Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vier-dimensionale (4D) lichte afdruk is gebruikt om het gedrag van kleine structuren te bestuderen binnen motorische zenuwuiteinden van de dunne transversus abdominis van de kousenband slang. Ruwe data omvat time-lapse sequenties van 3D z-stacks. Elke stapel bevat 4-20 beelden die met epifluorescentie optiek bij focale vliegtuigen gescheiden door 400-1,500 nm. Stappen in de overname van het beeld stacks, zoals aanpassing van de focus, schakelen van excitatiegolflengten, en de werking van de digitale camera, zijn geautomatiseerde zo veel mogelijk op de foto te maximaliseren en minimaliseren van weefselschade door blootstelling aan licht. Na verwerving wordt een reeks afbeeldingsstapels deconvolved ruimtelijke resolutie te verbeteren, omgezet in het gewenste 3D-formaat, en gebruikt om een ​​4D "film" die geschikt is voor verschillende computergestuurde analyse, afhankelijk van de gevraagde experimentele gegevens. Een toepassing is studie van het dynamisch gedrag van twee klassen van endosomes gevonden in zenuwuiteinden-macroendosomes (MES)en zure endosomen (AE) die afmetingen (200-800 nm voor beide) op of nabij de diffractie limiet. Toegang tot de 3D-informatie op elk tijdstip biedt een aantal voordelen ten opzichte van conventionele time-lapse imaging. In het bijzonder kunnen de grootte en de snelheid van beweging van structuren gekwantificeerd tijd zonder verlies van scherpstelling. Voorbeelden van gegevens van 4D beeldvorming blijkt dat ME's benaderen de plasmamembraan en verdwijnen, wat suggereert dat ze in plaats van zijn exocytosed gewoon verticaal verplaatsen uit de buurt van een enkel vlak van focus. Ook geopenbaard is putatieve fusie van MES en AEs door visualisatie van overlap tussen de twee kleurstof bevattende structuren gezien in elk drie orthogonale projecties.

Introduction

Time-lapse beeldvorming van levend weefsel biedt visuele toegang tot dynamische structuur-functie relaties die niet kunnen worden gewaardeerd in vaste of leven voorbereidingen afgebeeld op een enkel punt in de tijd. Vaak echter het nadeel van toegang tot temporele informatie een afname van optische resolutie. Hoge numerieke apertuur olie-immersie doelstellingen zijn onpraktisch in levend weefsel vanwege hun smalle bandbreedte van focus, waardoor het water onderdompeling of droog doelstellingen als de enige alternatieven. Bovendien kan de verhoogde resolutie geboden door confocale optica niet worden gebruikt in bepaalde levende preparaten vanwege fototoxiciteit van de relatief hoge niveaus van verlichting vereist 1,2. Tot slot, terwijl een aantal real-time of time-lapse-optische technieken beschikbaar die bieden verbeterde resolutie, wordt hun toepasbaarheid beperkt tot preparaten structuren van belang kan worden gepositioneerd binnen een paar honderd nanometer van de doelstelling 1. De werkwijze beschrevenmaakt gebruik van relatief goedkope apparatuur, is veelzijdig, maar biedt een betere resolutie vergelijking met de meer algemeen gebruikte time-lapse technieken. Het is bedoeld voor gebruik in elk laboratorium en beeldvormingsapparatuur.

De werkwijze gebruikt conventionele epifluorescentie microscopie, gecombineerd met een gevoelige digitale camera en hardware waarmee snel reeksen afbeeldingen ophalen op iets verschillende beeldvlakken (z-stacks). Elke z-stack wordt digitaal deconvolved de resolutie te verhogen. Een kenmerk van 3D time-lapse (4D) beeldvorming is nauwkeurig volgen van bewegende organellen of andere structuren. Wanneer goed ingesteld, hoeft afgebeeld structuren niet uit te gaan van de focus en beweging in drie richtingen kan worden waargenomen en gekwantificeerd. Dus het is onmogelijk voor een gebrandschilderd structuur te verdwijnen over een of meer time-lapse frames alleen door drijven boven of onder een smalle focal plane. De methode dient ook als een gevoelig instrument voor de beoordeling van de interacties en mogelijke funing van kleine structuren. Conventionele epifluorescentie of confocale beelden van de structuren in de buurt van de diffractie limiet (een paar honderd nm) niet bevestigen fusie ook al samengevoegd beelden tonen overlap van hun respectievelijke labels 3. Fusie wordt voorgesteld, maar blijft het mogelijk dat de objecten horizontaal of verticaal zijn gescheiden door een afstand die onder de diffractie limiet. Drie of vier-dimensionale beeldvorming, daarentegen, maakt het bekijken van de objecten in elke van de drie orthogonale richtingen. Het uiterlijk van de fusie in alle drie weergaven verhoogt het niveau van zekerheid. En, in sommige levende preparaten, gericht of Brownse beweging van vermoedelijk gesmolten voorwerpen bewijst eens te meer wanneer beide labels gaan samen in de tijd. Natuurlijk, toen in de buurt van de diffractie limiet van het niveau van zekerheid in het onderscheiden structuren van de achtergrond, of waaruit blijkt dat zij twee kleurstoffen (fusie) bevatten, is niet absoluut. Eventueel gespecialiseerde technieken zoals fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET)4, zijn meer geschikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vlekken op de voorbereiding met Supravital Kleurstoffen

  1. Voor de kousenbandslang dissectie protocol zie Stewart et al.. 5 en Teng et al.. 6 Reptilian weefsel overblijft fysiologische voor langere tijd, en met minder bacteriële besmetting, bij bewaring bij lage temperaturen (zie hieronder). Zoogdierweefsel wordt gewoonlijk gehandhaafd bij kamertemperatuur of hoger.
  2. Voor lysosomale vitale kleurstof vlekken, los de kleurstof in koude reptielen Ringers-oplossing 1:5000 (0,2 uM). Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Was enkele malen met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.
  3. Voor FM1-43 kleuring met behulp van KCl stimulatie, verdunnen de kleurstof in high-KCl Ringers 1:500 (7 pm). Incubeer bij 4 ° C gedurende 30-60 seconden maximaal. Was snel drie keer met koud Ringers, ~ 1 min / spoelen. Beeld zo snel mogelijk.
  4. Voor FM1-43 kleuring met behulp van hypertone (sucrose) stimulatie, verdunnen de kleurstof in 0,5 M sucrose Ringers als hierboven. Incubeer bij 4 & #176, C gedurende 2-5 minuten. Was zoals in stap 1.3 hierboven met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.
  5. Voor FM1-43 kleuring via elektrische stimulering, zie Teng et al.. 6 kort wordt de bereiding geplaatst op een schotel met fysiologische zoutoplossing en de kleurstof. De zenuw wordt gestimuleerd met een voorgeprogrammeerde trein van 200 psec rechthoekige pulsen (~ 7 V, 30 Hz, 18 psec). Was zoals in stap 1.3 hierboven met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.

2. Configureer de Preparation for Imaging

  1. Richt de bereiding zodat structuren plaats zo dicht mogelijk bij het microscoopobjectief.
  2. Als een omgekeerde microscoop wordt gebruikt, maken gebruik van een kamer waarvan de bodem is voorzien van een dunne ronde dekglas. Normaal gesproken moet de beeldvorming kamer een dunne roestvrij stalen bodem met een diameter van 25 mm # 1 dikte glazen afdekplaat slip in het midden hebben. Als een rechtopstaande microscoop wordt gebruikt, wordt een onderste dekglaasje niet vereist maar is handigom beeldvorming te kunnen met doorvallend licht (bijv. differentieel interferentie contrast, DIC) met het model te oriënteren en te lokaliseren objecten van belang.
  3. Kies een geschikte doelstelling om de hoogst mogelijke resolutie 3D te verkrijgen. Er zijn afwegingen tussen numerieke apertuur (NA), werkafstand, vergroting, en het type lens (droog, water-en olie-immersie). Voor dunne preparaten zoals weefsel culturen, olie doelstellingen zijn het beste. Met behulp van een microscoop rechtop, drijven een dekglas op het waterbad, en gebruik immersie olie tussen de bovenkant van het deksel slip en de doelstelling.
  4. Als deconvolutie software wordt gebruikt, kan de verkoper vooraf bepaalde puntspreidingsfuncties (PSF's) voor bepaalde doelen. Indien dergelijke informatie wordt verstrekt, of als een niet-ondersteunde doel wordt gekozen, bepalen de PSF door beeldvorming fluorescerende microdots of soortgelijke buigingsbegrensd objecten 7,8.

3. Bepaal de gewenste scherptediepte en Aantal ImaGES Gewenste per Time-lapse Frame

  1. Selecteer de totale diepte van het veld, zodat het verplaatsen of interactie structuren van belang niet verdwijnen of uit te gaan van de focus als ze in de z-richting te verplaatsen. De z-veld moet iets groter zijn dan de verticale afmeting van de cel of proces wordt afgebeeld. Voor gewervelde motorklemmen, 15-20 micrometer is typisch.
  2. Bereken de z-as stap nodig voor elke toename van de focus. Resolutie langs de z-as varieert afhankelijk van eigenschappen van het doel; het is ongeveer een vierde van het xy-vlak resolutie. Als een confocale beeldvorming of deconvolutie software wordt gebruikt, is z-as resolutie verbeterd. Verbeter de uiteindelijke resolutie van opzettelijke oversampling in de z-richting 5, maar zie ook stap 3.3 hieronder. Een typische stapgrootte is in het gebied van 400-1,500 nm voor 40-100X doelstellingen. Licht moet worden geblindeerd uit elk beeld z-stap tussen.
  3. Selecteer het aantal beelden per z-stack, namelijk de gewenste scherptediepte verdeeldde stapgrootte. Tijd om een ​​typisch z-stack compleet is 1-10 sec. Snel bewegende objecten (100 nm / sec) kan verschijnen wazig in een 3D-beeld stapel omdat elk beeldvlak komt overeen met een iets ander tijdstip. Ook, elke extra afbeelding bijdraagt ​​aan photobleaching en mogelijke fototoxiciteit (zie Discussie). Als beide situaties betrekking heeft, kies dan een grotere z-stap naar minder beelden per stack te verzamelen. Compenseer later met behulp van beeld interpolatie software (stap 6.3 hieronder).

4. Selecteer de Time-lapse Frame Rate

Kies proefondervindelijk een tarief dat is net voldoende om vlot met de tijd verandert, zoals beweging, interacties of fusie gebeurtenissen 9 lossen. Onder bemonstering kan bewegende voorwerpen (steekproeffouten) produceren, terwijl oversampling onnodig verhoogt blootstelling aan licht. Verzamel ofwel een enkele lange sequentie of meerdere herhaalde sequenties van hetzelfde preparaat, elk met een betrekkelijk kleine totale tijdsinterval (

5. Voltooi alle Live-Imaging voor een preparaat

Reptilian voorbereidingen doorgaans robuuste blijven ~ 1-2 uur, langer indien gekoeld.

6. Analyseren Volgens gewenste toepassing

  1. Bewaar alle ruwe data bestanden. Hoewel digitale opslag is meestal geen probleem, verwerkingstijd significant zelfs bij snelle computers of werkstations. Om deze reden, bijsnijden in een regio van belang [ROI]. Verzekeren dat de hele regio van belang is in de bijgesneden venster tijdens het hele verloop.
  2. Deconvolutie beeld stapels met behulp van de juiste software en de juiste puntspreidingsfunctie. Bevestigen die resolutie wordt verbeterd en dat er geen artefact is gegenereerd door dedeconvolutie algoritme. Figuur 3 toont bijvoorbeeld afbeeldingen.
  3. Gebruik een interpolatie algoritme om z-as schijnbare resolutie uit te breiden. Een 6X uitbreiding van een werkelijke beeld 1,5 urn vliegtuig scheiding een schijnbare 0,25 micrometer scheiding wordt gesuggereerd. U kunt ook een combinatie van oversampling (stap 3.2) en interpolatie.
  4. Voer contrast, helderheid, geluid filteren, photobleaching en andere typische beeldverwerking aanpassingen indien gewenst. Beeldmanipulatie normen dicteren dat voor de meeste wetenschappelijk werk, is het aangewezen dat dezelfde correcties worden toegepast op alle beelden, zowel binnen een stapel en op verschillende tijdstippen. Het gevolg van een bijzondere aanpassing worden beoordeeld onder alle beelden 9.
  5. Selecteer een bepaalde weergavemodus voor de export van gegevens. De meest eenvoudige display stereo video aan met rood-groen of rood-blauw anaglyphen (voorbeelden in figuur 3), stereo paren, of afwisselend links / right oog frames met shutter-bril. Anaglyphen zijn beperkt tot een kleur. Verbeter schijnbare beelddiepte desgewenst tot z-as visuele resolutie te verbeteren.
  6. Experimenteren met diverse filter-en beeldverbetering technieken. Bijvoorbeeld, Laplace filtering nuttig om contrast van kleine structuren boven de achtergrond toenemen. De helderheid van pixels in het midden van een actief venster wordt verbeterd terwijl de helderheid van de omgeving wordt verminderd. Merk op dat sommige filtering methoden niet goed werken in combinatie.
  7. Solliciteer drift correctie als er aanzienlijke beweging van de voorbereiding in de tijd. Een dergelijke beweging is gebruikelijk in levende spier, zelfs met drugs toegevoegd aan actiepotentialen en synaptische potentialen onderdrukken. Een pixel registratie algoritme (bijv.. Imaris, Adobe After Effects, TurboReg plugin voor ImageJ) lijnt time-lapse beelden en kan verminderen, maar meestal niet volledig uit te sluiten, zoals beweging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De getoonde gegevens zijn van slang neuromusculaire terminals (zie lage en hoge uitzicht vergroting in figuur 3, de endocytische kleurstof (FM1-43) opname creëert een waas die elk bouton vult) en, in het bijzonder, macroendosomes (MES) en zure endosomes (AE) binnen deze terminals 5. ME's zijn gemaakt door bulk endocytose tijdens neurale activiteit 10 en hun aantal daalt exponentieel met de tijd na de activiteiten heeft gestaakt 6. Gebruik van 4D live-imaging was om te bepalen of MEs bewegen naar het plasmamembraan en snel verdwijnen, wat suggereert dat hun aantal afneemt omdat sommige van hen exocytose. Al deze ME's waren aanwezig op een bepaald tijdstip (en degenen die vóór) en helemaal weg bij het volgende tijdstip (en die na). Dus de tijd benodigd voor verdwijning minder is dan het rasterinterval (zo kort als 30 seconden) en in overeenstemming met exocytose. Een alternatieve theorie, niet ondersteund door 4D gegevens, is dat ME's langzaam verdwijnen via ontluiken van vesicles totdat ze verdwijnen. Blaasje ontluikende optreedt 6, maar ten minste een aantal ME's worden exocytosed tijdens of na ontluikende 5. Figuur 1 en Film S1 illustreren de verdwijning van een ME tussen twee time-lapse frames. MEs voorbestemd te verdwijnen niet van vorm of helderheid te wijzigen over twee of meer frames (N = 16), die consistent zijn met trage afvoer zou zijn geweest tijdens de periode van de film (beginnend meerdere minuten na korte stimulatie). ME verdwijning werd eerder waargenomen bij conventionele time-lapse, maar het was mogelijk dat de structuren simpelweg had verlaten het vlak van focus. Bovendien bekijken vanuit verschillende perspectieven (Movie S1) heeft bevestigd dat de ME verdwijning was plotseling. Bij conventionele live-imaging (kijken vanuit een perspectief, bijvoorbeeld het xy beeldvlak) ruisartefacten beperken het vermogen van de onderzoeker om te bevestigen dat een structuur was onveranderd. Dergelijke voorwerpen zijn vaak aanwezigin een uitzicht, maar anderen niet.

Elektronenmicroscopie studies toonden aan dat endosomes in motorpolen zijn klein in omvang, in de buurt van de diffractie limiet van licht 10. Vandaar fusie van deze endosomes kan absoluut niet worden onderscheiden van nauwe ruimtelijke vereniging op lichtniveau. ME's werden gemerkt met FM1-43 (groen-fluorescerende), en AES met een lysosomale vitale kleurstof (rood-fluorescerende). Structuren die fluoresceren in beide kleuren (te zien zijn geel) werden af ​​en toe opgemerkt in 4D beeldrecords. Met behulp van geschikte software, zijn weergaven van deze dubbel-gemerkte dus blijkbaar gefuseerd endosomen van verschillende perspectief gegenereerd teneinde het samenvallen van de twee labels in voxels nabij en binnen de schijnbare structuur onderzoeken. Figuur 2 toont een mogelijke gefuseerd AE-ME gezien vanaf drie orthogonale richtingen. Een visie is het xy-vlak; andere weergaven staan ​​loodrecht op dit vlak en elkaar. Met deze methode werd vastgesteld dat voxelshetzij overlappen, zoals in dit voorbeeld, of dat ze duidelijk niet in een of meer vlakken bekijken. Film S2 toont hetzelfde vermeende gefuseerde AE-ME gepresenteerd als interactieve virtual reality display (draaibaar in 3 dimensies).

Digitale deconvolutie is een nuttig instrument om de resolutie van zowel 3D als 4D beelden te verbeteren, zowel conventionele en confocale microscopen 11. Deconvolutie is een numerieke, iteratief proces compenseert, enigszins, voor beperkte ruimtelijke resolutie van het gebruikte objectief. Deze resolutie wordt gekarakteriseerd als de doelstelling van puntspreidingsfunctie-het 3D-volume ingenomen door het beeld van een oneindig klein punt. In theorie, deconvolutie herstelt het beeld dat zou resulteren indien het doel waren perfect. Figuur 3 is een 3D-volume van twee verschillende gegevenssets, elk weergegeven als een paar rood-groen anaglyphen. De juiste beelden tonen typische verbetering in scherpte na de digitaleconvolutie van het beeld stapel.

Figuur 1
Figuur 1. Een macroendosome (ME) verdwijnt na een duidelijk contact met plasmamembraan. Een slang nerve-muscle preparaat werd elektrisch gestimuleerd in aanwezigheid van FM1-43. De gegevens werden verzameld met behulp van 4D beeldvorming als beschreven in Methoden en worden weergegeven als "3D Volume uitzicht" op zes tijdstippen (60 sec interval) om de Z-diepte van een enkele bouton illustreren. Een ME kan worden waargenomen af ​​te stappen van de Y-as (rode stippellijn) over meerdere frames voordat ze verdwijnen tussen tijd de punten 5 en 6. Vlak voor verdwijning lijkt de ME te worden gevestigd op plasmamembraan de Bouton's (aangegeven door de FM1-43 blaasje vlekken of "waas," zie figuur 3 legend). De ME niet opnieuw inlatere tijdstippen (gegevens niet getoond, zie Movie S1). Schaal bar, 2 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

FILM S1:. 4D time-lapse uitzicht op ME verdwijning Klik hier om film te bekijken. Dezelfde reeks ruw gegevens weergegeven in figuur 1 wordt weergegeven als een "4D volume view" op een lagere vergroting. De originele time-lapse sequentie 8 tijdstippen, gescheiden door 60 sec; weergavekwaliteit 4 frames / sec. De volgorde wordt kort gepauzeerd bij het begin van elk van de 24 3D-rotatie stappen om de y-as (15 graden / stap) om de aandacht te vestigen op de snel-to-be verdwijnen ME (rode pijl). Merk op dat de ME zichtbaar is, nadert de rand van de Bouton (plasmamembraan), verdwijnt, en niet terugkeert, inal het bekijken van perspectieven. Vanwege lagere z-as resolutie opzichte xy resolutie, wordt de vorm van de ME te verlengen en verkorten afhankelijk bekijkt perspectief. Beelden werden geëxporteerd als een QuickTime-film, en geannoteerd met behulp van QuickTime Pro. Schaal bar, 2 micrometer.

Figuur 2
Figuur 2. Orthogonaal uitzicht op een vermeende gesmolten endosome. Een zenuw spier voorbereiding werd achtereenvolgens gekleurd met een lysosomale vitale kleurstof (rood) naar AE en FM1-43 (groen) label naar Mes labelen met behulp van 0,5 M sucrose stimulatie zoals beschreven in Methods. Gegevens van een tijdstip van een 4D-film worden weergegeven als 3D-volume uitzichten in drie oriëntaties. Boven (panelen 1-3) is de gebruikelijke weergave van boven (XY-vlak). Op midden (panelen 4-6) is het oog loodrecht op het xy-vlak enin de (arbitraire) richting van de grote rode pijl. Onder (panelen 7-9) een aanzicht onderling loodrecht op hetgeen hierboven, in de richting van de grote blauwe pijl. Een ME (groen) wordt gekenmerkt door een groene pijl; twee AE's (rood) worden gemarkeerd door rode pijlen. Een endosoom die zowel kleurstoffen (geel) wordt gemarkeerd door een gele pijl in panelen 3, 6 en 9. Merk op dat overlap van rood en groen is even compleet in alle drie orthogonale projecties. Schaal bar, 2 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

FILM S2:. Interactieve rotatie van afbeelding met MES en zure endosomes AE's . Klik hier om film te bekijken De dataset van figuur 2 wordt getoond geconfigureerd een volledig draaibare 3D-beeld (QuickTime Virtual Reali alsty-formaat; gebruik de muis om het beeld te draaien voor het bekijken vanuit elke richting). De vermeende gesmolten ME / AE geel blijft vanuit alle perspectieven.

Figuur 3
Figuur 3. Deconvolutie verbetert 3D ruimtelijke resolutie. Twee typische slang zenuwuiteinden, getoond bij lage (boven) en hoog (onderkant) vergroting respectievelijk gekleurd tijdens stimulatie met FM1-43. FM1-43 achtergrond "haze," als gevolg van kenmerken van de individuele 50 nm blaasjes, toont de vorm van de terminal boutons waarbinnen ME's zijn beperkt. De gegevens worden weergegeven als rood-groen anaglyphen van 3D-weergaven volume (diepte kan worden gevisualiseerd met rood-groen of rood-blauwe bril, rood op linkeroog; noot axon linksboven afdaalt in het vlak van de terminal van boven). Links panelen: de ruwe gegevens; Rechts panelen: gegevens nadeconvolutie. Let op de aanzienlijke verbetering van de resolutie van de ME's. Top panelen: Elektrische stimulatie; gehele terminal getoond (~ 30 x 50 urn) (dezelfde ruwe gegevens als in figuur 1 en film S1, schaalbalk, 10 um). Bodempanelen: KCl stimulatie; vergroot tot vier individuele boutons (~ 3 x 5 micrometer; schaal bar, 2 micrometer) te laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische aspect van 4D beeldvorming is beheer van de duur en intensiteit van blootstelling aan licht. Fotobleken vermindert het signaal-ruisverhouding en kan problematisch of niet, afhankelijk van verschillende factoren, waaronder keuze van fluoroforen zijn. Niet-specifieke schade aan levend weefsel (fototoxiciteit) is gerelateerd aan fotobleken, en kan soms worden geïdentificeerd met fluorescerende probes daartoe ingerichte 2,12 of door onderzoek van de morfologie helderveld met geschikte optica, zoals differentieel interferentie contrast (DIC).

Het is echter mogelijk om een ​​fysiologisch effect dat optreedt op licht ruim onder de omvang van de deelnemers aan fotobleken en fototoxiciteit veroorzaken. Bijvoorbeeld, begin experimenten met verschillende preparaten, elk bevestigd op een ander tijdstip na stimulatie, werd de snelheid waarmee ME's verdwenen na een korte stimulatie gemeten 6. Zoals gebruikelijk to minimaliseren vervagen zijn de voorbereidingen in het donker bewaard totdat ze werden bekeken. Bij soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met 4D levende beeldvorming, veel meer ME's bleef gedurende het experiment (~ 20-60 min) en niet verdwijnen. Gebruik van dezelfde levende beeldvormingstechniek, behalve eigenlijk opnemen en daardoor licht op een enkele 3D lijst aan het begin en een frame eind beperken, herstelde de verwachte totale verdwijning van endosoom die van vaste preparaten.

Verdere problemen aangegeven dat de mate van verdwijning gedeeltelijk omgekeerd en monotoon gerelateerd aan totale belichting tijdens een experiment. Na mislukte pogingen om de blootstelling via conventionele en multi confocale optica, werd het probleem uiteindelijk opgelost door de aankoop van een ~ 3x gevoeliger camera (tabel 1). Aanbevolen wordt dat soortgelijke vergelijkingen worden gemaakt als mogelijk, afhankelijk van de toepassing van de gebruiker. Als sommige process of overgang wordt gedocumenteerd in de tijd, bevestigen dat er geen wijziging te wijten aan de intensiteit of de totale duur van de verlichting. Fototoxiciteit en fotobleking zijn dye-specifiek. Zo zagen we geen significante vervagen na herhaalde 4D beeldvorming van een terminal (350 individuele licht vorderingen gedurende 30 min) met behulp van FM1-43. Dezelfde beeldprotocol met eenzelfde kleurstof, SGC5 (tabel 1), resulteerde echter in sommige fading en vermoedelijk fototoxiciteit en (gegevens niet getoond).

Met uitzondering van de verbeteringen die door digitale deconvolutie (en confocale optica indien gebruikt, niet weergegeven), de eenvoudige werkwijze beschreven geeft geen "super" resolutie. De methode heeft het voordeel van het verbeteren van praktische of intuïtief resolutie bij weergave levende structuren, met name voor bewegende, waarvan de grootte of iets groter dan de diffractie limiet. De mogelijkheid om objecten te bekijken vanuit verschillende perspectieven, including presentatie in elk van drie orthogonale vlakken, leidt de onderzoeker de vraag of een structuur echt bestaat boven het ruisniveau en of het gelabeld door een of meer fluoroforen. Bijvoorbeeld, in experimenten ontworpen om het aantal en de grootte van MES en AE kwantificeren, was het mogelijk te bevestigen dat de structuur zichtbaar was vanuit verschillende invalshoeken en elke dimensie (en dus de driedimensionale volume) was binnen het bereik dat typisch structuur. De locatie van een structuur is ook beter gedefinieerd, bijvoorbeeld in een axon, zenuwuiteinde enz. plaats van erboven of eronder. Wanneer daarentegen het gezichtsveld is beperkt hetzij een enkel 2D beeldvlak of een projectie van 3D data, vermeende structuren vaak bleek "ruis". Evenzo vermeende dubbel-gemerkte structuren vaak bleken twee structuren die ve kijkperspectief (of twee), maar niet van alle samenvallen verschenen zijn. Visualisatie van de drie orthogonale richtingties biedt een standaard en routine criterium voor de beoordeling van het bestaan, de omvang en de etikettering kenmerken van endosomes of soortgelijke structuren voor gebruik in kwantitatieve en statistische analyses.

De beschreven methode is praktisch dat een conventionele video microscoop van het type gevonden in vele laboratoria worden gebruikt. De instrumentatie is veelzijdig dan gespecialiseerde en relatief goedkoop. Terwijl de software specifiek voor een bepaalde microscoop hier werd gebruikt, kunnen de open-source software voor zowel beeld acquisitie en dataverwerking vergelijkbare resultaten 13 te produceren. Technieken (inclusief deconvolutie) zijn van toepassing op enkele-en multi confocale beeldvorming met dezelfde voordelen, zolang belichting wordt getolereerd door de levende preparaat. In de toekomst zullen verbeteringen in het ontwerp verder verbeteren van de bruikbaarheid 4D live-imaging. Deze omvatten, voornamelijk, hardware dat de snelheid van scherpstellen en excitatie / emissie filter cha verbetertnging, en de beschikbaarheid van nog gevoeliger videocamera's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health Grant NS-024572 (RSW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics