Jsubtomo का उपयोग इलेक्ट्रॉन Cryotomography पुनर्निर्माण से वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन spikes के औसत

Immunology and Infection
 

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Huiskonen, J. T., Parsy, M. L., Li, S., Bitto, D., Renner, M., Bowden, T. A. Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo. J. Vis. Exp. (92), e51714, doi:10.3791/51714 (2014).

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Abstract

छा वायरस मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश के लिए मध्यस्थता करने के लिए उनकी सतह पर झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन उपयोग. इन ग्लाइकोप्रोटीन 'spikes' के तीन आयामी संरचनात्मक विश्लेषण अक्सर वायरल रोगजनन को समझने के लिए और दवा डिजाइन में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण लेकिन महत्वपूर्ण है. इधर, एक प्रोटोकॉल इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी डेटा के कम्प्यूटेशनल औसत के माध्यम से वायरल कील संरचना निर्धारण के लिए प्रस्तुत किया है. इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी एक ऐसी पास देशी, स्थिर हाइड्रेटेड राज्य में झिल्ली वायरस pleomorphic जैविक नमूनों के तीन आयामी tomographic मात्रा पुनर्निर्माण, या tomograms, प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में एक तकनीक है. ये tomograms कम प्रस्ताव पर हालांकि, तीन आयामों में ब्याज की संरचनाओं प्रकट करते हैं. उप संस्करणों, या उप tomograms के कम्प्यूटेशनल औसतन इस तरह के वायरल ग्लाइकोप्रोटीन spikes के रूप में संरचनात्मक रूपांकनों, दोहराने के उच्च संकल्प विस्तार से प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. अली के लिए एक विस्तृत कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणgning और Jsubtomo सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर उप tomograms औसत उल्लिखित है. यह दृष्टिकोण विरिअन झिल्ली पर उच्च आदेश कील करने वाली कील बातचीत के अध्ययन की एक 20-40 ए की रेंज में संकल्प और अध्ययन करने के लिए वायरल ग्लाइकोप्रोटीन spikes संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. ठेठ परिणामों Bunyamwera वायरस, परिवार Bunyaviridae से एक छा वायरस के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. इस परिवार मानव और पशुओं के स्वास्थ्य के लिए एक खतरा रोगजनकों के एक संरचनात्मक विविध समूह है.

Introduction

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी जटिल जैविक नमूनों की एक तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण की गणना की अनुमति एक इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तकनीक है. उपयुक्त नमूनों पूरे प्रोकार्योटिक कोशिकाओं 5 और पूरे कोशिकाओं 6 से भी पतली क्षेत्रों में शुद्ध macromolecular परिसर 1, तंतु 2, लेपित पुटिकाओं 3, और pleomorphic झिल्ली वायरस 4 से लेकर. एक झुकाव सीरीज, 3 डी tomographic संस्करणों, या tomograms के आंकड़े एकत्र करने के बाद, Bsoft 7 और IMOD 8 सहित कई स्थापित सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर की गणना की जा सकती है.

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी सीमा इसी tomographic संस्करणों के जैविक व्याख्या द्वारा जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए निहित दो पहलुओं. कारण महत्वपूर्ण विकिरण क्षति शुरू करने से पहले जैविक सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है कि सीमित इलेक्ट्रॉन खुराक, हस्ताक्षर करने के लिए, सबसे पहलेtomographic डेटा में एल से शोर अनुपात आम तौर पर बहुत कम हैं. दूसरा, डेटा संग्रह के दौरान सीमित नमूना झुकाव ज्यामिति का एक परिणाम के रूप में, वस्तु के कुछ दृश्य tomographic मात्रा में एक तथाकथित 'लापता कील' विरूपण साक्ष्य के लिए अग्रणी अनुपस्थित रहते हैं. Tomographic मात्रा सफलतापूर्वक हो 9-12 औसतन सकते हैं कि इस तरह के macromolecular परिसर के रूप में समान संरचनाएं, दोहरा शामिल हालांकि, अगर इन सीमाओं के दोनों दूर किया जा सकता है.

रण पुनर्निर्माण से संरचनाओं के औसत से पहले, ब्याज की वस्तुओं पाया और उसी उन्मुखीकरण के लिए गठबंधन किया जाना चाहिए. ऐसी संरचनाओं का पता लगाने अक्सर टेम्पलेट के रूप में 13 मिलान करने के लिए भेजा एक दृष्टिकोण का उपयोग tomographic मात्रा में एक टेम्पलेट संरचना के पार सहसंबंध द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस मिलान की प्रक्रिया में इस्तेमाल टेम्पलेट इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोपी या 3 डी पुनर्निर्माण के साथ संयुक्त इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी से प्राप्त किया जा सकता है, या इसे से नकली एक घनत्व मानचित्र हो सकता हैएक परमाणु संरचना. कई कम्प्यूटेशनल संकुल इन कार्यों को 11 से बाहर ले जाने के लिए विकसित किया गया है.

ऐसे एचआईवी -1 के रूप में झिल्ली वायरस, के ग्लाइकोप्रोटीन spikes के औसतन उनकी संरचना 14-16 के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से सफल दृष्टिकोण से किया गया है. संरचना की समझ वायरस मेजबान बातचीत के दोनों आणविक आधार खुलासा और एंटीवायरल और वैक्सीन डिजाइन विकास मार्गदर्शन के लिए अभिन्न अंग है. Macromolecular क्रिस्टलोग्राफी व्यक्ति वायरल ग्लाइकोप्रोटीन और उनके परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण (4 से आम तौर पर बेहतर) उच्च संकल्प के लिए पसंद की तकनीक है, इस विधि से उत्पन्न एक्स रे संरचनाओं विरिअन पर प्राकृतिक झिल्लीदार वातावरण से अलग प्रोटीन की हैं . इस प्रकार, इस तरह के विरिअन के संदर्भ में वायरल ग्लाइकोप्रोटीन के उच्च आदेश वास्तुकला, के रूप में महत्वपूर्ण जानकारी, अभाव रहेगा. दूसरी ओर, इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोपी और एकल कण पुनर्निर्माणपूरे छा वायरस की icosahedral समरूपता 17,18 के साथ virions तक ही सीमित है. उप मात्रा संरेखण के साथ संयुक्त इलेक्ट्रॉन cryotomography इस प्रकार बगल में अनियमित आकार, pleomorphic वायरस के ग्लाइकोप्रोटीन spikes के अध्ययन की अनुमति एक पूरक तकनीक के रूप में उभरा है.

हम Jsubtomo tomographic उप संस्करणों का पता लगाने, संरेखण, और औसत के लिए (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) नामक सॉफ्टवेयर विकसित किया है. Jsubtomo सेलुलर और वायरल संरचनाओं 19-26 की संख्या की संरचना निर्धारण में उपयोग किया गया है. यहाँ, हम दृढ़ संकल्प वायरल सतह कील संरचनाओं में सक्षम बनाता है जो एक विस्तृत प्रोटोकॉल, रूपरेखा. शोर correlating द्वारा अधिक-शोधन औसतन संरचनाओं की नाकाम करने के लिए, 'सोने के मानक' शोधन योजना 10,27 अपनाया है. अंत में, दृश्य और ठेठ परिणामों की व्याख्या के लिए रणनीति पर चर्चा कर रहे हैं.

Protocol

कम्प्यूटेशनल संरेखण और वायरल ग्लाइकोप्रोटीन spikes के बाद औसत के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उल्लिखित है. प्रोटोकॉल चित्रा 1 में सचित्र कार्यप्रवाह के बाद और प्रारंभिक टेम्पलेट संरचनाओं और एक सोने का मानक संरचना शोधन का उपयोग spikes के लिए एक स्वचालित खोज को जोड़ती है.

इस प्रोटोकॉल के लिए इनपुट डेटा virions की tomographic पुनर्निर्माण का एक सेट है. एक रण एक या अधिक virions शामिल हैं. प्रारंभ में, spikes के एक छोटे सबसेट मैन्युअल उठाया औसत और दो स्वतंत्र मॉडल को परिष्कृत करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन मॉडलों को स्वतः virions के सभी पर spikes पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है. अंत में, दो स्वतंत्र शोधन चलाए जा रहे हैं और जिसके परिणामस्वरूप मूविंग तुलना और अंतिम संरचना का निर्माण करने के लिए संयुक्त रहे हैं.

शोधन दृष्टिकोण Jsubtomo पैकेज से कार्यक्रमों का उपयोग करके प्रदर्शन किया है. Bsoft पैकेज 28 से कार्यक्रम सामान्य छवि पी के लिए उपयोग किया जाता हैrocessing कार्यों और आणविक ग्राफिक्स पैकेज UCSF कल्पना 29 परिणाम कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इटैलिक और फ़ाइल स्वरूपों में दिए गए हैं व्यक्तिगत कार्यक्रमों के नाम अपरकेस फ़ाइल नाम एक्सटेंशन के साथ चिह्नित हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1:.. Pleomorphic झिल्ली वायरस से कील परिसरों ग्लाइकोप्रोटीन के ढांचे का निर्धारण करने के लिए सामान्य रणनीति संख्या प्रोटोकॉल में विभिन्न वर्गों के अनुरूप इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

1 पूर्ण आकार Tomograms से वायरस उप खंडों निकालने

  1. Tomograms में मैन्युअल वायरस कणों उठाओ.
    1. Bshow में एक रण फ़ाइल खोलें. केंद्र एक वायरस खास की समन्वय परिभाषितLe कण उठा उपकरण का उपयोग कर. सभी virions संसाधित किया गया है जब तक इस चरण को दोहराएँ. सहेजें वायरस एक स्टार फ़ाइल में निर्देशांक.
    2. सभी tomograms संसाधित किया गया है जब तक दोहराएँ कदम 1.1.1. पिक्सल में विरिअन व्यास के नोट करें.
      नोट: spikes ("80,10000 -bandpass" पैरामीटर) 80-A संकल्प tomograms फिल्टर, tomograms में देखना कम पास करने bfilter उपयोग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं.
  2. व्यक्तिगत मात्रा फ़ाइलों को विरिअन उप संस्करणों को निकालने के लिए निकालने मोड में (पैरामीटर "--mode निकालने") jsubtomo.py चलाएँ. इनपुट फाइल के रूप में कदम 1.1.1 में बचाया स्टार फ़ाइलों का प्रयोग करें.
    1. डेटा सेट में सबसे बड़ा विरिअन से 25% बड़ा एक आकार (पैरामीटर "--size") ~ दीजिए. जैसे, विरिअन व्यास में ~ 200 पिक्सल, उपयोग आकार 250 x 250 x 250 पिक्सल है.
    2. विरिअन संस्करणों के आउटपुट फ़ाइलें एमएपी प्रारूप में होगा. इसके अलावा, (parame प्रत्येक विरिअन मात्रा के लिए एक साथ स्टार फ़ाइल बनानेआतंकवाद "--output").
  3. (पैरामीटर "-rescale 0,1") bimg में विरिअन मात्रा में मानक के अनुसार.

दो स्वतंत्र प्रारंभिक मॉडल के 2 जनरेशन

  1. विरिअन उप खंडों में spikes के एक सबसेट उठाओ.
    1. Bshow में एक विरिअन उप मात्रा नक्शा फ़ाइल खोलें. केंद्र टूलबॉक्स खिड़की के माध्यम से सुलभ कण उठा उपकरण का उपयोग कर एक कील का समन्वय परिभाषित करें. सभी स्पष्ट रूप से अलग spikes संसाधित किया गया है जब तक इस चरण को दोहराएँ. सहेजें कील एक स्टार फ़ाइल में निर्देशांक.
    2. यदि आवश्यक हो, लगभग 200 ग्लाइकोप्रोटीन spikes संसाधित किया गया है जब तक अन्य virions के लिए कदम 2.1.1 दोहराएँ. पिक्सल में कील आयाम ध्यान दें.
      नोट: ~ 200 spikes के किसी न किसी दिशानिर्देश हैं और अधिक कुछ अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि संभव हो तो, अलग झुकाव के स्पाइक्स लेने के लिए करना है. केवल शीर्ष दृश्य उठा बचें.
  2. Jviews.p चलाकर spikes के लिए एक प्रारंभिक दृश्य वेक्टर निरुपितवाई. इनपुट फाइल के रूप में कदम 2.1.1 में उत्पन्न स्टार फ़ाइलों का प्रयोग करें.
    नोट: यह देखने वेक्टर विरिअन के संदर्भ में कील की दिशा का अनुमान लगाती है.
    1. केंद्रीय एक गोलाकार विरिअन के लिए दृश्य आवंटित करने के लिए समन्वय का प्रयोग करें. विरिअन 250 x 250 x 250 पिक्सल के एक आकार के साथ एक बॉक्स में (1.2 चरण के बाद) केंद्रित है अगर उदाहरण के लिए, समन्वय केंद्रीय 125125125 पिक्सल (विकल्प "--Radial 125125125") है.
    2. एक filamentous विरिअन के लिए दृश्य आवंटित इनपुट फ़ाइल के रूप में कदम 2.1.1 में परिभाषित स्टार फ़ाइल का उपयोग कर bshow में प्रत्येक विरिअन उप मात्रा खोलने के लिए. रेशा उठा उपकरण का उपयोग रेशा के दो छोर अंक परिभाषित और स्टार फ़ाइल सहेजें. सभी स्टार फ़ाइलें अद्यतन किया गया है जब तक इस चरण को दोहराएँ और इनपुट फाइल (--option खंड) के रूप में अद्यतन स्टार फ़ाइलों का उपयोग jviews.py चलाते हैं.
  3. Jsubtomo_create_mask.py का उपयोग कर एक वास्तविक अंतरिक्ष मुखौटा उत्पन्न करता है. असली अंतरिक्ष मुखौटा वही dimens की है कि सुनिश्चित करेंऔसतन संरचना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में आयनों (2.6.2 देखें) और कील और अंतर्निहित झिल्ली का एक पैच दोनों को शामिल करने के लिए काफी बड़ी है.
  4. Jsubtomo_create_wedgemask.py का उपयोग कर एक पारस्परिक अंतरिक्ष मुखौटा उत्पन्न करता है. पारस्परिक अंतरिक्ष मुखौटा एक धुरी tomographic डेटा संग्रह से उत्पन्न 'लापता कील' क्षेत्र में क्षेत्रों के बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (2.6.2 देखें) औसतन संरचना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में यह एक ही आयामों की है कि सुनिश्चित करें.
  5. Jsubtomo_evenodd.py और कदम 2.2 में उत्पन्न स्टार फ़ाइलों का उपयोग "1" और "2" सेट से संबंधित virions परिभाषित एक चयन फ़ाइल (एसईएल फाइल) उत्पन्न करता है.
  6. Jsubtomo_create_averages.py का उपयोग दो प्रारंभिक मूविंग उत्पन्न करता है.
    1. इनपुट फ़ाइल के रूप में 2.5 कदम में उत्पन्न एसईएल फ़ाइल का उपयोग करें.
    2. एक आकार (पैरामीटर "--size") कील का सबसे बड़ा आयाम से बड़ा कम से कम 32 पिक्सल. जैसे कील है, अगर ~ 40 पिक्सल लंबा दीजिए, उपयोग आकार 72 x 72 x 72 पिक्सल.
    3. कील की लंबी अक्ष के चारों ओर एक बेलनाकार औसत लगभग एक उच्च मूविंग पर समरूपता (जैसे, C100) (पैरामीटर "--symmetry C100") लागू करें. प्रारंभिक मूविंग में शोर को कम करने के लिए symmetrization का प्रयोग करें.
    4. परियोजना (पैरामीटर "--suffix") का उत्पादन फ़ाइलों के लिए एक अनूठा नाम प्रदान करें.
    5. पृष्ठभूमि (पैरामीटर "--mask") दूर नकाब को 2.3 कदम में उत्पन्न वास्तविक अंतरिक्ष मुखौटा का प्रयोग करें. एक लापता पच्चर (पैरामीटर "--Mask") की मौजूदगी से पेश संकेत के नुकसान के लिए खाते में 2.4 चरण में उत्पन्न पारस्परिक अंतरिक्ष मुखौटा का प्रयोग करें.

3 गोल्ड मानक चलने का संरेखण और दो प्रारंभिक स्पाइक मॉडल के औसत का

Iteratively संरेखित और jsubtomo_iterate_gold.py साथ धारा 2 में उत्पन्न दो प्रारंभिक मॉडल औसत.

  1. स्टेज मैं इस स्तर के लक्ष्य को परिष्कृत करने के लिए हैदेखें वेक्टर की दिशा. इनपुट फ़ाइल 2.5 कदम में उत्पन्न एसईएल फ़ाइल है.
    1. (पैरामीटर "8,8,8 --angles") एक 8 डिग्री कोणीय नमूने का प्रयोग करें.
    2. (पैरामीटर "16 --thetaphilimit") कील देखने वेक्टर की दिशा में 16 डिग्री परिवर्तन की अनुमति दें लेकिन कील लंबे अक्ष तय (पैरामीटर "--alphalimit 0") के आसपास कोण रखने के लिए.
    3. छोटे translational बदलाव (जैसे, 5 पिक्सल) का मार्गदर्शन spikes के चुनने में अशुद्धियों के लिए खाते में करने की अनुमति दें (पैरामीटर "--shiftlimit 5").
    4. कील की लंबी अक्ष के चारों ओर एक बेलनाकार औसत लगभग एक उच्च मूविंग पर समरूपता (जैसे, C100) (पैरामीटर "--symmetry C100") लागू करें.
      नोट: Symmetrization मूविंग में शोर को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    5. लापता पच्चर (पैरामीटर "--m के लिए आसपास के spikes और खाते दूर नकाब को वास्तविक अंतरिक्ष मुखौटा और चरणों 2.3 और 2.4 में उत्पन्न पारस्परिक अंतरिक्ष मुखौटा का प्रयोग करेंक्रमशः "और" --Mask ") पूछना.
    6. 2.6 में उत्पन्न दो एमएपी फ़ाइलों का उपयोग करें ("भी" टैग से चिह्नित और फ़ाइल नाम में "अजीब") (क्रमशः पैरामीटर "--Template1" और "--Template2") टेम्पलेट्स के रूप में.
    7. संरेखण पूर्वाग्रह को रोकने के लिए 50 एक संकल्प (पैरामीटर "--resolution") पर एक कम पास फिल्टर लागू करें.
    8. शोधन ("2 --bin" पैरामीटर) में तेजी लाने के लिए 2 से एक बिन कारक लागू करें.
    9. ("1 --lastiter 5 --firstiter" पैरामीटर) संरेखण और औसत के 5 पुनरावृत्तियों चलाएँ.
  2. स्टेज द्वितीय. इस चरण के लक्ष्य को देखने वेक्टर चारों ओर कोण परिष्कृत करने के लिए है. इनपुट फ़ाइल कदम 3.1.9 से उत्पादन एसईएल फ़ाइल है.
    1. कदम 3.1.9 में अंतिम यात्रा में उत्पन्न कम पास फ़िल्टर किए नक्शा फ़ाइल खोलने से कील की सटीक आयामों के उपाय bshow में (फ़ाइल नाम में टैग "_lp" से चिह्नित). एक नए रियल उत्पन्नअंतरिक्ष मुखौटा इसी प्रकार कील को परिभाषित करता है लेकिन झिल्ली और पड़ोसी spikes के सबसे शामिल नहीं है कि 2.3 कदम करने के लिए.
      नोट: मुखौटा के इष्टतम आकार आकार और कील की सुविधाओं पर निर्भर करता है.
    2. पहले के रूप में (पैरामीटर "8,8,8 --angles") 8 डिग्री कोणीय नमूने का प्रयोग करें.
    3. स्पाइक देखने वेक्टर ("- alphalimit 180" पैरामीटर) के चारों ओर कोण में 180 डिग्री परिवर्तन की अनुमति लेकिन थीटा रखने और फी कोण तय (पैरामीटर "0 --thetaphilimit").
    4. किसी भी translational बदलाव की अनुमति न दें (पैरामीटर "0 --shiftlimit").
    5. मूविंग (पैरामीटर "--symmetry" न आना) पर किसी भी समरूपता लागू न करें.
    6. लापता पच्चर के लिए खाते में 2.4 चरण में उत्पन्न पारस्परिक अंतरिक्ष मुखौटा का प्रयोग करें.
    7. समरूपता के बिना कदम 3.1.9 की अंतिम यात्रा में उत्पन्न दो एमएपी फ़ाइलों का उपयोग टेम्पलेट्स (मापदंडों आर के रूप में (टैग फ़ाइल नाम में "even_nosym" और "odd_nosym" से चिह्नित)20; - Template1 "और" क्रमशः --Template2 ").
    8. संरेखण पूर्वाग्रह को रोकने के लिए पहली यात्रा में 50 एक संकल्प (पैरामीटर "--resolution") पर एक कम पास फिल्टर लागू करें. दो स्वतंत्र मूविंग के बीच स्वचालित रूप से सोने का मानक फूरियर शैल सहसंबंध (एफएससी) पर आधारित (पैरामीटर "--adaptivefilter") बाद पुनरावृत्तियों में फिल्टर मापदंडों को समायोजित करें. 0.143-कसौटी का प्रयोग करें (पैरामीटर "0.143 --fsccrit"). CTF सुधार tomograms के लिए लागू किया गया है, जब तक इसके विपरीत हस्तांतरण समारोह (CTF) (पैरामीटर "--minhires") के पहले शून्य पिछले शोधन की अनुमति न दें.
    9. (उदाहरण के लिए, पैरामीटर "6 --lastiter 15 --firstiter") संरेखण के 5-10 पुनरावृत्तियों भागो और औसतन. सूचना दी संकल्प में परिवर्तन की निगरानी. कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया जाता है, इस प्रक्रिया को रोका जा सकता है.
  3. Examini द्वारा संरचना में समरूपता की डिग्री का आकलनस्पाइक एक trimeric जटिल है, तो कल्पना. उदाहरण में (फ़ाइल नाम में टैग "_lp" से चिह्नित) जिसके परिणामस्वरूप कम पास फ़िल्टर किए नक्शा फ़ाइल एनजी, 3 गुना समरूपता स्पष्ट होना चाहिए.
  4. स्टेज III. इस चरण के लक्ष्य को सही समरूपता के साथ आगे देखें वेक्टर चारों ओर कोण परिष्कृत करने के लिए है. इनपुट फ़ाइल कदम 3.2.9 से उत्पादन एसईएल फ़ाइल है. मापदंडों कुछ अपवादों के साथ 3.2 कदम के रूप में वही कर रहे हैं:
    1. स्पाइक देखने वेक्टर चारों ओर कोण में उचित परिवर्तन की अनुमति दें. उदाहरण के लिए, संरचना 3 गुना समरूपता है, (पैरामीटर "60 --alphalimit") अल्फा कोण में 60 डिग्री के परिवर्तन की अनुमति है.
    2. मूविंग (पैरामीटर --symmetry C3 ") पर सही समरूपता (जैसे, सी 3) को लागू करें.
    3. इनपुट टेम्पलेट फ़ाइलें (पैरामीटर "--Template1" और के रूप में कदम 3.2.9 (फ़ाइल नाम में "भी" टैग से चिह्नित और "अजीब") में अंतिम यात्रा में उत्पन्न दो एमएपी फ़ाइलों का प्रयोग करें --Template2).
    4. (उदाहरण के लिए, पैरामीटर "16 --lastiter 25 --firstiter") संरेखण के 5-10 पुनरावृत्तियों भागो और औसतन. सूचना दी संकल्प में परिवर्तन की निगरानी. कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया जाता है, इस प्रक्रिया को रोका जा सकता है.
  5. स्टेज चतुर्थ. इस चरण के लक्ष्य को सटीकता से एक साथ सभी तीन कोणों को परिष्कृत करने के लिए है. इनपुट फ़ाइल कदम 3.4.4 से उत्पादन एसईएल फ़ाइल है. मापदंडों कुछ अपवादों के साथ 3.4 कदम के रूप में वही कर रहे हैं:
    1. स्पाइक देखने वेक्टर ("- alphalimit 8" पैरामीटर) के चारों ओर कोण में 8 डिग्री परिवर्तन की अनुमति दें और कील देखने वेक्टर की दिशा में 8 डिग्री परिवर्तन (पैरामीटर "8 --thetaphilimit"). 4 डिग्री सटीकता के झुकाव को परिष्कृत (पैरामीटर "8,8,8 --iterate 2 --angles").
    2. (पैरामीटर "5 --shiftlimit") छोटे बदलाव (जैसे, 5 पिक्सल) पिछले संरेखण चरणों में अशुद्धियों के लिए खाते में करने की अनुमति दें.
    3. यूकदम 3.4.4 में अंतिम यात्रा में उत्पन्न दो एमएपी फ़ाइलें ("भी" टैग से चिह्नित और फ़ाइल नाम में "अजीब") इनपुट टेम्पलेट फ़ाइलें (पैरामीटर "--Template1" और --Template2) के रूप में se.
    4. (उदाहरण के लिए, पैरामीटर "26 --lastiter 35 --firstiter") संरेखण के 5-10 पुनरावृत्तियों भागो और औसतन. सूचना दी संकल्प में परिवर्तन की निगरानी. कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया जाता है, इस प्रक्रिया को रोका जा सकता है.

टेम्पलेट मिलान के लिए वायरस भूतल के लिए बीज की 4 जनरेशन और संरेखण

  1. टेम्पलेट मिलान के लिए विरिअन सतह पर समान रूप से स्थित बीज पैदा करते हैं और jviews.py चलाकर बीज के लिए एक प्रारंभिक दृश्य वेक्टर आवंटित. इनपुट फाइल के रूप में कदम 1.2.2 में उत्पन्न स्टार फ़ाइलों का प्रयोग करें. Spikes की उम्मीद की संख्या की तुलना में लगभग 1.5 गुना अधिक बीज उत्पन्न करता है.
    नोट: यह देखने वेक्टर प्रत्येक बीज बिंदु के सबसे करीब कील की दिशा का अनुमान लगाती है.
    1. एक मोटे तौर पर गोलाकार विरिअन (पैरामीटर "--Even") पर समान रूप से वितरित बीज उत्पन्न करने के लिए, ("--radius" पैरामीटर) कोणीय जुदाई बीज की (जैसे, 20 डिग्री) (पैरामीटर त्रिज्या दे "20 --angle" ) और केंद्रीय विरिअन का समन्वय. जैसे, विरिअन 250 x 250 x 250 पिक्सल के एक आकार के साथ एक बॉक्स में कदम 1.2) के बाद (केंद्रित है, तो केंद्रीय समन्वय) "125125125 --origin" 125125125 पिक्सल (विकल्प है .
    2. एक filamentous कण पर समान रूप से वितरित बीज उत्पन्न करने के लिए, "--Filament" पैरामीटर का उपयोग करें और त्रिज्या और पेचदार समरूपता मानकों (वृद्धि और मोड़) दोनों निर्दिष्ट.
      नोट: पेचदार समरूपता मापदंडों ही समान रूप से वितरित बीज पदों को परिभाषित करने का एक सुविधाजनक तरीके के रूप में यहां इस्तेमाल कर रहे हैं और वे रेशा पर spikes के वास्तविक आदेश को प्रतिबिंबित करने की जरूरत नहीं है.
  2. Explaine के रूप में वायरस की सतह के दो स्वतंत्र मूविंग उत्पन्नधारा 2 में डी.
    1. Jsubtomo_evenodd.py और कदम 4.1 में उत्पन्न स्टार फ़ाइलों का उपयोग "1" और "2" सेट से संबंधित virions परिभाषित एक एसईएल फाइल उत्पन्न करता है.
      नोट: डेटासेट की स्वतंत्रता, समूहों में virions की किसी भी पिछले असाइनमेंट सुनिश्चित करने के लिए "1" और "2" ही रहना चाहिए.
  3. बीज की स्थिति को परिष्कृत करें.
    1. जब तक अन्यथा कहा कदम 3.1 में निर्देशों का पालन करें. इनपुट फ़ाइल के रूप में कदम 4.2.1 में उत्पन्न एसईएल फ़ाइल का उपयोग करें.
    2. बीज झिल्ली (पैरामीटर "--zshiftlimit") को सामान्य साथ ही शिफ्ट करने की अनुमति दें. Virions आदर्श गोलाकार ज्यामिति से विचलित कितना आधार पर बदलाव की अनुमति दी गई राशि को समायोजित (जैसे, पैरामीटर "25 --zshiftlimit).
    3. कदम 4.2 में उत्पन्न दो एमएपी फ़ाइलों का उपयोग --Tem "इनपुट टेम्पलेट फ़ाइलें (पैरामीटर्स के रूप में (" भी "टैग और फ़ाइल नाम में" अजीब "से चिह्नित)plate1 "और --Template2).
    4. (उदाहरण के लिए, पैरामीटर "--suffix _seeds") मूल इनपुट स्टार फ़ाइलें overwriting से बचने के लिए एक अनूठा प्रत्यय का प्रयोग करें.
    5. गणना ("4 --bin" पैरामीटर) और एक कम पास फिल्टर तेजी लाने के लिए 4 से binning का प्रयोग करें (जैसे, पैरामीटर "--resolution 50").
  4. (पैरामीटर "--cmm") jviews.py का उपयोग परिष्कृत बीज स्टार फ़ाइलों की कल्पना मार्कर फ़ाइलें (सीएमएम) उत्पन्न करता है. . कल्पना में सीएमएम फ़ाइलें (और जुड़े विरिअन एमएपी फ़ाइलें) खोलने के द्वारा बीज की जांच परिष्कृत बीज वायरस झिल्ली को सही ढंग से रिश्तेदार गठबंधन कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
    नोट: अलग अलग रंग मार्करों के अलग सेट (पैरामीटर "--color") को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से परिष्कृत मार्करों उनके पार सहसंबंध गुणांक (उदाहरण के लिए, पैरामीटर "--fomcolor 0.1,0.3") के आधार पर रंग का हो सकता है.

5 सोने का रुखएआरडी चलने का संरेखण और स्पाइक संरचना के औसत का

स्वचालित रूप से परिष्कृत बीज के आसपास स्थानीय टेम्पलेट मिलान का उपयोग विरिअन उप खंडों में सभी spikes लगाने और संरेखित और स्थित spikes औसत. प्रारंभिक टेम्पलेट्स के रूप में मैन्युअल उठाया spikes के एक सबसेट से उत्पन्न मूविंग का प्रयोग करें.

  1. कार्यक्रम jsubtomo_iterate_gold.py का उपयोग सभी spikes औसत करने के लिए बीज के आसपास स्थानीय टेम्पलेट मिलान कार्य करें. जब तक अन्यथा कहा कदम 3.5 में निर्देशों का पालन करें.
    1. इनपुट फ़ाइल 4.3 चरण में उत्पन्न परिष्कृत बीज के लिए एसईएल फ़ाइल है.
    2. देखें वेक्टर कोण के लिए एक पर्याप्त बड़ी सीमा का उपयोग करें. बीज हर 20 डिग्री (कदम 4.1) उत्पन्न थे जैसे, अगर, एक इस मूल्य के आधे से थोड़ा बड़ा कोण (पैरामीटर "12 --thetaphilimit") का उपयोग करें. स्पाइक देखने वेक्टर चारों ओर कोण में उचित परिवर्तन की अनुमति दें.
    3. (पैरामीटर बीज झिल्ली के विमान में शिफ्ट करने की अनुमति दें"--xyshiftlimit"). बीज के लिए बीज दूरी 25 पिक्सल है जैसे, अगर, कुल जैसे इस का आधा (तुलना में थोड़ा अधिक बदलाव, मापदंडों का उपयोग "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      नोट: 3.5 चरण में उत्पन्न एमएपी फाइलें बीज से विरिअन केंद्र से एक अलग दूरी पर केंद्रित कर रहे हैं अगर अतिरिक्त translational बदलाव आवश्यक हो सकता है.
    4. 3.5 चरण में उत्पन्न दो एमएपी फ़ाइलों का उपयोग करें ("भी" टैग से चिह्नित और फ़ाइल नाम में "अजीब") इनपुट टेम्पलेट फ़ाइलें (पैरामीटर "--Template1" और --Template2) के रूप में.
    5. कदम 3.5 (पैरामीटर --resolution) में उत्पन्न एमएपी फ़ाइलों की वर्तमान संकल्प का प्रयोग करें.
    6. ("1 --lastiter 10 --firstiter" उदाहरण के लिए, पैरामीटर) टेम्पलेट मिलान, संरेखण और औसतन 5-10 पुनरावृत्तियों चलाएँ. सूचना दी संकल्प में परिवर्तन की निगरानी. कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया जाता है, इस प्रक्रिया को रोका जा सकता है.
    7. प्रत्येक यात्रा के बाद, ओवरलैपिंग हिट बाहर. कील की चौड़ाई 30 पिक्सल है जैसे, अगर, अन्य हिट करने के लिए (पैरामीटर "--mindist 30") की तुलना में करीब 30 पिक्सल हैं कि हिट बाहर.
    8. गुणांक एक कम पार सहसंबंध के साथ हिट बाहर निकालें. उदाहरण के लिए, प्रत्येक विरिअन (पैरामीटर "--topp 75") के लिए सबसे अच्छा 75% spikes शामिल हैं.
      नोट: एक कम पार सहसंबंध गुणांक के साथ हिट झूठी सकारात्मक हिट का प्रतिनिधित्व करने की संभावना है.

परिणाम के 6 दृश्य

  1. दृश्य के लिए कल्पना में कील का परिष्कृत संरचना खोलें और परमाणु संरचना की फिटिंग.
    1. इनपुट फ़ाइल के रूप में कदम 5.1.6 में अंतिम यात्रा में बनाया (टैग "एल.पी." से चिह्नित) कम पास फ़िल्टर किए नक्शा फ़ाइल का प्रयोग करें.
    2. उपकरण "मानचित्र में फिट" कल्पना में ढाले आधारित पार से संबंध के लिए कदम 5.1.6 में संकेत संकल्प का प्रयोग करें.
  2. Virio की एक समग्र मॉडल बनाएंn jsubtomo_create_model.py का उपयोग.
    1. के लिए इनपुट नक्शा फ़ाइल के रूप में कदम 5.1.6 में अंतिम यात्रा में बनाया (टैग "एल.पी." से चिह्नित) कम पास फ़िल्टर किए नक्शा फ़ाइल का उपयोग करें (पैरामीटर "--Template").
    2. इनपुट स्टार फ़ाइल के रूप में कदम 5.1.6 में अंतिम यात्रा में उत्पन्न एक स्टार फ़ाइल का उपयोग करें.
    3. समग्र मॉडल (पैरामीटर "--mask") में घनत्व अतिव्यापी के लिए खाते में कदम 3.2.1 में उत्पन्न मुखौटा फ़ाइल का उपयोग करें.
    4. एक ही आकार के एक समग्र मॉडल (पैरामीटर "--size") उत्पन्न करने के लिए विरिअन नक्शा फ़ाइल का आकार संकेत मिलता है.
  3. कल्पना में दृश्य के लिए समग्र मॉडल खोलें.

Representative Results

हम 24 सेट एक पहले प्रकाशित डेटा का उपयोग कर Bunyamwera वायरस (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) का लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन जटिल के लिए ऊपर उल्लिखित उप रण औसतन कार्यप्रवाह के आवेदन प्रदर्शित करता है. डाटा संग्रह और शोधन मापदंडों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं. एक प्रतिनिधि रण चित्रा 2 में दिखाया गया है.

पैरामीटर (इकाई) मूल्य
डाटा संग्रह
वोल्टेज (केवी) 300
कैलिब्रेटेड बढ़ाई (एक्स) 111000
पिक्सेल आकार (क) 5.4
अनुमानित खुराक (ई - / A 2) 100
Underfocus (माइक्रोन) 4.0-4.5
पहले CTF शून्य (क) एक 26-30
टिल्ट सीमा (°) -60-60
ज़ोर नमूना (°) 3
डाटा और शोधन
Tomograms 11
Virions 29
विरिअन प्रति बीज 106
बीज की कुल संख्या 3074
Spikes का पता चला 1,346
Overlaps हटाने के बाद Spikes 1401
पार से संबंध आधारित चयन के बाद Spikes 1,022
Spikes अंतिम औसत में शामिल 1,022
समरूपता C3
कोणीय नमूना (°) 8
संकल्पशोधन में प्रयोग किया जाता रेंज (एक) 42-334
अंतिम संकल्प अनुमान (ए) बी 35

तालिका 1: Bunyamwera डेटा संग्रहण और शोधन के आंकड़े.
एक CTF, इसके विपरीत हस्तांतरण समारोह.
बी 0.143 की एक सीमा पर दो स्वतंत्र रूप से परिष्कृत संरचनाओं के बीच फूरियर खोल सहसंबंध उपयोग कर की गणना.

चित्रा 2
चित्रा 2:. Bunyamwera virions के रण के माध्यम से टुकड़ा प्रत्येक विरिअन की परिधि में स्पष्ट कई कील पक्ष दृश्य तीर के साथ संकेत कर रहे हैं. रण 60 के लिए फ़िल्टर कम पास कर दिया गया है. स्केल बार 100 एनएम.

सबसे पहले, हम 205 मैन्युअल उठाया spikes का उपयोग कर एक प्रारंभिक मॉडल (परिष्कृत (3B चित्रा) लागू किए बिना स्पष्ट हो गया था और शोधन के बाद के दौर (चित्रा -3 सी) में लगाया गया था. विरिअन सतहों पर स्वचालित रूप से सभी spikes पता लगाने के लिए, हम 43 एनएम और 20 डिग्री (चित्रा -4 ए) की रिक्ति की त्रिज्या में प्रत्येक विरिअन के लिए 106 बीज उत्पन्न और iteratively झिल्ली (चित्रा 4 बी) के सापेक्ष अपनी स्थिति को परिष्कृत.

चित्रा 3
चित्रा 3: प्रारंभिक टेम्पलेट संरचना का शोधन. (ए) cylindrically spikes के मैन्युअल परिभाषित पदों से निर्माण (C100) टेम्पलेट औसत. (बी) औसतन घनत्व शोधन के पांच दौर के बाद किसी भी समरूपता के बिना (सी 1) तीन गुना से प्रदर्शित करता है एक कील लगायासममित सुविधाओं. मॉडल का संकल्प 48 है. स्पाइक (सी) औसतन तीन गुना समरूपता के साथ शोधन के पांच दौर के बाद 41 में हल किया गया था.

चित्रा 4
चित्रा 4:.. बीज का शोधन एबी) ए (पहले बीज का एक सबसेट) और बाद (बी) शोधन चित्रा 2 से एक विरिअन घनत्व पर (बी) में बीज दिखाया जाता है किया गया है रंग कोडित संबंधित पार पर आधारित सहसंबंध गुणांक (नीले, कम सहसंबंध, लाल, उच्च सहसंबंध).

(overlaps हटाने के बाद शीर्ष 75%; ~ 1000 spikes) अच्छी correlating ग्लाइकोप्रोटीन कील पैच अंतिम औसत की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. औसत 35 एक संकल्प (चित्रा 5) को हल किया गया था. इसे में, बीच में एक trimeric कील संरचना का पता चलाछह पड़ोसी spikes से कुछ योगदान के अलावा. जाना जाता पदों में संरचना रखकर गणना की virions के समग्र मॉडल, विरिअन सतह (चित्रा 6A) पर spikes के स्थान का पता चला. कभी कभी, spikes के स्थानीय रूप से आदेश दिया पैच (चित्रा 6B) स्पष्ट थे.

चित्रा 5
चित्रा 5: टेम्पलेट मिलान के बाद ग्लाइकोप्रोटीन कील परत का एक पैच के परिष्कृत संरचना. (अटल बिहारी) 'भी' और 'अजीब', डेटा के दो हिस्सों से खंगाला दो नक्शे दिखाए जाते हैं. दो नक्शे दृष्टिकोण की सबलता की पुष्टि करने, समानता की एक उल्लेखनीय डिग्री दिखा. दो नक्शे एक दूसरे से पूरी तरह से स्वतंत्र रूप से खंगाला गया है के रूप में कील लंबे धुरी के चारों ओर उन्मुखीकरण अलग है. दो नक्शे (सी) औसत से दिखाया गया है35 ए के अंतिम संकल्प.

चित्रा 6
चित्रा 6: Bunyamwera विरिअन पर spikes की नियुक्ति. (ए) एक विरिअन के समग्र मॉडल. देखें वैक्टर (लाठी) spikes के झुकाव का संकेत मिलता है. रंग प्रत्येक कील और टेम्पलेट संरचना (नीले, कम सहसंबंध, लाल, उच्च सहसंबंध) के बीच पार से संबंध का संकेत मिलता है. Spikes के एक आदेश पैच (बी) एक बंद हुआ.

Discussion

विरिअन झिल्ली पर वायरल ग्लाइकोप्रोटीन कील संरचना का ज्ञान वायरस प्रतिकृति को समझने और इलाज के लिए और संक्रमण को रोकने के लिए चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए आवश्यक है. एकल कण औसत के साथ संयुक्त इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोपी ग्लाइकोप्रोटीन spikes सहित छा वायरस कणों की संरचनाओं को हल करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि के रूप में उभरा है. हालांकि, इस पद्धति सममित वायरस icosahedrally तक सीमित है. इधर, Jsubtomo में इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी और subtomogram औसत के आवेदन के माध्यम से, हम pleomorphic पर अन्य वर्तमान संरचनात्मक जीव विज्ञान के तरीकों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं कि वायरस ग्लाइकोप्रोटीन spikes छा का निर्धारण करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल रेखांकित किया है. हमारे प्रतिनिधि परिणाम इस विधि का संकल्प डोमेन वास्तुकला, oligomerization, और बरकरार virions पर ग्लाइकोप्रोटीन spikes के उच्च आदेश संगठन में अंतर्दृष्टि प्रकट करने के लिए पर्याप्त है कि प्रदर्शित करता है.

jove_content "> इस प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम इस कदम का एक और. सफल क्रियान्वयन ग्लाइकोप्रोटीन spikes, ताकि पर्याप्त बड़ी और भी कसकर एक दूसरे के खिलाफ पैक नहीं कर रहे हैं मानता है कि एक से सांख्यिकीय स्वतंत्र हैं कि दो विश्वसनीय शुरुआती मॉडल का निर्माण किया जाता है व्यक्ति spikes कर सकते हैं नेत्रहीन मान्यता प्राप्त है और मैन्युअल tomograms में उठाया, और दो स्वतंत्र मॉडल औसतन किया. यह संभव नहीं है, तो प्रोटोकॉल के लिए दो संशोधनों का प्रयास किया जा सकता है. सबसे पहले, दो स्वतंत्र यादृच्छिक मॉडल पहले तो subtomograms के दो यादृच्छिक सबसेट परिभाषित और से निर्माण किया जा सकता इन कैंपेन्स 30 के भीतर subtomograms औसतन. दूसरा, पृथक कील की एक संरचना एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा उदाहरण के लिए, अन्य तरीकों से प्राप्त किया गया है, तो यह एक प्रारंभिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालाँकि, ध्यान कम करने के लिए लिया जाना चाहिए शोधन के अगले दौर वसीयत में दो परिणामस्वरूप मॉडल के रूप में, एक कम संकल्प कट ऑफ (50-70 ए) का उपयोग फिल्टर इस मॉडल पारितकेवल इस संकल्प से परे सांख्यिकीय स्वतंत्र हो. इस चेतावनी के कारण, पूर्व दृष्टिकोण की सिफारिश की है.

इस प्रोटोकॉल से प्राप्य संकल्प चार प्रमुख कारकों पर निर्भर करता है: मैं. डेटा संग्रह रणनीति और इनपुट डेटा की गुणवत्ता, द्वितीय. subtomograms की संख्या, III. संरेखण subtomograms की सटीकता, और चतुर्थ. संरचनाओं की विविधता. पहली और दूसरी सीमा काफी हद तक उच्च संकेत करने वाली शोर प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन CTF के साथ संयुक्त डिटेक्टरों टोमोग्राफी सही और स्वचालित डेटा संग्रह का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, संरेखण सटीकता आगे ब्याज ही की संरचना के आकार और आकार से प्रभावित है. प्रमुख विशेषताओं में कमी छोटे spikes पर इस प्रोटोकॉल लागू करने, यह संरेखण सटीकता और इस प्रकार संकल्प 31 को सुधारने के लिए कील को फैब टुकड़े बाध्य करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. अंत में, संरचनाओं औसतन होने के लिए अगर प्रदर्शनी एकाधिक रचना, उप tomogrAM वर्गीकरण तरीकों अलग अलग रचना औसत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कि अंत करने के लिए, Jsubtomo शक्तिशाली subtomogram वर्गीकरण 9 पेशकश, डायनमो पैकेज के साथ एकीकृत करता है.

ऊपर प्रोटोकॉल अलग वायरल ग्लाइकोप्रोटीन के एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी का पूरक है. Crystallographic संरचनाओं विरिअन झिल्ली के संबंध में ग्लाइकोप्रोटीन के सटीक अभिविन्यास प्राप्त करने के लिए उप रण मूविंग में फिट किया जा सकता है. इस पद्धति के आवेदन निस्संदेह छा वायरस की संरचना और pathobiology पर प्रकाश डाला करने के लिए जारी रहेगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jsubtomo (ver 1.3.1) University of Oxford n/a www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7) NIAMS, NIH n/a bsoft.ws
UCSF Chimera UCSF n/a www.cgl.ucsf.edu/chimera

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