Name: La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Scopri la proteomica quantitativa mediante dimetilazione riduttiva e spettrometria di massa per analizzare campioni complessi. Questo metodo rapido ed economico consente di quantificare l'abbondanza relativa delle proteine con alta precisione.

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Ringraziamo SP Gygi e GM Church per l'aiuto e la guida. Questo lavoro è stato sostenuto da una cattedra d'eccellenza del CNRS per ACT.

NOTA: Questo metodo è stato descritto in precedenza 12. 1. Proteina Isolamento Preparare 1 mg di proteina cellulare da parte delle cellule di lisi, preferibilmente con metodi fisici come stampa francese, perlina percosse, o ultrasuoni. Evitare di lisozima-lisi cellulare mediata perché l&#39;enzima si confondono misure di spettrometria di massa. 2. TCA precipitazione delle proteine Aggiungere acido tricloroacetico 1 volume (TCA) a 4 volumi di proteine ​​e freddo in ghiaccio per 10 minuti per precipitare le proteine. Centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml di acetone ghiacciato e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e invertire il tubo sul banco per asciugare il pellet per 15 min. Pellets proteine ​​Conservare a -80 ° C. 3. Denaturare le proteine ​​e ridurre disolfuro Obbligazioni Resospendere proteine ​​a ~ 2 mg / ml in 500 microlitri tampone di denaturazione e riduzione (o 4 M urea o 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Facoltativamente, includere un inibitore della proteasi nel buffer. Incubare proteine ​​per 30 min a 56 ° C, seguita da 10 minuti a temperatura ambiente. 4. Aklylate gratis solfidrile Gruppi di interrompere Irreversibilmente legame disolfuro Formazione Preparare fresco 0.3 M iodoacetamide in acqua. ATTENZIONE! Iodoacetamide è altamente tossico. Aggiungere 25 microlitri 0,3 M iodoacetamide (15 mm concentrazione finale) a 500 microlitri di proteine ​​e incubare per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Placare iodoacetamide con l&#39;aggiunta di 10 ml di 300 mM DTT (5 mM concentrazione finale DTT). Conservare le proteine ​​alchilati a -80 ° C. 5. Digestione delle proteine TCA precipitare le proteine ​​(come descritto al punto 2) e risospendere in 1 ml di HEPES 50 mM (pH 8.2), 1 M urea. Preparare una soluzione stock di Lysyl endoproteinase (Lys-C) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / mL e aggiungere 5 ml della soluzione proteica. Incubare la miscela per 16 ore a temperatura ambiente. Garantire la concentrazione finale Lys-C è 10 ng / ml e il rapporto proteina-to-lysC (w / w) è 1/50 a 1/200. Risospendere 20 mcg sequenziamento grado tripsina in 40 ml di 50 mM di acido acetico, aggiungere 5 ml (10 mg tripsina) alla Lys-C digest, e incubare per 6 ore a 37 ° C. Utilizzare la stessa concentrazione proteasi e rapporti proteasi-to-proteina per Lys-C come usato per la tripsina. 6. Fase inversa Peptide Estrazione <ol><li> Acidificare peptidi aggiungendo acido trifluoroacetico (TFA) a una concentrazione finale di 0,5% (pH ≈ 2). Attaccare una colonna C18 a un collettore di aspirazione. Usare la massima portata possibile per tutti i passaggi tranne carico e eluizione dei peptidi. </li><li> Colonna bagnato con 6 ml di acetonitrile (ACN). Lavare colonna con 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, poi equilibrare con 6 ml 0,1% TFA. Non permettere che lacolonna di funzionare a secco tra i passaggi. </li><li> Arrestare pressione di vuoto e carica 500 pg di peptidi sulla colonna ad una velocità di flusso di circa 1 ml / min. Una volta peptidi hanno legato alla colonna, riavvio vuoto e lavare con 6 ml 0,1% TFA, poi con 3 ml di tampone di acido citrico (0,09 M di acido citrico, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5). Nota: gli importi più elevati di peptide possono essere etichettati ma la colonna C18 capacità di legame dovrebbero essere almeno due volte più elevate rispetto alla quantità peptide per evitare la perdita del campione. </li></ol> 7. On-colonna Peptide Labeling da riduttiva dimethylation (Redi Labeling) Eseguire questo passaggio sotto una cappa chimica cianuro di idrogeno viene rilasciato in bassa concentrazione durante il processo di etichettatura. <ol><li> Preparare 12 ml di &quot;leggere&quot; e &quot;pesanti&quot; buffer Redi a metilare ammine peptide gratuiti. Tampone Redi Luce si compone di 0,8% di formaldeide e 0,12 M sodiocianoboroidruro trasportano idrogeno in thEIR distribuzioni isotopiche naturali in tampone acido citrico. Tampone REDI pesante consiste di 0,8% di formaldeide deuterato e 0,12 M sodiocianoboroidruro deuterato in tampone acido citrico. </li><li> Incubare colonna contenente peptidi aggiungendo 10 ml luce o tampone Redi pesante alle colonne contenenti peptidi a portata di 1 ml / min e ripetere garantire un&#39;etichettatura completa. Lavare colonna con 6 ml 0,1% TFA e poi con 1 ml di 0,5% acido acetico. </li><li> Arrestare vuoto ed eluire prima peptidi marcati con 1 ml di 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi con 1 ml di 80% ACN, 0,5% di acido acetico utilizzando una portata di circa 0,5 ml / min. Se lo si desidera, misurare l&#39;efficienza etichettatura dei singoli campioni mediante spettrometria di massa prima della miscelazione campioni pesanti e leggeri (vedi &quot;Rappresentante dei risultati&quot;). Mescolare 01:01 campioni peptide pesanti e leggeri etichettati per essere quantificata mediante spettrometria di massa. </li></ol> 8. Peptide separato miscela in base pH fase reversibile (BPRP) Cromatografia &lt;/ P&gt; PH basico fase inversa (BPRP) cromatografia per separare la miscela di peptidi in più frazioni, che vengono analizzati in modo indipendente da LC-MS/MS per aumentare la copertura proteoma. <ol><li> Frazionare la miscela peptidica su una colonna C18-HPLC applicando un gradiente di concentrazione crescente ACN in 10 mM di bicarbonato di ammonio (pH 8). Iniziare con 5% (v / v) ACN per 5 min, aumentare al 35% ACN, in 60 minuti, e poi al 90% ACN in 1 min. Conservare il ACN 90% per 4 minuti prima di ridurre l&#39;ACN al 5% di riequilibrare la colonna per 9 min. Raccogliere 96 frazioni di pari volume in una piastra a 96 pozzetti (da A1 a H12). Monitorare il frazionamento utilizzando un rivelatore UV a 220 nm, mentre i peptidi sono eluizione largo della colonna (10-70 min per le condizioni qui descritte). </li><li> Combina frazioni da pozzi A1, C1, E1 e G1 (frazione A1), da pozzi B1, D1, F1, e H1 (frazione B1), da pozzi A2, C2, E2, e G2 (frazione A2) e di conseguenza per l&#39; restanti frazioni. Rimuovere il solvent utilizzando una centrifuga a vuoto. Peptidi Risospendere da frazioni A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 e B12 in 130 ml di 1 M urea/0.5% TFA e purificare usando StageTips come descritto al punto 9. Negozio frazioni B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 e A12 a -20 ° C. </li></ol> 9. Purify peptidi da Stop and Go estrazione (StageTips) Preparare C18-StageTip 7 microcolonne da imballaggio 200 ml punte per pipette con due C18 dischi con un diametro interno (ID) di 1,07 mm. Mettere Fase Consigli in tubi Eppendorf. Utilizzare una microcentrifuga per lavare punte con 130 ml di metanolo, quindi 130 ul 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Equilibrare StageTips con 130 microlitri 0,1% TFA. Trasferire la miscela di peptidi a StageTips e lavare con 130 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,5% di acido acetico. Eluire peptidi prima con il 20 microlitri 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi 20 l 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Combina eluati unnd secco mediante filtrazione sotto vuoto. 10. Microcapillare LC-MS/MS <ol><li> Sciogliere peptidi in 1-5 ml di acido formico al 5%, 5% ACN ad una concentrazione di circa 1 mg / mL. Risolvere ~ 1 mg peptidi su un 100 pm × 20 cm C18-invertiti colonna HPLC in fase con gradiente 6-22% in ACN 0,125% acido formico ripartiti lungo 75 o 100 minuti ad una portata di ~ 300 Nl / min. </li><li> Identificare i peptidi utilizzando un LTQ Orbitrap Velos 12 o simile piattaforma liquido cromatografia-spettrometria di massa con uno spettrometro di massa che preveda ad alta risoluzione ed elevata accuratezza di massa. Azionare lo spettrometro di massa in modalità dati-dipendente con un full MS scansione (risoluzione di 60.000), acquisita nel analizzatore Orbitrap. Generare trappola ionica lineare MS / MS spettri per i 20 ioni più abbondanti rilevati nello spettro completo di MS. Impostare il controllo automatico del guadagno (AGC) target a 1 x 10 6 per la piena SM e 2000 per MS / MS. Impostare tempi massimi di accumulo di ioni a 1.000 msecper la SM e 150 msec per MS / MS. Escludi frammentate ioni peptide precursore di un&#39;ulteriore selezione da MS / MS per 20-60 sec. </li></ol> 11. MS / MS Acquisizione Dati Identificare peptidi confrontando file RAW spettri MS / MS ad un database teorico con un algoritmo come SEQUEST 8 utilizzando questi parametri (Tabella 1). Tabella 1. Peptide ricerca database dei parametri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Parametri generali </td><td> digestione completamente trittico con un massimo di 2 perdere fratture </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm tolleranza ione precursore </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 Da tolleranza agli ioni frammento </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Modifiche statici </strong&gt; </td><td> 57,02146 Da sulla cisteina, carboxyamidomethylation </td></tr><tr height="19"><td> 28,03130 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation luce </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Modifiche dinamici </td><td> Da 15,99,491 mila su metionina, ossidazione </td></tr><tr height="19"><td> 6,03766 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation pesante </td></tr></tbody></table><ol><li> Filtra peptidi ad aliquote scoperta falso 1% con un metodo quale il 9 strategia target-richiamo utilizzando un database di open reading frames negli orientamenti attuali e invertiti. </li></ol> 12. Peptide Quantificazione Calcolare le aree di coppie pesanti e leggeri di MS1 estratti ioni cromatogrammi (aree di picco MS1) e peptide segnale-rumore (S / N) Formati 10. Includi coppie peptide solo quando il loro segnale medio-to-noirapporto se è superiore a cinque. Quantificare abbondanza relativa di un peptide nei due campioni come il rapporto delle aree dei picchi MS1 di versioni pesanti e leggere dello stesso peptide (MS1 rapporto dell&#39;area di picco). Calcola abbondanze proteici relativamente come mediana rapporto area del picco MS1 per tutti i peptidi della proteina.

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Gli autori dichiarano di non interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Numerosi punti fanno etichettatura isotopo stabile di peptidi utilizzando un metodo interessante per la proteomica quantitativa dimethylation riduttiva (etichettatura Redi): reagenti poco costosi di etichettatura (reagenti costano meno di $ 1 per esempio), velocità di reazione rapida (~ 10 min), assenza di prodotti collaterali, alte riproducibilità (figure 3, 4), prodotti di reazione stabili, capacità di utilizzare qualsiasi proteasi e ad alta efficienza di ionizzazione dei peptidi marcati. Etichettatur...

Misurare differenze di concentrazione di molte proteine ​​tra i campioni complessi è una sfida centrale in proteomica. Sempre più spesso, questo viene fatto etichettando le proteine ​​in ogni campione con diversi tag isotopiche, mescolando i campioni, e l&#39;utilizzo di spettrometria di massa per quantificare le differenze di concentrazione. Esistono diversi metodi per l&#39;etichettatura isotopica stabile di proteine ​​e peptidi. 15 N etichettatura 1 e 2 SILAC introdurre etichette isotopiche metabolicamente in vivo, che iCAT 3, iTRAQ 4, e la riduzione dimethylation 5 aggiungere tag isotopi stabili dopo l&#39;estrazione delle proteine ​​e la digestione. Tra questi metodi, dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) sta guadagnando popolarità come un poco costoso, metodo riproducibile per quantificare le differenze di concentrazione di proteine ​​in quasi ogni tipo di campione. Etichettatura REDI comporta peptidi che reagiscono con formaldeide per formare una base di Schiff, che viene poi ridottoda cianoboroidruro. Questa reazione dimethylates gruppi amminici liberi su N-Termini e laterali lisina catene e monomethylates proline N-terminale. Il protocollo qui descritto metila peptidi nel campione 1 con un&#39;etichetta &quot;luce&quot; utilizzando reagenti con atomi di idrogeno nella loro distribuzione isotopica naturale e campione 2 con un&#39;etichetta &quot;pesante&quot; utilizzando formaldeide deuterato e cianoboroidruro (Figura 1). Ogni gruppo amminico dimetilato su un peptide provoca una differenza di massa di 6,0377 Da tra luce e forme pesanti, che viene impiegata per distinguere tra i due moduli utilizzando uno spettrometro di massa. In particolare, abbondanze peptide relativi vengono quantificati come rapporto delle aree cromatogramma ionico MS1 estratti (MS1 rapporto dell&#39;area di picco) di luce e versione pesante per ogni coppia peptide ione. L&#39;abbondanza relativa di una proteina è calcolato come rapporto mediano area del picco MS1 tra tutti i peptidi della proteina. In questo rapporto, descriviamo un protocollo robusto per comportamentozione esperimenti di marcatura Redi da LC-MS/MS che include peptide estrazione a fase inversa in fase solida, etichettatura on-column Redi, peptide frazionamento da pH basico fase (BPRP) cromatografia inversa, e la purificazione di miscele di peptidi utilizzando StageTips (Figura 2) . Discutiamo vantaggi ei limiti di utilizzo etichettatura redi per proteomica quantitativa.

<table><tbody><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>precipitazione proteica</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>precipitazione proteica</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>denatura, ridurre la proteina</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>denaturare, ridurre la proteina</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>denaturare, ridurre, alchilare la proteina</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Mini Cocktail completo</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>denaturare, ridurre la proteina</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>proteina alchilata</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>risospensione, estratto, etichettare la</td></tr><tr><td>proteina Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>risospendere la proteina</td></tr><tr><td>Lysyl Endoprotease</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>digestione delle proteine</td></tr><tr><td>Tripsina di grado sequenziale</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>digestione delle proteine</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>digestione delle proteine</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Estrazione di peptidi in fase inversa</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 cartucce</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td>Estrazione di peptidi in fase inversa</td></tr><tr><td>Collettore di estrazione</td><td>Acque</td><td>WAT200609</td><td>Estrazione di peptidi in fase inversa</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>vari</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>" luce" marcatura di peptidi</td></tr><tr><td>Cyanoborohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>" luce" Etichettatura dei peptidi</td></tr><tr><td>Formaldeide deuterata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>" pesante" marcatura di peptidi</td></tr><tr><td>Isotopi CDN</td><td>cianoborodeuteruro di sodio</td><td>D-1797</td><td>" pesante" marcatura di peptidi</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>marcatura di peptidi</td></tr><tr><td>colonna C18-HPLC (4,6 x 250 mm, 5 &; m granulometria)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>cromatografia a fase inversa pH basico</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>vari</td></tr><tr><td>dischi Empino C18</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>Suggerimenti per la fase</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich 494437</td><td></td><td>punte STAGE</td></tr></tbody></table>

la proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per stable isotope labeling

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Etichettatura isotopi stabili di peptidi di dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un metodo per quantificare con precisione le differenze di espressione proteica tra campioni utilizzando la spettrometria di massa. Etichettatura Redi viene eseguita utilizzando sia regolare (luce) o deuterati (pesanti) forme di formaldeide e sodio cianoboroidruro di aggiungere due gruppi metilici ad ogni ammina libera. Qui mostriamo un protocollo robusto per l&#39;etichettatura Redi e comparazione quantitativa di miscele di proteine ​​complesse. Campioni di proteine ​​di confronto vengono digeriti in peptidi, etichettati a portare luce o tag metilici pesanti, mescolato, e co-analizzati mediante LC-MS/MS. Abbondanze relative di proteina sono quantificate confrontando le aree di picco di ioni cromatogramma delle versioni etichettate pesanti e leggeri del peptide costituente estratto dalla piena MS spettri. Il metodo qui descritto comprende la preparazione del campione mediante estrazione in fase solida in fase inversa, etichettatura Redi on-column di peptidi, peptide frazionamento da pH rev basefase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip depurazione peptide. Discutiamo vantaggi ei limiti di etichettatura Redi rispetto ad altri metodi per isotopi stabili incorporazione. Evidenziamo nuove applicazioni utilizzando etichettatura Redi come un metodo rapido, economico e preciso per confrontare le abbondanze di proteine ​​in quasi ogni tipo di campione.

Abbiamo valutato l&#39;accuratezza, la precisione e riproducibilità di etichettatura Redi utilizzando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisati cellulari interi. In primo luogo abbiamo quantificato l&#39;efficienza etichettatura Redi di un mix di C. phytofermentans lisati proteici da cellulosa (pesante etichetta, H) e glucosio (etichetta luce, L) culture. Quando filtrato per un peptide tasso di scoperta di falsi 1%, questo campione conteneva 11.194 sequenze peptidiche unici...

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l&#39;analisi di miscele proteiche che utilizzano l&#39;approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare le concentrazioni di molte proteine tra campioni mediante spettrometria di massa utilizzando la proteomica pronta all'uso. Questo viene ottenuto innanzitutto digerendo le proteine di ciascun campione per generare miscele di peptidi. Successivamente, i due campioni vengono mescolati e i peptidi nel campione misto vengono frazionati e desalati.Successivamente, il campione misto viene analizzato mediante spettrometria di massa. Infine, i peptidi vengono identificati confrontando gli spettri MS con un database target-decoy di tutti i peptidi potenziali presenti nei campioni e viene quantificata l'abbondanza relativa dei peptidi tra i campioni. In definitiva, la proteomica rapida consente la quantificazione dell'abbondanza relativa di numerose proteine tra campioni complessi.I principali vantaggi della demetilazione riduttiva rispetto ad altri metodi di marcatura isotopica stabile, come iLite, consistono nel fatto che ready è un metodo rapido, economico e accurato che non richiede trois specifici o un mezzo sintetico, il che significa che può essere applicato a quasi ogni tipo di campione. Per iniziare, preparare un milligrammo di p

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13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

Livello di specie reattive di ossigeno è elevata quando le cellule incontrano condizioni di stress. Qui si mostra l'esempio di 3'-3 'colorazione diaminobenzidina così come l'etichettatura cysTMT e spettrometria di massa per analizzare il proteoma redox...

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Vengono descritti due metodi per assegnare i segnali di risonanza magnetica nucleare α- e ε-dimetilammina di una lisina N-terminale riduttivamente metilata 13C. Un metodo utilizza la selettività indotta dal pH della reazione di metilazione riduttiva e l'altro utilizza l'aminopeptidasi per rimuovere selettivamente la lisina N-terminale.

Metodi per identificare le risonanze NMR dell'ammina 13C-dimetil N-terminale su proteine metilate riduttivamente

Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Qui, presentiamo imparziale quantificazione di occupazione acetilazione e/o succinylation site-specific protein (stechiometria) di un intero proteoma attraverso un'analisi raziometrici endogeno modifiche modifiche introdotte dopo quantitativa Acilazione chimica utilizzando anidridi con etichetta isotopo stabile. In combinazione con spettrometria di massa sensibile acquisizione dati-indipendente, sito accurata occupazione misurazioni sono ottenute.

Quantificazione di site-specific Protein lisina acetilazione e stechiometria Succinylation usando la spettrometria totale di acquisizione dati-indipendente

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale che regola molteplici percorsi biologici. La spettrometria di massa è la migliore tecnologia per profilare globalmente il R-metil-proteoma, quando accoppiata ad approcci biochimici per l'arricchimento peptidico modificato. Il flusso di lavoro progettato per l'identificazione ad alta confidenza della R-metilazione globale nelle cellule umane è descritto qui.

Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine

L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Questo articolo descrive un metodo di preparazione del campione basato sull'inattivazione termica per preservare i peptidi endogeni evitando la degradazione post-mortem, seguito dalla quantificazione relativa utilizzando l'etichettatura isotopica più LC-MS.

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Scopri la proteomica quantitativa mediante dimetilazione riduttiva e spettrometria di massa per analizzare campioni complessi. Questo metodo rapido ed economico consente di quantificare l'abbondanza relativa delle proteine con alta precisione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

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