Collecte et d'extraction de l'ADN de la salive pour le séquençage de prochaine génération

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Goode, M. R., Cheong, S. Y., Li, N., Ray, W. C., Bartlett, C. W. Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (90), e51697, doi:10.3791/51697 (2014).

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Abstract

Introduction

L'obtention de l'ADN de haute qualité pour des études génétiques humaines est essentielle dans le processus de découverte de gènes de maladies. Le sang, bien que nécessitant une intervention invasive et étant également plus cher que le prélèvement de salive, est favorisée par la création de lignées de cellules immortalisées comme une source inépuisable de l'ADN, ou iPSCs pour des études fonctionnelles, et parfois de l'ADN sanguin est utilisé lorsque des lignées cellulaires ne sont pas disponibles. Toutefois, l'obtention de sang exige un préleveur qualifié et le sang a une demi-vie plus courte que la salive 1. ADN de la salive est moins cher et plus facile à obtenir, car il peut être collecté et envoyé par la poste, sans la nécessité d'un préleveur, augmentant ainsi gisements potentiels de sujets bien au-delà de la zone de chalandise des hôpitaux et des laboratoires 2. inscription de l'étude peut être améliorée lorsque les sujets ont la possibilité de donner un échantillon de salive au lieu de sang 3, 4. préoccupations au sujet de la quantité et de la qualité de l'ADN de la salive peuvent avoir limité sa nous généraliséee en dépit de nombreuses études récentes études ont montré la pertinence de la salive totale, avec une moyenne de 4,3 x 10 5 cellules par millilitre, pour des tests ADN sur les prélèvements dans la bouche des méthodes plus anciennes qui n'ont pas obtenu d'importantes quantités de salive 2, 3, 4, 5, 6. Bien que la littérature existe modeste montrant la pertinence d'ADN dérivé de la salive totale pour les applications de génotypage y compris les méthodes à base de microréseaux 8, 9, le séquençage de prochaine génération 10, aucune étude n'a examiné (NGS). L'objectif pour l'optimisation de l'ensemble de ce protocole d'extraction d'ADN de la salive était de maximiser la quantité et de la qualité pour les applications de la génétique d'une manière rentable qui est facilement mis en œuvre dans les laboratoires avec des réactifs et consommables communs.

l'extraction d'ADN à partir de la salive nécessite plusieurs interventions: 1) la collecte et le stockage, 2) la lyse des cellules, 3) un traitement à la RNase, 4) la précipitation des protéines, 5) précipitation par l'éthanol, 6) l'ADN de la réhydratation. La solution de stabilisation tampon ADN, décrit2 précédemment, sans modification des fonctions de manière adéquate. Aucune tentative pour optimiser le traitement de la RNase et les étapes de réhydratation de l'ADN a été effectué. Pour chaque étape restante, plusieurs variables qui pourraient affecter les rendements ont été identifiés. Chaque variable a été manipulée individuellement et l'amélioration du rendement et de la qualité a été évaluée statistiquement. Pour les variables qui ont été montrées pour améliorer le rendement et / ou la qualité de l'ADN, les valeurs optimales ont été inclus dans le protocole final.

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Protocol

REMARQUE: Avant de fournir des échantillons de salive tous les sujets ont donné leur autorisation conforme aux lignes directrices pour le traitement de sujets humains à l'Hôpital pour enfants de Nationwide informé.

1 prélèvement de salive et de stockage

  1. Avant la collecte de salive, veiller à ce que la bouche du sujet est libre de nourriture ou d'autres substances étrangères en ayant l'objet rincer la bouche avec de l'eau et d'éviter de manger ou de boire pendant 30 min avant de prélever l'échantillon.
  2. Ouvrez un tube de centrifugeuse de 15 ml avec 2,5 ml d'ADN stabilisation tampon 2 en veillant à ne pas toucher l'intérieur de la capsule ou le tube, et ont fait l'objet cracher 2,5 ml de salive dans la solution tampon. Remarque: La collecte de plus de 2,5 ml de salive peut conduire à une dégradation de l'échantillon à partir d'un rapport insuffisante de l'échantillon de tampon de stabilisation de l'ADN. Collecte trop peu de salive va réduire les rendements attendus du protocole. Pour évaluer les volumes de collecte, utilisez les gradients numérotés sur le côté du til tube.
  3. Remettre le bouchon et mélanger par inversion jusqu'à ce que le mélange est homogénéisé. Une agitation vigoureuse n'est pas nécessaire. Conserver les échantillons à température ambiante pour le stockage à court terme ou à 4 ° C pour le stockage à long terme (> 3 mois).

2. Préparations initiales et de lyse cellulaire

  1. Avant de commencer l'extraction, faire chauffer un bain d'eau à 37 ° C, et de préparer un seau à glace. Trois 15 ml tubes de centrifugation coniques seront nécessaires pour chaque échantillon extrait. Les trois tubes sont utilisés pour maintenir les cellules et les protéines culot, le dernier extrait d'ADNg, et les surnageants d'isopropanol et d'éthanol.
  2. Récupérer des échantillons de stockage, et des échantillons inverses plusieurs fois alors vortex à vitesse moyenne pendant 15 sec.
  3. Distribuer 2,5 ml d'échantillon dans un tube de 15 ml à centrifuger propre, et ajouter 5 ml de solution de lyse cellulaire. Mélanger l'échantillon 50 fois par inversion, et incuber à température ambiante pendant 30 min.

3. ARN enlèvement

  1. Ajouter 40 ul de RNase A Solution à 100 mg / ml, et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
  2. Retirer l'échantillon du bain-marie à 37 ° et refroidir sur glace pendant 3 min.
    1. Après l'incubation de la RNase A, d'augmenter la température du bain d'eau à 65 ° C pour l'étape de réhydratation de l'ADN du protocole.

4. protéines et lipides enlèvement

  1. Ajouter 50 l de protéinase K Solution à 20 mg / ml, mélanger à plusieurs reprises par inversion, et incuber à température ambiante pendant un minimum de 30 minutes. Note: Ceci est un point de pause possible pour le protocole. Après l'addition de la solution de protéinase K, l'échantillon peut être stocké à 4 ° C jusqu'à ce que l'extraction peut être réalisée. Stockage à 4 ° C pendant 24 heures n'a pas été montré pour avoir un effet significatif sur les rendements d'extraction ou de la qualité de l'ADN. Stockage à long terme, à ce stade n'a pas été évaluée.
  2. Ajouter 1,7 ml de solution de précipitation des protéines, vortex vigoureusement pendant 20 secondes à grande vitesse, et le placer sur la glace pendant 10 min. Une fois les échantillons sont refroidis sur la glace pendant 10 min, centrifuger pendant 10 min à 3000 xg et 4 ° C. Les protéines précipitées doivent former un culot serré pour continuer. Si la pastille n'est pas étanche ou la solution est encore trouble, les échantillons peuvent être refroidis sur la glace pendant 5 min et centrifugation plus répétées. Les échantillons doivent être conservés dans la glace pour assurer une pastille serré.

5 Isolement et purification de l'ADNg

  1. 15 ml dans un tube à centrifuger propre, la pipette 5 ml d'isopropanol et 8 pi de solution de glycogène pur à 20 mg / ml.
  2. Verser le surnageant contenant l'ADNg de l'étape 4.3 dans le tube contenant la solution de glycogène et de l'isopropanol, en laissant le culot de protéine précipitée. Une fois le surnageant a été ajouté, mélanger délicatement l'échantillon 50 fois par inversion et centrifuger pendant 30 min à 3000 xg et 4 ° C.
  3. Verser le surnageant dans un tube lentement de 15 ml propre. Après élimination du surnageant, ajouter 1 ml d'éthanol à 70%laver le culot en basculant lentement et se déplaçant doucement de l'éthanol sur le culot précipité plusieurs fois. Conserver la éthanol dans le tube.
  4. Après le lavage initial, centrifuger l'échantillon pendant 1 min à 2000 xg et 20 ° C. Cette étape de centrifugation peut être effectuée à 4 ° C ou 20 ° C. Aucun effet significatif de la température a été montré pour cette étape.
  5. Après le lavage et la centrifugation initiale de la pastille, verser lentement le lavage à l'éthanol à partir du tube et le jeter, puis effectuer un deuxième lavage en répétant les étapes 5.3 et 5.4.
  6. Après l'élimination du surnageant à partir de la deuxième lavage, le culot de permettre à l'air sec pendant 15 minutes.
    1. Si l'échantillon n'est pas complètement séché, séché à l'air pendant 15 min.

6. réhydratation des ADNg

  1. Une fois que l'échantillon est sec, ajouter 300 pi de Tris-EDTA pour réhydrater le culot séché ADNg.
  2. Vortex de l'échantillon pendant 5 secondes à la vitesse moyenne et le placer dans un65 ° C bain d'eau chaude pendant 1 heure.
  3. Retirer les échantillons du bain d'eau et incuber O / N à la température ambiante.
    REMARQUE: Tous les produits et les réactifs utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux, ainsi que le tableau 4.

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Representative Results

Pour déterminer les paramètres optimaux pour l'extraction de l'ADN d'une série d'extractions d'ADN appariés a été effectuée. Un échantillon de salive, seule a été divisé et chaque partie a testé avec l'une des deux valeurs possibles d'une variable donnée. Au moins huit répétitions de chaque test apparié ont été réalisées (par exemple, un seul échantillon de salive a été aliquote de tester l'extraction à la fois avec et sans participation initiale de 50 ° C incubation). Optimisation a été basée sur quatre indicateurs standard: rendement d'ADN total, la valeur 260/280, 260/230 de la valeur, et une inspection visuelle de l'ADN électrophorèse pour évaluer la fragmentation. Toutes les combinaisons possibles des variables ont été évaluées interactions statistiques (N = 169 combinaisons), optant plutôt pour évaluer l'effet marginal de chaque variable individuellement. Les effets ont été testés en utilisant un multi-voies à mesures répétées ANOVA et effets estimés ont été calculés à partir de l'équation de régression équivalente. Tous les effets sont résumées dans le tableau 1, présentée comme averchangement de l'âge du rendement (ng / ul par ml de l'entrée de la salive) ou la qualité de l'ADN (260/280 260/230 et).

La lyse des cellules (étape 2) a été optimisé en évaluant: 1) la présence / absence de 50 ° C incubation (1 heure) avant la lyse cellulaire de sorte que la dégradation de la protéinase K et la lyse cellulaire médiée par le tampon de stockage sont allés à l'achèvement, 2 ) la présence / absence d'une homogénéisation au vortex étape (vitesse moyenne, 15 sec), et 3) une solution de lyse temps d'incubation (5 min par rapport à 30). Le 30 min d'incubation la lyse cellulaire a augmenté le rendement en moyenne de 3,5% (p <0,01), mais aucune autre variable de la lyse des cellules a eu un effet significatif sur le rendement. Vortex a diminué le rapport 260/280 par une augmentation statistiquement significative (p <0,001) mais pratiquement petit 0,03.

Précipitation de la protéine (étape 4) est précédée d'une digestion à la protéinase K pour interrompre la chaîne d'acides aminés, d'améliorer l'efficacité de précipitation des protéines et de libérer l'ADN capturé. Le montant de la protéinase K était varié dix fois.température de centrifugation a été réduite de 20 ° C à 4 ° C. L'augmentation de la quantité de protéinase K a provoqué une diminution statistiquement significative du rendement (8,7%) et également légèrement améliorées à la fois les rapports 260/280 et 260/230.

précipitation à l'éthanol (étape 5) a été la dernière étape du protocole examiné. La quantité de support de glycogène (0, 8 pi) a fait varier, de même que le temps total de centrifugation (5 min à 30 vs 11). Seul le temps de centrifugation significativement affecté le rendement, avec une augmentation moyenne de 290%. Le spin plus a également diminué le ratio légèrement (0,05) 260/280. Aucun effet significatif sur le rendement du glycogène a été observée au cours des expériences; si la quantité totale d'ADN dans ces extractions est suffisamment grand pour que le glycogène serait généralement pas être utilisée. Malgré l'absence d'effet dans ces échantillons, il est recommandé d'utiliser toujours le glycogène pour minimiser le risque de baisse des rendements à chaque fois que le volume d'entrée de salive est inférieur donné ici ou si there est une autre raison de croire rendement sera faible.

L'inspection visuelle des échantillons d'ADN représentatifs (Figure 1) a révélé que l'ADN extrait a été grandement non fragmenté pour une procédure d'extraction de l'ADN de la salive, mais a montré une bande de poids moléculaire élevé approprié de poids sans l'étalement indicatif de l'ADN dégradé. Après RNase A la digestion, le protocole a produit en moyenne 260/280 de 1,74.

Figure 1
La figure 1 de la qualité de l'ADN dérivé de la salive. Quatre procédés d'extraction ont été appliqués à la même collection de salive. (A) Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8% (250 ng d'ADN). Toutes les variantes des protocoles d'extraction d'ADN de la salive conduisent à haut poids moléculaire (> 20 kb) d'ADN, sans aucun signe de dégradation. Lane: 1 ADN Laddér, 2 et 3 échantillons Oragene précuvettes Protocole L2P, 4 et 5 Gentra Puregene Protocole fluides du corps, 6 et 7 du protocole optimisé sans étape d'élimination de l'ARN, 8 et 9 du protocole optimisé à l'étape ARN supprimer. Les lignes 2-7 sont directement protocoles analogues sur les mêmes échantillons de salive. Les lignes 8 et 9 montrent que l'étape d'élimination de l'ARN n'introduit pas de dégradation de l'ADN. (B) Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% (de 150 ng d'ADN). Un léger pic d'ARN est observable dans la partie inférieure du gel dans les pistes 2 à 7 (les conventions ci-dessus). Les lignes 8 et 9 montrent l'efficacité de l'étape d'élimination de l'ARN.

L'étape de l'ARN de démontage (étape 3 avec la RNase A) est essentiel pour une quantification précise de l'ADN. Au cours des essais, la teneur élevée constante d'ARN a été observé, tel que déterminé par le rapport de l'ADN double brin de l'ARN mesuré par un qubit 2,0 Fluoromètre. Sur, la teneur en acide nucléique à partir de la moyenne des échantillons sans un traitement la RNase A est composée de 46,6% (± 0,4) RNA. Les échantillons qui ont subi l'étape de suppression de l'ARN se lire comme "<20 ng / ml", qui est le plus bas possible pour la lecture de la détection de l'ARN du qubit.

L'ADN obtenu par ce protocole optimisé était d'une qualité suffisante pour le séquençage à haut débit lors de la RNase A l'étape supplémentaire a été appliquée. Pour obtenir des données de reséquençage, une coutume kit Agilent SureSelect Target Enrichment a été appliquée à 24 échantillons, ciblant 2,6 Mb de séquence. Séquençage à haut débit a été menée sur 12 à code-barres (indexés) échantillons par voie. Séquence lit ont été BWA-alignés au génome de référence hg19 12, alors l'application de la note recalibrage de qualité GATK 13 de base, indel réalignement, élimination des doublons, la découverte SNP et le génotypage simultanément dans tous les 24 échantillons a été réalisée en utilisant le paramètre meilleures pratiques disque de filtrage des valeurs 14. Les 24 échantillons ont donné la qualité des données NGS (tableau 2). De lectures qui passaient Illumina de filtres standard et eu Q> 20, 91,4% aligné sur les régions cibles d'enrichissement de séquence, fournissant une moyenne sur la cible profondeur de> 30x couverture de couverture à Q> 100, et dans les limites nécessaires pour la découverte SNP rare dans chaque échantillon. Le solde de brin moyenne était de 49,9%. Comparaison des variantes appels avec Illumina génotypes de puces à ADN ont donné une concordance de 98,9%.

Variable candidat ng / pl 260/280 260/230
Vortex ns -0.03 *** ns
x30 cellulaire min incubation de lyse 3,5% ** ns ns
Protéinase K x10 -8,7% * -0.05 *** -0.03 ***
30 min de spin 290,2%*** -0.05 *** ns
Glycogène ns ns -0,37 ***

Tableau 1 Taille de l'effet de la variable optimisée sur Quantité Metrics / qualité. Toutes les tailles d'effet sont dans les unités figurant dans l'en-tête de colonne. p-valeurs de variance: * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; ns non significatif

Qualité métrique Valeur
Longueur cible 1708 kb
Cible couvert> 30x 85.22%
SNP dans dbSNP 92.55%
accord Array 98.99%

Tableau 2 Qualité de High Throughput séquence de cible d'enrichissement.

Nouveau protocole optimisé Article Distributeur Catalogue # Unité d'achat Coût / unité Coût / Collection
15 ml Tubes à centrifuger Pêcheur 12-565-268 500 Tubes $ 233,50 $ 3,2690
Solution de lyse cellulaire Qiagen 158908 1 L $ 401,00 $ 3,2080
Protéinase K Sigma P6556 1 g $ 713,00 $ 1,5686
Solution de précipitation des protéines Qiagen 158912 350 ml $ 350,00 $ 2,7200
Isopropanol Pêcheur A416-4 Caisse de 4 x 4 L $ 486,71 $ 0,2434
Solution glycogène (20 mg / ml) EZ-BioRecherches S1003 1 ml $ 51,00 $ 0,8160
70% Ethanol Pêcheur 04-355-305 Caisse de 4 x 1 gallon. $ 123,03 $ 0,0325
Tris-EDTA (TE) Pêcheur BP2473-1 1 L $ 68,67 $ 0,0412
NaCl Pêcheur AC194090010 1 kg $ 34,65 0.000004 $
Tris HCl Pêcheur BP1757-100 100 ml $ 57,84 $ 0,0116
EDTA (0,5 M) de solution Pêcheur 03-500-506 100 ml $ 33,60 $ 0,0134
Sodium Dodecyl Sulfate Pêcheur BP166-100 100 g $ 59,95 $ 0,0060
Coût total $ 11,93
Oragene Article Distributeur Catalogue # Unité d'achat Coût / unité Coût / Collection
15 ml Tubes à centrifuger Pêcheur 12-565-268 500 Tubes $ 233,50 $ 0,9340
100% Ethanol Pêcheur BP2818-100 100 ml $ 34,29 $ 1,6459
70% Ethanol Pêcheur 04-355-305 Caisse de 4 x 1 gallon. $ 123,03 $ 0,0081
Tris-EDTA (TE) Pêcheur BP2473-1 1 L $ 68,67 $ 0,0687
Tube de 1,5 ml Genesee 22-281A 500 Tubes $ 22,85 $ 0,0457
Oragene Collection KIT Oragene OG-500 1 $ 25,00 $ 25,00
Coût total $ 27,70
Puregene Article Distributeur Catalogue # Unité d'achat Coût / unité Coût / Collection
15 ml Tubes à centrifuger Pêcheur 12-565-268 500 Tubes $ 233,50 $ 0,9340
Solution de lyse cellulaire Qiagen 158908 1 L $ 401,00 $ 4,0100
Protéinase K Qiagen 158918 650 ml $ 73,10 $ 7,8723
Solution de précipitation des protéines Qiagen 158912 350 ml $ 350,00 $ 4,0000
Isopropanol Pêcheur A4164 Caisse de 4 x 4 L $ 486,71 $ 0,3650
Glycogène Solution Qiagen 158930 500 ml $ 64,30 $ 2,5720
70% Ethanol Pêcheur 04-355-305 Caisse de 4 x 1 gallon. $ 123,03 $ 0,0975
Solution ADN hydratation Qiagen 158914 100 ml $ 69,80 $ 0,1396
NaCl Pêcheur AC19409-0010 1 kg $ 34,65 0.000004 $
Tris HCl Pêcheur BP1757-100 100 ml $ 57,84 $ 0,0116
EDTA (0,5 M) de solution Pêcheur 03-500-506 100 ml $ 33,60 $ 0,0134
Dodécyl sulfate de sodium Pêcheur BP166-100 100 g $ 59,95 $ 0,0060
Coût total $ 19,99

Tableau 3 Comparaison des coûts du protocole optimisé pour extraire l'ADN à partir de 2 ml de salive totale avec d'autres protocoles disponibles dans le commerce. Aréactifs ll et consommables nécessaires pour l'extraction de l'ADN ont été évalués en utilisant les prix de liste standard disponibles sur Internet à compter du 30 Septembre 2013, à noter que ce protocole est écrit à extraire l'ADN de 1,25 ml de salive totale (c'est-à-2,5 ml de salive et de tampon , voir étape 2.3) que cette valeur représente la moitié du volume total dans le tube de prélèvement de la salive. Pour la comparaison des coûts, 2 ml a été choisi car c'est le montant associé à un kit disponible dans le commerce commun (Oragene).

Stabilisation tampon ADN (250 ml)
Composant Volume (ml) [Final]
1 M de NaCl 1.461 g 0,1 M
Tris HCl 2.5 0,01 M
EDTA 0,5 M 5 0,01 M
SDS à 10% 12,5 </ Td> 0,014 M
Solution protéinase K (20 mg / ml) 2.5 6.92x10 -6 M
ddH 2 O 227,5
Solution protéinase K (20 mg / ml)
Composant Volume (ml) [Final]
Protéinase K poudre 500 mg 6.92x10 -4 M
ddH 2 O 25
70% d'éthanol (500 ml)
Composant Volume (ml) [Final]
Ethanol 95% 368,5 12,63 M
ddH 2 O 131,5

Tableau 4: Recettes pour réactifs.

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Discussion

La présente procédure est un protocole d'extraction de l'ADN optimisé qui a considérablement amélioré le rendement de l'ADN de poids moléculaire élevé par rapport à des procédés classiques, sans compromettre la qualité de l'ADN. L'étape critique avec le plus grand effet sur ​​le rendement le plus, c'est l'étape 5.2, qui comprend une étape de centrifugation plus longue au cours de précipitation à l'éthanol que n'importe quel protocole publié examiné ici, sauf une qui n'a pas été largement distribuée 11. Aucun changement dans la qualité de l'ADN associé à cette centrifugation plus ont été détectés, ce qui indique que la majeure partie de l'ADN disponible à partir de prélèvement de salive entière n'est pas dégradée et de haut poids moléculaire.

Prélèvement de salive entier a des limites dans la qualité de l'échantillon tel que le potentiel de contaminants étrangers, qui doit être minimisée au stade de la collecte, et la présence de la protéine excessive dans l'échantillon qui peut être un signe d'une infection sous-jacente. De grandes quantités de protéines ou étrangers contaminants peuventrester dans l'ADN extrait finale ce qui rend la quantification inexacte. S'il existe des protéines ou des contaminants résiduels après réhydratation (étape 6) est suspectée, d'un nettoyage d'échantillon peut être réalisée en commençant par l'étape de précipitation des protéines avec des volumes de réactifs mises à l'échelle en fonction du volume d'entrée de l'échantillon. Une autre limitation de ce protocole est la longueur de temps nécessaire pour effectuer les étapes. Plusieurs échantillons peuvent être exécutées en parallèle; Cependant, il est recommandé de ne pas plus de 24 extractions parallèles être exécutés simultanément. Ceci est particulièrement important pour l'étape de précipitation des protéines, où l'échantillon doit rester froid pour assurer une pastille et serré en cours d'exécution de plus de 24 échantillons peut permettre pastilles temps de re-dissoudre.

Le protocole présenté ici est la méthode la plus rentable en considération (voir le tableau 3). Bien que ce protocole fait usage des réactifs du kit d'extraction Puregene, un volume plus petit que recommandé dans le protocole de Puregene est utilisésans compromettre le rendement d'extraction et c'est cette réduction de réactifs qui pousse les économies de coûts relatifs au protocole. Notez que le coût calculé pour l'extraction utilise la liste de prix pour chaque article et ne tient pas compte des réductions. Le coût par extraction avec le protocole optimisé permet de réduire davantage les commandes en vrac ou remises par les représentants des ventes de l'entreprise.

La preuve a également été apportée que ce protocole est adapté pour une utilisation avec le séquençage de prochaine génération. Les données obtenues fournissent une preuve supplémentaire de l'utilité des échantillons de salive pour la recherche en génétique humaine dans de nombreuses maladies où le sang n'est pas disponible en routine. Alors que l'ADN dérivé du sang et la lignée cellulaire continue d'être la source préférée de matériel génétique pour les tests, la collecte de salive tout est une alternative viable lorsque ces sources ne sont pas disponibles, quand le recrutement des patients est affectée par leur collecte ou la saignée n'est pas disponible ou impossible.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Centrifuge Tubes Fisher 12-565-268
Cell Lysis Solution Qiagen 158908
Proteinase K Sigma P6556
Protein Precipitation Solution Qiagen 158912
Isopropanol Fisher A416-4
Glycogen EZ-BioResearch S1003
70% Ethanol Fisher 04-355-305
Tris-EDTA (TE) Fisher BP2473-1
NaCl Fisher AC194090010
Tris HCl Fisher BP1757-100
EDTA (0.5 M) Solution Fisher 03-500-506
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 
Analog Vortex Mixer Fisher 02-215-365
Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 000.010

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References

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