Introduction

Peptidomimetika er forbindelser som etterligner strukturen av naturlige peptider. De er utformet for å holde på bioaktivitet mens overvinne noen av problemene i forbindelse med naturlige peptider, inkludert celle permeabilitet og stabilitet mot proteolyse 1-3. På grunn av den oligomere natur av disse forbindelser, kan store syntetiske biblioteker lett nås gjennom monomere eller sub-monomere syntetiske ruter 4-7. En av de mest studerte klasser av peptidomimetika er peptoids. Peptoids er oligomerer av N-alkylerte glyciner som kan syntetiseres lett ved hjelp av en sub-monomer strategi 8, 9. Mange nyttige protein ligander har blitt identifisert fra screening store syntetisk peptoid biblioteker mot protein mål 1, 10-14. Likevel, "treff" identifisert fra peptoid biblioteker arkivere sjelden svært høy affinitet mot protein mål 1,10-14,22. En maJor forskjellen mellom peptoids og naturlige peptider er at de fleste av de peptoids generelt mangler evnen til å danne sekundær struktur på grunn av mangel på kirale sentre og konformasjonsforandringer begrensninger. For å løse dette problemet, ble flere strategier utviklet over det siste tiåret, i stor grad fokuserer på endring av sidekjeder som finnes på de viktigste kjeden nitrogenatomer 15-22. Nylig, har vi utviklet en ny syntetisk rute til å introdusere naturlige aminosyre sidekjeder på en peptoid ryggrad til å skape peptid tertiære amider 23.

Peptid tertiære amider (Ptas) er en superfamilien peptidomimetika som inkluderer, men er ikke begrenset til peptider (R2 = H), peptoids (R1 = H) og N-metylert peptider (R 1 ≠ H, R2 = Me) . (Se figur 1) En syntetisk vei syssels naturlig forekommende aminosyrer som kilde for chiralitet og sidekjeder på45; karbon, og kommersielt tilgjengelige primære aminer for å gi N-substitusjoner. Derfor kan en større kjemisk plass enn på enkle peptider, peptoids eller N-denaturert peptider bli utforsket. Sirkulære dikroisme spektra har vist at PTA-molekyler er sterkt strukturert i løsning. Karakterisering av en av de PTA-proteinkomplekser viser tydelig at konformasjonsforandringer begrensninger av PTA er nødvendig for binding. Nylig har vi også oppdaget at noen av PTA molekyler har forbedret celle permeabilitet enn sine peptoid og peptid kolleger. Vi tror at disse PTA-biblioteker kan være en god kilde for høyaffinitets-ligander for protein mål. I denne artikkelen vil vi diskutere syntesen av en prøve ett-perle ett-forbindelsen (OBOC) PTA biblioteket i detaljer sammen med noen bedre forhold for koblingen og spalting av disse forbindelsene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Basics av ​​Split-and-pool Synthesis

For effektivt å generere et stort antall forbindelser i fast fase, blir split-og-pool syntese ofte anvendes som en generell strategi. Som vist i figur 4, tentagel perler er først delt inn i tre deler. Hver del omsettes med et annet reagens, genererer den første rest på perlene. Etter at den første reaksjon, er alle tre porsjoner samles sammen, blandet, og så igjen delt inn i tre deler. Hver porsjon vil igjen reagere med et annet reagens, genererer den andre rester på perlene. Etter to trinn split-og-basseng, er ni forbindelser generert.

I sub-monomer-syntese, blir perlene først deles i flere porsjoner for å reagere med forskjellige brom-syrer i nærvær av koblings-reagens. Etter vasking med oppløsningsmiddel, blir alle perlene bli samlet sammen og blandet, og deretter igjen deles i flere porsjoner for å reagere med forskjelligeprimære aminer. Etter aminering, er alle perler samles sammen og vaskes grundig, fullfører en full monomer på hver perle. Denne prosessen kan gjentas inntil ønsket mangfold er nådd.

2.. Fremstilling av syre Bromide from Natural Amino Acids

I sub-monomer-syntese, er syntesen av hver monomer delt i to separate trinn:. Ett koblings av syre-bromid og 2-aminering med primære aminer (figur 2).. For å syntetisere et peptid tertiært amid, vil chirale syre-bromider med sidekjeder på a-karbonet fremstilles fra naturlige aminosyrer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å transformere en naturlig amino-syre til den tilsvarende syre-bromid med høy stereo-gjengivelse. Vi bruker alanine som et eksempel; andre aminosyrer blant serin, treonin, aspartinsyre, glutaminsyre, asparagin, glutamin, glycin, valin, isoleucin, fenylalanin kan også omdannes til brom syrer under lignende conditions. Legg merke til at noen av aminosyrene med funksjonelle grupper som fenol, guanidin-og amin trenge å bli beskyttet før transformasjonen. Reaksjons oppsettet er vist i figur 3..

Sikkerhetsregler: For trengs følgende reaksjoner som involverer HBr, Nano 2 og andre etsende / giftige kjemikalier, riktig sikkerhetsutstyr som vernebriller, labfrakk og kjemikaliebestandige hansker. Alle reaksjoner bør utføres i en avtrekkshette av erfarne kjemiker.

  1. Legg 370 ml vann i 630 ml 48% HBr-løsning for å fremstille en 1 L, 30% HBr-løsning. Legg 500 ml etylenglykol i en 1 L-bad beholder; tilsette tørr is for å holde temperaturen ved -10 ° C. Forsiktig: 48% HBr løsningen er sterkt sur og etsende, behandles med forsiktighet. Les HMS-databladet før bruk.
  2. Til D-alanin (8,9 g, 0,1 mol) og KBr (11,9 g, 0,1 mol) i en 250 ml tre-halset rundkolbe med en magnetisk rørestav. Legg 100 ml, og 30% HBr fremstilt i than forrige trinn. Plasser flasken i etylenglykol-bad fremstilt i trinn 2.1 og holde temperaturen ved -10 ° C. Boble argon gjennom en lang nål fra bunnen av kolben i 10 min som vist i figur 3.. Omrør løsningen med magnetisk rørestav ved 300 rpm.
  3. Oppløs NANO 2 (8,28 g, 0,12 mol) i et 100 ml begerglass med 20 ml vann. Tilsett løsningen i trykkutlignende dryppetrakt og forsegle dråpetrakten med et septum. Sakte slå på ventilen av dråpetrakten og la Nano 2 løsningen slippe inn i kolben. Kontrollere ventilen å justere drypp hastigheten til ca 2 dråper per sekund. Hold omrøring ved 300 rpm og holde argongjennomspyling fra bunnen av kolben. Kolben bør holdes i etylenglykol-bad ved -10 ° C inntil alt nano 2 tilsettes. Forsiktig: Dette trinnet genererer varme og gass i tillegg til Nano 2 løsning. Dryppende rente bør være nøye conkontrollert og hele systemet skal være åpen gjennom argon utløp.
  4. Holde omrøring i 3 timer, og mer la temperaturen varmes opp fra -10 ° C til romtemperatur. Den resulterende oppløsningen skal være klar til lys gul; Hvis fargen er for mørk, anvende vakuum for å fjerne det overskytende nitrogenoksider og mulige Br 2 genereres under reaksjonen.
  5. Ekstraher produktet fra oppløsningen med 3 x 35 ml dietyl-eter ved hjelp av en ekstrahering trakt. Kombiner den organiske fase og vask den med mettet saltoppløsning. Den organiske fase kan også vaskes med en liten mengde NaHCO3 før vasking med saltoppløsning for å fjerne farge hvis det er mørkt. Tørk den organiske fase i løpet Na 2 SO 4 til 6 timer.
  6. Filtrer ut Na 2 SO 4 og fordamp løsningsmidlet under vakuum, bør råprodukt oppnås som klart til blekgul olje. Råproduktet kan renses ytterligere ved destillasjon ved 115 ° C, 3 mm Hg, eller ved åsilikakolonne med 3:01 heksan: etylacetat.
  7. Rent produkt ble erholdt som klar olje, 6,6 g (utbytte 74%), tetthet = 1,69 g / ml, [α] D20 = +24 ° (metanol), 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). I tilfelle av (S)-2-bromopropanoic syre-d 4 (fremstilt fra d 4-L-alanin), er rent produkt oppnådd som klar olje, utbytte 78%, densitet = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (metanol). 1H NMR, er ingen signifikant H-signal observert. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (forventet 154,97). Til (S)-2-brom-4-metylpentansyre (fremstilt fra L-leucin ved hjelp av den samme prosedyren) rent produkt oppnås som klar olje, utbytte 89%, [α] D20 = +37 ° (metanol), 1 H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 4,30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1.94 (dd, J = 10.8, 3.9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13.2, 6.5 Hz, 1 H), 0.96 (dd, J = 18.2, 6.6 Hz, 7H). I tilfelle av (S)-2-brom-3-phenylpropanoic syre (fremstilt fra L-fenylalanin ved hjelp av den samme prosedyren) rent produkt oppnås som svakt gul olje, utbytte 72%, [α] D20 = +17 ° (metanol), 1H NMR (400 MHz, CDCI3) 7,38 δ - 7.19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H).

Tre. Isotopisk Merking av alanine Bruke nase

I kombinatorisk bibliotek syntese, spesielt i splitt-og-pool syntese av en-kule en-forbindelse (OBOC) biblioteker, er mengden av forbindelse som kan fås fra hver perle relativt liten. (Vanligvis en pmol til 10 nmol). I tillegg er massespektrometri mye brukt for å identifisere og karakteriseringen av den endelige forbindelsen på grunn av sin høye følsomhet. For å kunne bruke massespektrometri for å bestemme den absolutte stereokjemien ved de kirale sentra i de endelige PTA-produkter, bør brom syre enantiomerer være isotopically merket før bruk. Her beskriver vi en fremgangsmåte for ved hjelp av transaminase og D 2 O til etiketten L-alanin.

  1. Oppløs L-alanin (300 mg, 3,36 mmol) med 10 ml D 2 O i en 50 ml polyetylen-røret. Legg α-ketoglutarat (10 mg, 0,068 mmol) som co-substrat. Varm opp røret til 37 ° C og justere pD til 8.5 til 8.7 ved hjelp av en 1 M NaOD soution. Merk: PD er bestemt av pH-teststrimler. Tradisjonell elektro pH-meter utstyrt med glasselektrode selektiv for H + kan gi uriktige lese ut for D +.
  2. Legg alaninaminotransferase (0,1 mg, EC 2.6.1.2 fra gris hjerte, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana) til pd 08.05 til 08.07, 37 ° C løsning forberedt fra forrige trinn. Plasser røret på en 37 ° C inkubator og inkuberes over natten med det mild rysting, er 10 til 30 rpm foretrukket.
  3. Etter over natten inkubering, kan 0,5 ml av D-2-O-løsning og kontrollere reaksjons fremgang ved 1H-NMR. Alle proton signaler om enlanine, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1H NMR 400 MHz, bør være sterkt undertrykkes på grunn av Deutereringsgraden. Mer enn 98% av det proton bør byttes for deuterium som tidligere beskrevet 23. Merk: D 2 O kan delvis gjenvinnes ved destillasjon dersom reaksjonen utføres i stor skala (> 200 ml D 2 O). Vanligvis kan 60% til 80% av D 2 O destilleres fra oppløsningen.
  4. Fryse den ovennevnte løsning med flytende nitrogen og Lyofiliser den ved hjelp av en fryse-tørreren for å oppnå hvite deuterert L-alanin-pulver.

4. Syntese av Peptoid Linker Region

Den linker-regionen er ikke nødvendig for PTA-bibliotek syntese. Imidlertid, for å unngå den høye bakgrunn i det nedre molekylvektsområde (100-600) av MALDI-massespektroskopi og for å forbedre ioniseringen av forbindelsene, en peptoid linker med flere polare rester er ofte brukt. Dette peptoid linker kan syntetiseres gjennom standard peptoid syntese prosedyre. Her vil vi syntetisere en pentamer av N-metoksyetyl-glycin som linkeren (som vist i figur 5).

  1. Svelle 90 mikrometer Tentagel perler med RAM-linkeren (1 g, 0,27 mmol / g) i 10 ml DMF i 3 timer i en 12 ml sprøyte reaktor med mild rysting.
  2. Tapp av DMF fra reaktoren og tilsett 10 ml 20% piperidin-DMF-løsning for å avbeskytte den Fmoc-gruppen fra Rink amid-linker. Rist perlene med 20% piperidin-løsning i 30 min. Vask med DMF 5x å fjerne all piperidin.
  3. Ta noen perler ut fra sprøyten og teste den med chloranil test. Perler bør slå mørk brun (chloranil test positiv for primær amin) hvis Fmoc er vellykket avblokkeres.
  4. Forbered følgende løsninger:. En 20 ml, 2 M bromeddiksyre / DMF løsning; 2 20 ml, 2 M DIC / DMF-løsning.; Tre. 10 ml, 1 M methoxylethylamine / DMF løsning.
  5. Tilsett 5 ml av 2 M bromeddiksyre / DMF løsningperlene, rist forsiktig. Deretter tilsett 5 ml av en 2 M DIC / DMF-løsning til kulene; forsegle sprøyten med stempelet og sette den på shaker. Rist i 10 min.
  6. Vask kulene med DMF grundig. Tilsett 2 ml av 1 M methoxyethylamine / DMF-løsning fremstilt fra trinn 4,4 til kulene. Forsegl sprøyte med stempelet og riste det på rister i 30 min.
  7. Vask kulene med DMF 5x. Sjekk noen perler med chloranil test, hvis positive (perler blir blå), og deretter fortsette til neste trinn. Ellers gjentar trinn 4.6.
  8. Gjenta trinn 4.5 til 4.7, 4x for å fullføre pentamer.

. Fem Split-and-pool Syntese av PTA Bibliotek med (R) - og (S)-2-bromopropionic Acids

Her beskriver vi syntesen av et lite PTA-bibliotek med en teoretisk mangfold av 9,261 forbindelser ved bruk av 1 g av perler fra trinn 4.8. Merk at en 90 mikrometer tentagel perle inneholder ca 2,9 millioner perler per gram; derfor redundans avbiblioteket vil være 2,9 x 10 6/9261 = 312 eksemplarer. Vi bruker bromeddiksyre, (R)-2-bromopropanoic og isotopisk merket med (S)-2-bromopropanoic syre-d 4 da syrene og 7 forskjellige aminer (A1 ~ A7, se figur 5 for detaljer) for aminering. Sprøyte reaktorer og en vakuum-manifold vil bli brukt for å utføre syntesen.

  1. Tilsett 10 ml av 01:01 DCM: DMF til sprøyten fra trinn 4.8; bruke en 1000 mL pipette med en avkortet pipettespissen å splitte alle 1 g perler jevnt i tre 5 ml sprøyte reaktorer. Merke dem som B (bromeddiksyre), R ((R)-2-bromopropanoic) og S ((S)-2-bromopropanoic syre-d 4). Vask alle tre sprøyter med DCM 3x, og vaske sprøyter merket med R og S med vannfri THF 3x, vaske sprøyten merket med B med DMF 3x.
  2. Sprøyte R og S. BTC kobling av bromopropanoic syre.
    1. Forbered en frisk BTC / THF løsning. Legg enpproximately 200 mg av BTC inn i hetteglasset i en avtrekkshette, forsegle den med hetten. Vei mengden av BTC i hetteglasset. Beregn mengden av oppløsningsmidlet er nødvendig og tilsett vannfri THF inn i ampullen for å lage en 20 mg / ml BTC / THF-løsning.
    2. Forbered Bromo syrer / BTC blanding. Til (R)-2-bromopropanoic syre (89 mL, 0.95 mmol) og (S)-2-bromopropanoic syre-d 4 (89 pl, 0,95 mmol) i to små ampuller for seg. Til hver ampulle, tilsett 5 ml av den ovennevnte 20 mg / ml BTC / THF-løsning. Forsegle de to hetteglassene og sette dem i -20 ° C fryser i 20 min.
    3. Til 1,125 mL, 02:01 THF / DIPEA (750 mL THF, 375 mL DIPEA, 2,2 mmol) for å sprøyte R og S for seg. Bland perler med pipettespissen. La dem sitte i 5 min.
    4. Ta to avkjølt Bromo syrer / BTC blandinger fra trinn 5.2.2, legger 2,4,6-Trimethylpyridine (356 mL, 2,7 mmol) til hver ampuller. Hvite utfellinger vil danne umiddelbart. Påfør den tilsvarende suspensjon direktetil de gjort basiske perler (sprøyte R og S i trinn 5.2.3) så snart som mulig og deretter sette dem på en shaker til å riste i henhold til 120 rpm for 2 hr.
      Merk: oppløsning i sprøyten reaktorer bør være en blek gulaktig suspensjon i løpet av hele reaksjonsforløpet. En mørkere farge er en indikasjon på overdreven varme som frigjøres under den første tilsetningen av syrekloridoppløsningen. Dette kan løses ved ytterligere nedkjøling eller fortynne Bromo syrer / BTC blanding.
  3. Sprøyte B. Bromeddiksyre kopling med DIC
    1. Tilbered en frisk 20 ml, 2 M bromeddiksyre / DMF-løsning. Tilbered en 20 ml, 2 M DIC / DMF-løsning.
    2. Tilsett 2 ml av 2 M bromeddiksyre / DMF-løsning for å sprøyte B, ristes forsiktig. Tilsett 2 ml av 2 M DIC / DMF-løsning for å sprøyte B, ristes forsiktig.
    3. Sett sprøyte B på samme shaker som sprøyte R og S
  4. Etter to timer, ta sprøyte R, S og B fra shaker. Vask alle tre sprøyter grundig med DCM 5x. Vask deretter med DMF 5x. Legg merke til at sprøyte R og S kan ikke vaskes med DMF før de blir vasket med DCM eller THF først.
  5. Pool alle perlene fra sprøyter R, S og B til en 12 ml sprøyte reaktoren. Vask alle perlene med DMF 5x.
  6. Tilsett 10 ml av 01:01 DCM: DMF til sprøyten; bruke en 1000 mL pipette med en avkortet pipettespissen å splitte alle perlene jevnt i syv individuelle 2 ml sprøyter, merke dem som A1-A7.
  7. Avgangsprøve. Forbered 10 ml, 2 M primære amin / DMF løsninger for hver av de 7 aminer som er oppført i figur 5.. Tilsett 5 ml each amin-løsning til det tilsvarende sprøyte A1-A7. Inkuber alle syv sprøyter i en 60 ° C inkubator med risting over natten.
  8. Etter inkubering vaskes alle perlene grundig med DMF. Ta noen av perler fra hver sprøyte, og sjekk med chloranil test. Hvis perlene blir grønne (positive) innen 3 min, fortsett med neste trinn. Hvis negativ, gjenta steg 5,7 for de negative sprøyter.
  9. Gjenta trinn 05.01 til 05.08 2x for å fullføre trimer. Valgfritt trinn: Etter hver syklus, anbefaler vi å sjekke syntesen kvaliteten ved massespektroskopi som beskrevet nedenfor. Alle 9261 forbindelser er nå syntetisert på tentagel perler som OBOC bibliotek.
  10. Masse spektroskopiske bekreftelse på PTAs.
    PTAs er svært strukturerte oligomerer og har mange fellestrekk i N-denaturert peptider. En av de vanligste problemene med fastfase-syntese av N-metylerte peptidene er den sure nedbrytning under TFA-spalting. Å undertrykke syre degradering, spalting av molekyler som ciklosporin frasolid støtte er ofte utført under lav temperatur. Vi sammenlignet med forskjellige spalte forhold for å spalte forskjellige PTA-molekyler fra den faste bærer. Vi har funnet at, generelt, kan lav temperatur og redusert TFA konsentrasjon effektivt undertrykke syredegradering og gir renere forbindelser.
    1. Forbered 10 ml 01:01 TFA / DCM løsning i en 15 ml tube. Forsegle røret og legg den i en -20 ° C fryseren i 20 min.
    2. Vask kulene som må spaltes med DCM 5x. Rist perlene i DCM i 15 minutter og vasking av perlene igjen med DCM 5x.
    3. Drenere DCM fra sprøyten. Bruk et lysmikroskop, og en pipette med avkortede spiss for å overføre hver enkelt perle inn i en 96-brønns plate, en limstreng per brønn.
    4. Dekk til 96-brønns plate med et dekkglass. Sett plate i en -20 ° C fryser i 15 min.
    5. Ta avkjølt 01:01 TFA / DCM-løsning fra trinn 5.10.1 og tilsett 20 pl av hver av brønnene som inneholder en limstreng. Sett dekselet slip tilbake og put 96-brønn plate på et riste på -20 ° C kjøleskap.
    6. Rist i 20 min. Ta 96-brønns plate ut og skrelle av dekkglass. Føn TFA / DCM fra hver brønn ved å blåse luft eller argon over det. Hvis mer enn 10 perler spaltes, kan en speedvac brukes til å tørke TFA / DCM fra hele platen. Legg merke til at ved dette punktet, vil ikke alle av forbindelsene spaltes av perlene, men det spaltede forbindelser bør være mer enn nok til å utføre massespektroskopi-analyse.
    7. Tilsett 20 pl 6:04 ACN: H 2 O-løsning for å oppløse de spaltede forbindelser fra hver brønn. Spot 0,6 mL av hver forbindelse løsning sammen med 0,6 mL CHCA MALDI matrise på MALDI plate.
    8. Bruk MALDI massespektrometri for å bestemme molekylvekt og sekvens (MS / MS) av hver forbindelse.

6. Chloranil Test

  1. Forbered følgende reagenser frisk for hver test. Løsning A: 2% kloranil (CAS: 118-75-2) i DMF. OppløsningB: 2% acetaldehyd (CAS: 75-07-0) i DMF.
  2. Bland 100 ul av oppløsning A med 100 pl av oppløsning B før testen i et 1,5 ml rør; slippe perlene i og rist. Hvis perlene blir blå i løpet av 5 minutter, angir dette at nærværet av sekundært amin på overflaten av kulene. Primære aminer gi en mørk brun farge i stedet for blir blå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi tre representative MALDI spektrum fra en PTA trimer med linker. Som vist i figur 6A, når spaltet ved romtemperatur ved anvendelse av 50% TFA / DCM-løsning, er signifikant nedbrytning observert. I figur 6A, en topp 593 og 484 samsvarer med linkeren og PTA trimer henholdsvis, viser at hele molekylet ble med hell syntetisert på vulsten, men nedbrytes under spalting. Når spaltes ved lav temperatur stand som beskrevet ovenfor, er mengden av TFA-indusert nedbrytning i stor grad undertrykket som vist i figur 6B. Mekanismen for denne spalting er blitt beskrevet i tidligere litteratur 24, og det antas å gå gjennom et mellomprodukt oksazolidin. PTA-molekyler kan bli sekvensert ved MS / MS-fragmenteringen, og mønsteret er lik den av peptider og peptoids, som vist i Figur 6C. PTA-molekyler syntetisert med (S)-2-bromopropanoic syre-d 4 generelt give bredere toppen på MS og MS / MS-spektra på grunn av tilstedeværelsen av ufullstendige Deutereringsgraden produkter slik som (S)-2-bromopropanoic syre-d 3 (figurene 7A og 7B). Dette kan brukes som en indikasjon på tilstedeværelsen av R-kiralt senter (invertert fra S under aminering) i løpet av sekvense prosedyre. Vi har også funnet at PTA molekyler har en tendens til å danne mer sodiated addukter enn peptoid / peptid derfor lavt natrium vann (for eksempel ionisert vann) og plast-anordning er foretrukket (figur 7C). Et annet for-produkt som kan bli observert i PTA-syntesen er akrylamid dannet fra eliminering av bromid under aminering (figur 7C). Når akrylamid er dannet, blir sekvensen avsluttes. Dette kan løses ved å senke konsentrasjonen av det primære amin til 1 M, for å redusere den basisitet av løsningen. Vi anbefaler utfører chloranil test etter hvert acyleringstrinnet og bruke masse spectroscopy å sjekke produktet etter hvert amination skritt for å sikre kvaliteten på biblioteket.

Figur 1
Figur 1. Strukturell sammenligning av peptidet, peptoid, PTA-og N-metylerte peptid. PTA omfatter peptid (R2 = H), peptoid (R1 = H) og N-metylerte peptid (R1 ≠ H, R2 = Me) . B) PTA foretrekker trans amidbinding konformasjon grunn av sterisk hindring mellom to α-sidekjede. C) PTA har også en foretrukket konformasjon grunn 1,3 allylisk belastning mellom N-erstatning og α-sidekjede. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 2. Sub-monomer syntese av peptoid (R ­ 1 = H) og PTA (R 1 ≠ H). Første trinn er syren acylering av aminet. Andre trinn er avgangsprøve med primære aminer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3. Reaksjons oppsett. En 250 ml tre-halset rundkolbe settes i et tørris / etylenglykol-bad. Den midtre halsen er forbundet med en 150 ml trykkutjevnende dråpetrakt. Venstre og høyre halser er forseglet med en strømningskontrollkort og en septum wed en lang nål som gjør at argonstrøm passere gjennom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4 grunnleggende av splitt-og-pool-syntese. Blanke perler er delt i tre porsjoner, som ble behandlet separat med reaktant A., B og C. Etter at den første reaksjon, alle tre deler av perlene er samlet sammen og blandes. Oppsamlede perler er igjen delt i tre porsjoner, og på nytt behandlet med samme reaktant for hver enkelt del. Etter den andre reaksjonen, er ni ulike forbindelser syntetisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5. Bibliotek oversikt struktur. Tre PTAs er syntetisert etter pentamer peptoid linker. Teoretisk mangfold, 3 3 X 7 3 = 9261. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Typisk MALDI massespektra av en PTA trimer. A) Trimer PTA spaltes med 50% TFA / DCM ved romtemperatur. PTA struktur som vist, [M 1] + = 1077, [M + Na] + = 1,098.9, PTA fragmentering fra TFA cleavage kan tydelig ses på spektrum. B) Trimer cleaved av 50% TFA / DCM henhold optimalisert tilstand, som beskrevet i papiret. TFA-syre induserer nedbrytning er sterkt undertrykket. C) MS / MS-spektret av PTA trimer. Svake Y7 (916) signal er observert, er dette en typisk fragmentering atferd for PTAs. Spectra analysert og generert av mMass 32. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. MALDI spektra av PTA syntese med isotopisk merket monomer og typiske biprodukter. A) MS spektra sammenligning av PTA molekyler syntetisert av blå: (R)-2-bromopropanoic [M 1] + = 760 [M + Na] + = 787 [M + K] + = 803 og rød: (S) - 2-bromopropanoic syre-d 4 [M 1] + = 764 [M + Na] + = 783 [M + K] + = 799. B) MS / MS fragmentering mønstre av de to molekyler vist i A). Legg merke til at på grunn av tilstedeværelsen av d 1, 2 og d d 3 krydder (ufullstendig Deutereringsgraden av alanin), molekyler syntetisert fra (S)-2-bromopropanoic syre-d 4 vanligvis gi bredere topper C) Red:. Spektrum av en PTA dimer syntetisert og kløyvde under optimaliserte tilstand. Blå:. PTA dimer syntetisert med to M methoxyethylamine løsning og spaltet i normal filtrert vann Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Peptid tertiære amider (Ptas) er en superfamily av peptidomimetiske oligomerer. I tillegg til den godt studerte peptider, peptoids og N-metylert peptider, en stor del av forbindelsene i denne familien forblir lite studert, majorly grunn av manglende syntetisk metode for å få tilgang til de generelle N-alkylerte peptider. Her beskriver vi en effektiv metode for å syntetisere PTAs med chirale byggeblokker avledet fra aminosyrer. Tidligere har vi rapportert å bruke en ny sub-monomer rute til syntese biblioteker av PTA molekyler 23. Vi har vist at PTAs er svært strukturerte oligomerene som besitter conformational begrenser gjennom ryggraden. Når testet in vivo, PTA molekyler viste forbedret celle permeabilitet og dermed forbedret aktivitet 25. Imidlertid, sammen med alle de fordeler, PTAs også komme med noen syntetiske utfordringer, majorly fra acylering av sekundære aminer ved hindrede stillinger. Den α-sidekjeden som gir konformasjonsendringrestriksjons bringer også steriske hindringen for følgende koplingstrinn. For å overvinne disse syntetiske utfordringer, har vi utført en omfattende optimaliseringsstudie og bestemt BTC som den beste koblingsreagens for denne reaksjonen 23.

Det sentrale trinn i den syntetiske rute er BTC lettes acylering av sekundært amin. Under denne prosessen gjør det mulig BTC generering av et syrekloridet in situ 26,27. De fleste andre koblings-reagenser, som danner en av de aktive estere eller syreanhydrider som mellomprodukter mislyktes i å gi rent acylering for kontinuerlig PTA-syntese. Eksistensen av tidligere PTA heter i stor grad svekker koplingsvirkningsgraden av følgende PTA-enhet på grunn av sterisk hindring. Derfor, for syntese av flere PTAs, et sterkt aktivt mellomprodukt med en liten avspaltbar gruppe er sterkt foretrukket. Blant alle de koblingsbetingelser som vi har testet, in situ generert syreklorid av BTC virker best i vår hånd. Imidlertid, selv med de høyaktive syreklorider, anbefales det for å unngå sterkt sterisk hindrede aminer så som α-forgrenede primære aminer i biblioteksyntese mindre testet på forhånd. Aromatiske aminer slik som Anile ofte føre til ufullstendig substitusjon og således bør også unngås. I løpet av BTC koblingstrinnet, bør oppløsningen alltid være en blek gul til oransje farge; en mørkere farget løsning er en indikasjon på overoppheting og kan resultere i lavere yield og økt dannelse av biprodukter. Dette kan generelt løses ved ytterligere kjøling av BTC-løsning, redusere størrelsen på reaksjonen og raskere overføring av den aktiverte BTC / syreløsning. Foruten BTC, ,2-dihydrokinolin (EEDQ) er N-etoksykarbonyl-2-etoksy-1 en annen koblings-reagens som fungerer godt i PTA-syntese. Det sentrale mellomprodukt er et blandet anhydrid med en karbonsyre relativt liten avspaltbar gruppe. I tilfellet med EEDQ, er tre tilsvarende EEDQ oppløses sammen med syren i DCM og deretter apbli benyttet på perlene ved romtemperatur. Reaksjonen er normalt ferdig i løpet av 2 timer med svak rysting. Denne reaksjon frigjør CO2 under reaksjonen; Derfor reaksjonssystemet bør ikke være lukket.

En annen viktig trinn er spalting og karakterisering av PTA-molekyler. Et karakteristisk MS / MS fragmentering mønsteret har blitt observert når sekvense PTA molekyler via MALDI-MS/MS (figur 6). Den består med lav intensitet for den siste y ion (vist i purpur i figur 6C og økt intensitet av y6, Y5 Y4, B2, B3 ioner). Analoge mønstre har blitt observert fra N-denaturert peptid fragmentering i forrige rapport 28. På grunn av økt stabilitet av mellom oxazolidine, N-denaturert peptider har en tendens til å gi sterke b ioner 28. Dessuten er det velkjent at N-metylerte peptid er ustabilt i surt miljø under både TFA spalting og MALDI-massespektroskopi 2428, 29. Mekanistisk undersøkelse har vist at på grunn av den konformasjonsendring begrensning på ryggraden, er karbonyl oksygen atom av den foregående rest ofte i nærhet av karbonylgruppen ved kløyvingssetet, noe som fremmer dannelsen av oksazolidin mellomprodukt 29. Av de grunner som er nevnt ovenfor, både PTAs og N-metylert peptider må spaltes fra faste bærere ved lav temperatur ved bruk av kontrollerte konsentrasjoner av TFA 26, 30. Etter vår erfaring, oppstår den mest praktiske metode for spalting individuelle PTA rester ved -20 ° C med en pre-avkjølt, -20 ° C løsning av 50% TFA / DCM. Denne fremgangsmåten sterkt undertrykker dannelsen av syre degraderte produkter.

Etter å mestre denne teknikken, kan biblioteket med PTA monomer avledet fra andre naturlige aminosyrer som leucin, fenylalanin, glutamin, etc. syntetiseres også. En høy kvalitet PTA biblioteket kan bli vist against ulike protein mål ved hjelp av våre tidligere publiserte på-perle screeningprotokoller 31. Hit-forbindelser er identifisert fra screening kan karakteriseres ved massespektroskopi og resynthesized for ytterligere test ved bruk av protokollen som er beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke dr. Jumpei Morimoto og Dr. Todd Doran for verdifull assistanse. Dette arbeidet ble støttet av en kontrakt fra NHLBI (NO1-HV-00242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
  2. Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
  3. Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
  4. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
  5. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
  6. Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
  7. Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
  8. Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
  9. Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
  10. Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
  11. Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
  12. Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
  13. Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
  14. Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
  15. Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
  16. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
  17. Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
  18. Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
  19. Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
  20. Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
  21. Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
  22. Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
  23. Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
  24. Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
  25. Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8, (10), 2312-2321 (2013).
  26. Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
  27. Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
  28. Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
  29. Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
  30. Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
  31. Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
  32. Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics