La combinaison unique molécule manipulation et d'imagerie pour l'étude des interactions protéine-ADN

Biology

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Summary

Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

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Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

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Abstract

Introduction

Molécule unique (SM) techniques ont considérablement développé au cours des trente dernières années pour répondre à la nécessité de surmonter certaines des limites de mesures de la solution, en vrac traditionnels 1-3. La manipulation de molécules biologiques simples a créé la possibilité de mesurer les propriétés mécaniques des biopolymères 4 et de contrôler les paramètres mécaniques de protéine-protéine 5 et interactions protéine-ADN 6,7. SM détection de fluorescence, d'autre part, représente un outil très polyvalent pour l'étude de l'activité de la protéine in vitro et in vivo, ce qui conduit à la possibilité de localisation et de suivi de molécules individuelles avec une précision nanométrique. Par ajustement de l'appareil d'étalement de point de fonction-SM de l'image, en fait, on peut réaliser avec une précision de localisation en fonction principalement de rapport signal-sur-bruit (SNR) et d'atteindre une limite de l'ordre de 8,9 nanomètre. Ces méthodologies trouver puissantedes applications dans l'étude de la dynamique des protéines motrices, ainsi que des processus de diffusion qui sous-tendent la recherche de cible dans des protéines de liaison à l'ADN. La fonction de détermination de constantes de diffusion en fonction de la séquence d'ADN, le temps de séjour sur la cible et en mesurant la longueur de l'ADN étudié lors d'événements de diffusion à une dimension avec précision, représentent un outil puissant pour l'étude de la dynamique de l'interaction protéine-ADN et à l'enquête des mécanismes de recherche de cible spécifique.

Récemment, la combinaison de ces deux techniques a produit une nouvelle génération de dispositifs expérimentaux de 10 à 14 permettant la manipulation simultanée d'un substrat biologique (par exemple un filament d'actine ou une molécule d'ADN) et la détection / localisation d'un partenaire d'interaction enzyme (par exemple myosine ou d'une protéine de liaison à l'ADN). Les avantages de ces techniques reposent principalement sur la possibilité d'exercer un contrôle mécanique sur le polymère piégé, ainsi enabling l'étude de la dynamique d'interaction par rapport à des forces ou des couples. En outre, la méthode permet de mesurer les réactions biochimiques loin de la surface, en évitant l'une des principales limites des méthodes classiques SM, à savoir, la nécessité pour l'immobilisation des molécules à l'étude sur une surface (lame de verre ou microsphères).

La combinaison des deux techniques de molécules simples, il faut surmonter plusieurs difficultés techniques, principalement en raison des exigences de stabilité mécanique et SNR suffisant (en particulier en exigeant la localisation avec une précision nm) 15. En particulier, lors de l'accouplement détection par fluorescence SM avec des pincettes optiques, la réduction du bruit et photoblanchiment des lasers infrarouges piégeage 16 et le contrôle des tampons biochimiques pour l'assemblage des complexes biologiques et la performance des mesures expérimentales 11 sont d'une importance primordiale. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer avec succèsmesures dans une configuration de localisation double piégeage / SM fluorescence. La méthodologie est illustrée par l'exemple de la protéine répresseur lactose (Lad) marqué par fluorescence (avec Atto532) et détecté comme il se lie à une molécule d'ADN (coincé entre deux pinces optiques) contenant des séquences spécifiques Laci liaison (c.-à-opérateurs). Nous démontrons l'efficacité de la méthode de détection de la liaison à l'ADN de LacI et la diffusion le long de son contour dans le processus de recherche de cible. La méthode est applicable à n'importe quelle combinaison de séquences d'ADN et de protéine de liaison à l'ADN, ainsi que pour d'autres systèmes (microtubules ou des filaments d'actine et de protéines interagissant avec les moteurs).

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Protocol

1. optiques pincettes installation avec nanomètre stabilité

Le dispositif expérimental doit fournir deux pinces optiques à pointer la stabilité au niveau et l'intensité nanomètre fluctuations du laser de piégeage en dessous de 1%. La combinaison de ces conditions sera d'assurer la stabilité du nanomètre de l'haltère sous tension typique (1 pN - quelques dizaines de PN), la rigidité de piège (0,1 pN / nm) et la bande passante de mesure (taux d'acquisition d'image 20 sec -1). Un schéma du dispositif expérimental est représenté sur la figure 1.

  1. Conception optique des pincettes et la construction 15,17:
    1. Monter l'appareil expérimental sur une table optique avec isolateurs actifs pour réduire les vibrations mécaniques. Monter la structure de microscope sur des isolateurs en élastomère pour absorber le bruit acoustique et des résonances mécaniques de la structure de microscope.
    2. Insérer un isolateur optique dans le trajet du laser de piégeage, à proximité de la source laser, à rdégager des fluctuations d'amplitude aléatoires dues à la rétroaction optique.
    3. Réduire la longueur du trajet du laser de piégeage autant que possible et enfermer l'ensemble dans une boîte trajet scellé pour réduire les fluctuations de pointage laser dues aux courants d'air et les turbulences.
    4. Créer pinces optiques doubles en divisant une seule source laser dans le proche infrarouge (Nd: YAG, de longueur d'onde 1064 nm) en deux faisceaux ayant des polarisations orthogonales. Ne pas utiliser des pièges à temps partagé, car elles provoquent une oscillation de l'haltère sous tension 12.
    5. Utilisez déflecteurs acousto-optique (ordonnateurs délégués) entraînés par Direct synthétiseurs numériques (DDS) pour permettre des mouvements fins de (au moins) un piège et une régulation précise de la tension de l'ADN. DDS permet une meilleure stabilité de piège que les oscillateurs commandés en tension (VCO).
    6. Insérez deux photodiodes de détection de quadrant (QDPs) dans le plan focal arrière du condenseur pour détecter la position des billes emprisonnées avec une précision inférieure au nm.
  2. Vérifiez que l'intensité fluctuations du laser de piégeage à l'entrée du microscope est inférieur à 1% à l'aide d'une photodiode avec une largeur de bande plus grande que la vitesse d'acquisition des images.
  3. Vérifiez la stabilité de pointage des deux lasers de piégeage:
    1. Préparation des perles de silice dans du tampon phosphate: Diluer 20 ul de billes de silice (1,54 um, 10% de solides) dans 1 ml d'acétone, sonication de 30 secondes, vortex brièvement, et centrifuger 2 min à 19 000 x g. Remettre en suspension dans 1 ml d'acétone et lavage répétition. Remettre en suspension dans 1 ml de tampon phosphate 50 mM, laver 2 fois, et enfin remettre en suspension dans 100 ul de 50 mM de tampon phosphate.
    2. Calibrer pinces optiques avec des billes de silice: préparer une cellule d'écoulement en attachant une lamelle sur une lame de microscope à l'aide du ruban adhésif double-collante (environ 60 um d'épaisseur). Débit de 1 mg / ml de BSA et attendre 3 minutes. Débit des billes de silice dilué à 1/1000 dans du tampon phosphate et sceller la chambre d'écoulement avec de la graisse de silicone. Piège une bille dans chaque piège et le calibrage des pièges en utilisant la méthode du spectre de puissance 18. Préparation des perles de silice dans de l'acétate de pentyle et de nitrocellulose: Diluer 20 ul de billes de silice (1,54 um, 10% de solides) dans 1 ml d'acétone, sonication de 30 secondes, vortex brièvement, et centrifuger 2 min à 19 000 x g. Remettre en suspension dans 1 ml d'acétone et lavage répétition. Remettre en suspension dans 1 ml d'acétate de pentyle et laver deux fois. Enfin les remettre en suspension dans de l'acétate de pentyle à 0,1% de nitrocellulose dissoute dans de l'acétate de pentyle.
    3. Etaler 2 ul de billes de silice de 1,54 um de diamètre dissous dans de l'acétate de pentyle + 0,1% de nitrocellulose sur la surface d'une lamelle couvre-objet (24 x 24 mm) en utilisant une seconde lamelle (24 x 60 mm). Fixer la lamelle couvre-objet sur une lame de microscope en utilisant deux morceaux de ruban adhésif double face pour créer une cellule d'écoulement. Remplir la cuve à flux continu avec un tampon de phosphate 50 mM et de la sceller avec de la graisse de silicone.
    4. L'image d'une silice perle en microscopie en fond clair à 2,000X grossissement. Le champ de vision doit être de 7 x 5 pm acquis à 768 x 576 pixels, de sorte que l'image de la bille a un diamètre de 190 pixels. Compenser les dérives thermiques avec un logiciel de rétroaction qui, comme dans la réf. 17, calcule la position xy à partir du centre de l'image et z des anneaux de diffraction et corrige les dérives déplacement d'une étape piézo avec nm précision ou mieux.
    5. Superposez le centre de piège à gauche avec le centre de talon (les niveaux de la PDQ de signaux xy doit être le même mesurée lors de l'étalonnage) et mesurer le bruit de position et son écart-type de la PDQ. Répétez la mesure pour le droit piège.

2. Single Molecule localisation avec précision nanométrique

  1. la conception de la microscopie de fluorescence et de la construction 15,19
    1. Utilisez un rendement quantique élevé et CCD électrons multiplié pour atteindre les ratios nécessaires pour la précision nanométrique localisation élevés signal-bruit.
    2. Choisissez l'optique d'obtenir une image pixel taille ~ 80 nm (par exemple, un grossissement de l'image ~ 200X avec une taille de pixel appareil photo de 16 um). C'est suffisamment petit pour négliger de localisation des erreurs dues à la pixellisation 8, mais suffisamment grand pour collecter un grand nombre de photons par pixel.
    3. Comme source d'excitation, en utilisant une lumière laser qui est polarisée (par passage au travers d'une fibre optique sans maintien de polarisation) ou à polarisation circulaire (par passage à travers un λ / 4 lame d'onde) pour maximiser l'excitation de chromophores individuels, indépendamment de leur orientation.
    4. Choisissez des filtres passe-bande émission que coupure efficacement les lumières laser d'excitation et de piégeage. Remarque: Dans nos expériences, nous avons défini notre protéine avec Atto532 colorant et utilisé un filtre passe-bande d'émission centrée à 600 nm avec bande passante de 100 nm.

3. microfluidique

Pour obtenir un contrôle précis de l'échange de tampon et l'assemblage "en haltère", c'est à dire, la fixation d'une seule molécule d'ADN entre deux microsphères piégés optiquement, un écoulement laminaire sur mesure multicanalsystème doit être développé. Il est composé par une chambre d'écoulement, un réservoir sous pression et un système de commande de pression (Figure 2).

  1. préparation de cellules de flux
    REMARQUE: La chambre d'écoulement utilisé pour des expériences de molécules uniques sur l'interaction protéine-ADN a de préférence quatre entrées et une sortie, pour permettre à quatre flux de tampons parallèles, chacun d'eux contenant l'un des différents éléments nécessaires à l'expérimentation: perles, de l'ADN, protéine, et un tampon d'imagerie marqué par fluorescence. La séparation des composants des canaux de flux permet un assemblage efficace de l'haltère. En outre, le canal de formation d'image est utile pour éviter la fluorescence de fond à partir de protéines de diffusion et atteindre le rapport signal-à-bruit élevé requis pour la localisation de la protéine de liaison à l'ADN avec une précision de l'ordre de quelques nanomètres.
    1. Percez des trous de 1 mm de diamètre dans la lame de microscope (76 x 76 x 1 mm) avec une pointe de diamant, afin de créer 4 entrées et une sortie.
    2. E Cleane des lames de microscope avec de l'éthanol et centrer le port avec le joint torique inséré et la bague de colle dans la diapositive entourant les trous d'accès. Il est fondamental de porter des gants lors de cette étape pour éviter les empreintes digitales, qui viendraient perturber le processus de collage.
    3. Fixer les NanoPorts à la diapositive, puis placez-le dans le four préchauffé à 180 ° C pendant 1 heure pour permettre la fixation complète.
    4. Dessinez le motif de contour de la cellule d'écoulement sur un morceau de papier. Les chaînes doivent être ~ 3 mm de large et correspondre la position des trous sur la lame de microscope.
    5. Placez le dessin au-dessus de deux morceaux de parafilm, et avec un scalpel faire des coupes nettes et continues le long du tracé de la. Retirez toute protubérance formée. Jeter la couche inférieure Parafilm, qui est juste utilisé pour garantir un support propre.
    6. Placer la lame de microscope contenant les NanoPorts attachés à l'envers dans le support métallique.
    7. Alignez soigneusement la chambre aperçu Parafilm avec les trous, en s'assurant eau parafilm ne pas entraver pour les entrées et sortie de la chambre.
    8. Couvrir avec une lamelle de microscope nettoyées (62 x 56 x 0,15 mm) et retirer délicatement l'excès Parafilm entourant la chambre.
    9. Placer deux blocs thermiques, préalablement chauffé à 120 ° C, au-dessus de la cellule de flux pour appliquer une pression constante sur elle. Laissez le Parafilm fondre pendant environ 25 min.
  2. Réservoir sous pression et des récipients tampons
    Le réservoir sous pression doit être faite de plexiglas (ou similaire) et permettre l'hébergement de six récipients tampons. La possibilité d'avoir au moins deux récipients tampons supplémentaires améliore la flexibilité de l'instrument. Notez que les récipients transparents et tubes aider considérablement dans la manipulation flux système et le dépannage des bulles d'air emprisonnées. Luer stérile et jetable seringues lock-tip (2,5 ml), à partir de laquelle les pistons ont été préalablement enlevées, sont de bons récipients tampons et permettent un accès facile à la tubulure d'entrée. Vérifierle volume total de liquide est faible en comparaison avec le volume d'air à l'intérieur du réservoir de pression, une condition essentielle pour obtenir un écoulement lisse et stable.
    1. Connectez vannes d'arrêt à la sortie des conteneurs tampons pour transformer le flux de tampon ou non pendant les expériences.
    2. Montez la cellule d'écoulement sur la platine du microscope. Raccorder les vannes d'arrêt aux entrées de la chambre de flux avec un tube de polyétheréthercétone (diamètre intérieur ~ 150 um) et les raccords sans rebord. Ajouter ~ 3 cm de tube fluoré d'éthylène-propylène (diamètre interne ~ 500 um) en tant que liaison entre le tube et les ensembles de NanoPort de la cellule d'écoulement. Cette étape est essentielle pour réduire le flux de tampon à l'entrée de la chambre pour éviter la rupture de la cellule d'écoulement ou NanoPort détachement de la vitre. L'utilisation d'un grand tube intérieur de diamètre seulement, d'autre part, exige de grands volumes d'échantillons biologiques.
    3. Raccorder la sortie de la chambre d'écoulement à un tube Falcon ouvert à la pression atmosphérique. Cetube sert à l'élimination du tampon s'écoulant hors de la chambre d'écoulement.
  3. Système de régulation de pression
    1. Construire un système de commande de pression capable d'ajuster finement la pression d'air à l'intérieur du réservoir de pression. Ceci peut être réalisé en utilisant deux soupapes commandées par ordinateur, une électrovanne reliée à une source de pression de 0,5 atm (compression) et la seconde à la pression atmosphérique. Électrovannes sont régulièrement ouverts pour environ 7 ms pour augmenter ou diminuer la pression dans la conduite jusqu'à ce que la valeur désirée soit atteinte. Remarque: cette méthode a été adaptée à partir de Carlos Bustamante 20, et elle donne une plus grande fluidité à l'aide d'une pompe à seringue de moteur pas à pas 21.
    2. Ajouter un transducteur de pression commandé par un logiciel écrit sur mesure pour surveiller la pression effective exercée sur le réservoir de pression. Pressions de travail typiques sont de l'ordre de 20 mbar pour le montage d'haltère et 200 mbar pour le lavage des composants du système d'écoulement.

    4. ADN de traîne avec biotinylé Deoxycytidine triphosphate (biotine-dCTP)

    La molécule d'ADN doit être supérieure à 1 um, pour faciliter l'extension et sous flux d'ancrage pour les billes emprisonnées. De plus, une longue ADN empêcher le piégeage de la lumière IR éclairer la protéine de liaison à l'ADN. C'est d'une importance particulière parce que l'absorption de la lumière infrarouge à partir des résultats d'un chromophores excités à l'augmentation photoblanchiment. NOTE: Dans la présente étude, la molécule d'ADN est de 3,7 m de long. La molécule contient trois copies de l'opérateur principal O1 et une copie de chacun des deux opérateurs auxiliaires, O2 et O3. Ces séquences ont été insérés dans le milieu de la molécule, ce qui conduit à peu près équidistant des billes piégées et des faisceaux laser infrarouges.

    1. Mélanger 1 pmol de l'ADN extrémités 3 'linéaires avec 60 pmol de biotine-14-dCTP, 4 pi de désoxynucléotidyltransférase (TdT) tampon Terminal 5x (1 M potassium cacodylate, Tris 125 mM, 0,05% (v / v) de Triton X-100, 5 mM CoCl2 (pH 7,2 à 25 ° C)) et 1,5 ul de TdT et le trou DDH 2 O pour obtenir un volume total de 20 ul. Incuber le mélange à 37 ° C pendant 15 min. Cela se traduira par l'addition de jusqu'à 60 nucléotides de l'ADN par extrémité. Notez que l'ADN surplombs en 3 'sont à queue avec une efficacité supérieure à extrémités encastrées ou contondants.
    2. Purifier l'ADN à queue avec des colonnes de spin ou extraction au phénol / chloroforme et précipitation à l'éthanol après enlever CoCl2 de la mémoire tampon de réaction TdT.
    3. Après purification, l'ADN peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines ou à -20 ° C pour des périodes plus longues, mais éviter de décongeler et de recongeler répétée.

    5. étiquetage protéines groupes thiol avec Atto532

    Titrage par modification des résidus cysteine ​​ne doit pas altérer l'activité de la protéine. Pour surmonter ce problème, nous avons utilisé Lacl mutant, LacIQ231C, un which effectue seulement une cysteine ​​par monomère à la position 231 Ce mutant conserve les mêmes caractéristiques de type sauvage et des modifications chimiques à la position 231 ont été représentés pour ne pas interférer avec la stabilité de la protéine 22. NOTE: Nous avons étiqueté la protéine avec ATTO532 maléimide.

    1. S'assurer que la protéine est dissoute dans un tampon ayant un pH allant de 7,0 à 7,5 et à une concentration allant de 2 à 10 mg / ml. REMARQUE: Dans ces expériences, LacI a été dissous dans du phosphate de potassium 0,3 M, 5% de glucose, pH 7,5 (tampon A).
    2. Dissoudre Tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) à une concentration finale de 100 mg / ml dans H 2 O. Solution PTCE doit être préparée avant de l'utiliser.
    3. Mélanger 100 ul de la protéine avec 3 pi de TCEP et soigneusement vortex.
    4. On dissout le colorant dans du N, N-diméthylformamide (DMF) à une concentration finale de 10 mg / ml de travail à des conditions de faible lumière. Vortex jusqu'à dissolution complète.
    5. mi de réactionx: Ajouter 33 ul de colorant à la protéine + PTCE et vortex soigneusement. Essorage rapide pour collecter autant que possible solution.
    6. Incuber le mélange réactionnel pendant 2 heures dans un shaker (8000 rpm) à 20 ° C (ou à 4 ° CO / N), à l'abri de la lumière.
    7. Dissoudre L-glutathion réduit (GSH) à une concentration finale de 100 mg / ml dans H 2 O. Ajouter 3 ul de mélange réactionnel et on incube dans un agitateur à 8000 tours par minute pendant 15 min. GSH arrête la réaction en bloquant la réactivité des groupes thiol.
    8. On purifie la protéine marquée en utilisant des colonnes de filtration sur gel, la dialyse ou types de concentrateurs de spin. REMARQUE: Dans ces expériences, LacI marqué a été purifié en utilisant des concentrateurs 10 kDa coupure de spin.
      1. On dilue le mélange réactionnel avec 12 ml de tampon A, de l'appliquer au dispositif de concentration, et centrifuger à 8000 xg, 1 h, 4 ° C. Le LacI marqué est donc concentrée à un volume final d'environ 500 pl et l'excès de colorant de la membrane passe dans la flow-travers. Jeter le accréditive et répétez l'étape 5.8.1 au moins trois fois.
    9. Divisez la protéine marquée en petites portions et conserver à -80 ° C. Évitez congélation et décongélation répétée.

    6. combinée optique piégeage et unique molécule expériences d'imagerie de fluorescence

    1. Ajouter 1 ml de tampon A pour les récipients tampons et appliquer une pression de 200 mBar pour laver les tuyaux de raccordement et la cellule de flux. Afin de maximiser la diffusion de la protéine de liaison à l'ADN, ici et dans les étapes suivantes, le tampon A peut être remplacé par un tampon de force ionique faible. NOTE: Dans ces expériences, nous avons utilisé 0.5x TBE.
    2. Vérifier la présence de bulles d'air, ce qui pourrait perturber la fluidité de l'écoulement. Un film doux sur le tube de sortie permettra d'éliminer toutes les bulles restantes.
    3. Diminuer la pression à 20 mbar et vérifiez que tous les canaux et les tubes sont clairement de bulles d'air et le tampon des flux avec des vitesses similaires dans tous les canaux.
    4. Préparer les échantillons à un volume final de 300 ul: des billes de polystyrène revêtues de streptavidine de 1,87 um; 20 pM d'ADN linéaire, biotinylé aux deux extrémités selon l'article 4; 300 pM de Lad tétramère marqué avec Atto532 conformément à l'article 5.
    5. Ajouter l'échantillon à l'un des récipients à seringue dans l'ordre suivant: billes dans le premier canal, de l'ADN dans les deuxième, troisième canal avec le tampon de formation d'image seulement (mémoire tampon du système A + piégeant l'oxygène) et la protéine marquée au quatrième canal.
    6. Mettre à l'écoulement sur 200 mBar pendant 3 minutes pour laisser les échantillons arrivent à l'intérieur du canal d'écoulement. Ensuite, réduire la pression à 20 mbars.
    7. Bien que l'imagerie du premier canal sous un éclairage sur fond clair, passer sur les deux pinces optiques et attraper une bille de polystyrène dans chaque piège.
    8. Déplacez-vous rapidement pour le deuxième canal pour éviter que d'autres perles tombent dans les pièges. Notons que l'arrivée dans le canal de l'ADN est facilement perceptible par l'extrémité de l'écoulement de perles.
    9. Utilisation one AOD, déplacer une trappe (bourrelet) d'avant en arrière autour de l'autre bourrelet pour permettre la fixation de l'ADN d'écoulement étendu entre les deux bourrelets optiquement piégés. Quand un haltère d'ADN est formé, le bourrelet statique commence à suivre le mouvement de la bille qui est activement déplacé d'avant en arrière par le piège.
    10. Déplacez-vous rapidement sur le canal de la mémoire tampon et désactiver le flux de tampon. Effectuer une force d'extension de l'analyse de la courbe 4,23-25 ​​pour vérifier la présence d'une seule molécule d'ADN. Si plus d'une molécule est présente (c.-à-la enthalpique, soulevant la phase de la courbe force-extension se produit à une longueur inférieure à la longueur du contour de l'ADN), jeter l'haltère et recommencez à partir de l'étape 6.7.
    11. Une fois un haltère unique d'ADN est obtenue, tournez sur le flux de nouveau et déplacer l'haltère à la chaîne protéique. Mettre à l'échelle de la microscopie de fluorescence pour surveiller le champ de l'interaction LacI-marqué avec l'ADN. Coupez le courant et lancer l'acquisition.

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Representative Results

Dans une expérience réussie, une (ou plusieurs) des protéines marquées subissent liaison / déliaison diffusion et / ou monodimensionnelle long de la molécule d'ADN (figure 3A). La localisation des protéines le long de la molécule d'ADN permet la quantification de paramètres cinétiques en fonction de la séquence d'ADN. Lorsque les conditions de tampon provoquant la diffusion 1D sont appliqués, il est possible de suivre des trajectoires de protéines, et de déterminer, par exemple, le coefficient de diffusion D 1D.

La position précise d'un seul endroit, dans chaque trame, peut être déterminée par ajustement de la fonction de flou (PSF) avec une fonction gaussienne bidimensionnelle ou, à défaut, lors de la manipulation d'un grand ensemble de données, avec un algorithme plus rapide, récemment publié (Radial Symétrie Center, RSC) 26,27. Cette dernière méthode permet de déterminer le point de symétrie radiale maximale de l'image, pour atteindre une précision de localisation qui est généralement comparable à ajustement gaussien. En boe cas, le suivi peuvent être atteints grâce à des routines MATLAB qui peuvent être accessibles librement 27.

La figure 3A montre une kymogram d'une expérience typique dans laquelle une seule molécule LacI diffuse le long des séquences d'ADN non spécifique et une autre molécule LacI est liée spécifiquement à un opérateur situé dans le centre de la molécule d'ADN. Figure 3B montre la position des deux molécules LACI (obtenues à l'aide RSC) le long de la direction reliant les centres des deux pièges (x), en fonction du temps. De la position de la molécule de diffusion le long de la molécule d'ADN, nous avons calculé le déplacement quadratique moyen (MSD) à des intervalles de temps différents en fonction de l'équation suivante:

L'équation 1 (1)

N est le nombre total de positions mesurées et n est l'indice f va de mesure rom 1 à N. Dans le cas de la diffusion brownienne unidimensionnelle pur, le TMS est directement proportionnelle à n At (At est l'intervalle de temps entre deux trames consécutives, 100 msec dans nos expériences), avec une pente égale à deux fois le coefficient de diffusion (MSD (n, N) = 2D 1 nΔt). figure 4 montre la MSD vs nΔt terrain pour la molécule diffusant le long de l'ADN. Le coefficient de diffusion de la protéine peut être facilement obtenu à partir d'un ajustement linéaire de la courbe par rapport à TMS nΔt. Notez que lorsque n augmente, le nombre de points de calcul MSD de l'équation. 1 diminue en conséquence. L'erreur dans l'évaluation de la MSD augmente donc avec n. Pour cette raison, nous avons choisi de limiter notre analyse à n = N / 4. C'est en tout cas une très grande valeur par rapport à la N / 10 utilisée par de nombreux laboratoires.

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Figure 1: Le dispositif expérimental est constitué de: une lampe halogène (H), d'un condenseur (C), l'échantillon (S), translateurs piézo (xy et z), l'objectif (O), une caméra à faible grossissement (CCD 200X) et un haut -magnification caméra (CCD 2,000X) utilisé pour la réaction de stabilisation nm (BS est un cube séparateur de faisceau 50:50). doubles pinces optiques sont insérées et extraites à partir de l'axe optique du microscope à travers des miroirs dichroïques (D2 et D3) et comprendre: laser Nd: YAG (1064 nm), isolateur optique (OI), λ / 2 lames d'onde, polarisation cubes de diviseur de faisceau (PBS), déflecteurs acousto-optique (AOD), 1064 filtres interférentiels nm (F1 et F2), détecteur quadrant photodiodes (PDQ). Les signaux provenant QDPs ont été acquis par un convertisseur (ADC) analogique-numérique et élaborés avec une carte FPGA. Deux synthétiseurs numériques directs sur mesure (DDS) ont conduit les ordonnateurs délégués pour contrôler la position de pièges. Une carte d'entrée-sortie numérique (DIO) le contrôle duouverture de deux électrovannes (V1 et V2) connecté à un compresseur (0,5 atm) et la pression ambiante (0 atm), respectivement. Un logiciel Labview surveillé la pression à l'intérieur du réservoir de pression (C1) à travers un dispositif de mesure de pression (PM) et ouvre automatiquement l'une des deux soupapes d'atteindre le niveau de pression souhaité. Excitation de fluorescence a été fourni par un dupliquée laser Nd: YAG (532 nm) et l'image projetée sur un électron multipliée caméra (EMCCD). M est un miroir mobile, F3 un filtre d'émission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure schéma 2 (A) du système de débit. Le système de commande de pression est constituée par un appareil de mesure de pression (PM) et de deux électrovannes V1 et V2 se connectented à un compresseur à 0,5 atm (PRS) et à la pression ambiante (ATM), respectivement. X1 et X2 représentent des connecteurs 3 voies. L'ouverture des vannes est réglée finement pour atteindre la pression désirée dans le réservoir de pression avec quatre conteneurs C1 tampons. Chaque tube d'entrée comprend un indépendant vanne marche / arrêt à l'entrée de la chambre d'écoulement à plusieurs canaux. La tubulure de sortie est reliée à l'C2 conteneur à déchets placé à la pression ambiante. Les dessins ne sont pas à l'échelle. (B) Représentation schématique de la chambre d'écoulement à plusieurs canaux. Quatre flux laminaires translocation séparément des billes de polystyrène fonctionnalisées, des molécules d'ADN, et un tampon d'image des protéines marquées. Deux bourrelets sont pris avec des pincettes optiques doubles et déplacés vers le canal de l'ADN pour permettre à l'ADN d'ancrage entre eux. Une analyse des forces d'extension de l'ADN est réalisée dans le canal de la mémoire tampon pour vérifier la présence d'une molécule d'ADN unique et, juste après, l'ADN est incubé dans la chaîne protéique. L'encart montre un grossissementfication du produit de construction moléculaire finale, prête pour l'imagerie de molécules uniques dans le canal tampon. Dessins ne sont pas à l'échelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 La localisation des molécules LACI simples qui interagissent avec une molécule d'ADN étirée (A). L'axe vertical de la kymogram représente la coordonnée x, parallèle à la molécule d'ADN, tandis que l'axe horizontal représente le temps (100 msec de temps d'acquisition). (B ) position X de la molécule Lacl en fonction du temps. La position des molécules a été déterminée par RSC. Les images ont été acquises à 100 ms de temps d'exposition et 1,25 x 10 -2 W cm -2 excil'intensité du laser de mise. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Terrain de la MSD en fonction du temps pour une seule molécule Lacl diffusant le long d'une molécule d'ADN étiré. L'MSD est calculée à partir de l'enregistrement de la position représentée à la figure 3B (rouge). Le coefficient de diffusion D 1D, obtenu à partir de la régression linéaire des données représentées sur la figure, est de 0,030 ± 0,002 um 2 s -1.

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Discussion

Dans la dernière décennie, les techniques de manipulation et d'imagerie de molécules simples ont vu de grands progrès en termes de résolution spatiale et temporelle. La combinaison des techniques de manipulation et d'imagerie est à la base de puissants outils qui permettent maintenant le contrôle de l'état mécanique d'un polymère biologique unique, tels que ADN, ARN ou du cytosquelette des filaments, et la localisation simultanée de protéines individuelles en interaction avec le même polymère . Contrôle des conditions mécaniques du polymère piégé est d'un intérêt particulier. En effet, dans les cellules vivantes, les acides nucléiques sont continuellement subissent une contrainte mécanique provoquée par l'interaction des enzymes et des protéines; De même, un réseau complexe de protéines interagissant et moteurs moléculaires modulant la tension sur les filaments du cytosquelette. D'autre part, la possibilité de détecter et de localiser précisément les protéines qui interagissent avec des acides nucléiques, permet la mesure des interactions moléculaires en fonction de leur position le long de la séquence d'ADN ou d'ARN.

La combinaison de la manipulation et les techniques d'imagerie de molécules uniques demande une conception soignée du dispositif expérimental et les constructions biologiques. Pièges optiques doivent fournir un support stable, assurant la stabilité du niveau nm du polymère en suspension. Cette stabilité peut être atteint par l'isolement attention de l'appareil expérimental à partir des nombreuses sources de bruit mécanique et en minimisant le pointage laser et les fluctuations d'amplitude. Précises (sous-nm) mouvements des pièges optiques sont obtenus en utilisant les ordonnateurs délégués conduits par DDS. Ici, nous avons illustré un protocole étape par étape afin d'optimiser et vérifier la stabilité de pinces optiques au niveau nm.

L'ensemble du domaine simple microscopie à épifluorescence couplé à une caméra EMCCD est utilisé pour localiser des chromophores individuels en interaction avec le polymère en suspension. Notre essai expérimental est limité à longue ADN ou ARN (≥6 kbp) pour assurer une mise de séparation spatialeween le faisceau laser de piégeage et la sonde fluorescente. En effet, la superposition de laser dans le proche infrarouge piégeage avec le laser d'excitation visible conduirait à une meilleure photoblanchiment des chromophores due à l'absorption de la lumière dans le proche infrarouge tandis que le chromophore est à l'état excité 16. Ensemble d'haltères est une autre procédure délicate qui est mieux obtenue en utilisant un flux de cellules multicanal, pour laquelle nous avons fourni une description détaillée. Nous avons indiqué comment optimiser le flux de tampon et comment éviter les bulles d'air, ce qui peut compromettre gravement contraire les expériences. Nous avons décrit des protocoles pour le marquage des extrémités d'ADN avec de la biotine, qui est nécessaire pour l'assemblage d'haltère en utilisant des billes revêtues de streptavidine, et des protocoles pour le marquage de protéines. Enfin, nous avons illustré les opérations étape par étape pour effectuer des expériences dans lesquelles la liaison et la diffusion d'une seule molécule de répresseur lactose sur une molécule d'ADN étiré est quantifiée.

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Acknowledgments

Nous remercions Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, et Peter Gross pour l'aide à la microfluidique et Alessia Tempestini de l'aide pour la préparation des échantillons. Cette recherche a été financée par le septième programme-cadre de l'Union européenne (7e PC / 2007-2013) sous convention de subvention n ° 284464 et par le ministère italien de l'éducation, Université et recherche FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro dans Ricerca 2013 RBFR13V4M2, et dans le cadre de la NANOMAX projet phare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

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References

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