Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel zal zich richten op het ontwikkelen van polymeer gecoate oppervlakken voor de lange termijn, stabiele cultuur van stamcellen verkregen menselijke levercellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Biologische materialen zijn op grote schaal gebruikt in het onderhoud en differentiatie van pluripotente stamcellen 1. Terwijl waardoor deze biologische substraten bevatten vaak een groot aantal ongedefinieerde componenten. Matrigel is een veelgebruikte substraat voor stamcelkweek en differentiatie. Helaas, zijn variabele samenstelling beïnvloedt celfunctie en fenotype. Hoewel een verscheidenheid van alternatieve, meer gedefinieerde biologische matrices zijn gebruikt 2-7, hun dierlijke oorsprong of slechte schaalbaarheid maakt ze ongeschikt kandidaten voor industriële productie. Daarom is de identificatie van synthetische alternatieven, met gedefinieerde samenstelling en betrouwbare prestaties, zijn belangrijke doelen in het stamcelonderzoek.

In een poging om de beperkingen van gedefinieerde celkweek substraten overwinnen, hebben interdisciplinaire samenwerking tussen chemie en biologie synthetische materialen die met de capaciteit om celfenotype ondersteunen. SyntheTIC substraten zijn schaalbaar, kosteneffectief, en kan worden vervaardigd tot complexe 3D-structuren, het nabootsen van de in vivo omgeving. Door deze eigenschappen synthetische substraten zijn op grote schaal gebruikt ter ondersteuning en differentiatie van veel celtypen 8-10 drijven.

Geavanceerde en high throughput assays hebben vergemakkelijkt de snelle screening van synthetische materialen, van grote bibliotheken, en geleverd nieuwe materialen met flexibele eigenschappen met brede toepassingen in het biomedisch onderzoek en ontwikkeling 11-13. Met behulp hoge throughput, polymeer micro-array technologie screening, heel snel geïdentificeerd een eenvoudige polyurethaan (PU134), geschikt onderhoud van humane stamcellen afgeleide hepatocyten. Dit polymeer bleek superieur aan dierlijke substraten met betrekking tot hepatocyt differentiatie en functie 14-16. We hebben vervolgens geoptimaliseerd de coating voorwaarden, topografie en sterilisatieproces voor toegang tot effectenpolymeer prestaties in het stabiliseren hepatocytfunctie en levensduur. Dit heeft belangrijke implicaties met betrekking tot het begrijpen van de fundamentals van de levercel biologie voor cel-gebaseerde modellering en regeneratieve geneeskunde toepassingen.

De techniek die hier beschreven is een voorbeeld van hoe het oppervlak van een synthetisch polymeer kan worden geoptimaliseerd fenotype behouden. Wij geloven dat de combinatie van deze technologie met een efficiënte serumvrij hepatocyte differentiatie protocol heeft de potentie om een schaalbare productie van hepatocyten voor gebruik in in vitro modellen en regeneratieve medicijnen bieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Synthese van PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethyleenglycol) -alt adipinezuur] diol)

Schema 1

Schema 1: Synthese van PHNAGD Schematische voorstelling van de synthese van PHNAGD.. PHNAGD werd bereid door reactie van 1,6-Hexanodiol, diethyleenglycol, neoppentyl glycol en adipinezuur. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethyleenglycol) -alt adipinezuur] diol.

  1. Toepassen warmtebehandeling om de monomeren 1,6-hexaandiol, di (ethyleenglycol) en neopentylglycol bij 40 ° C gedurende 48 uur in een vacuümoven om het resterende water te verwijderen. Laat koude af tot kamertemperatuur onder vacuüm.
  2. Voeg 22 mmol van elk monomeer en adipinezuur (55 mmol) om een ​​twee-hals rondbodemkolf uitgerust met een geroerde bar en verbonden met een Dean-Stark inrichting.
  3. Plaats het geheel onder een vacuüm en verwarm het glassware bij 40 ° C gedurende 6 uur, om eventuele vochtopname tijdens de toevoeging van de chemische stof in de kolf voorkomen.
  4. Voeg via een injectiespuit, druppel voor druppel, 0,0055 mol van de katalysator titanium (IV) butoxyde.
  5. Roer het reactiemengsel bij 180 ° C, onder een N2 atmosfeer gedurende 24 uur, en restolie water in de Dean-Stark val. Laat het product afkoelen tot kamertemperatuur.

2 Synthese van PU134

Schema 2

Schema 2: Synthese van PU134 Schematische voorstelling van de synthese van polyurethaan 134 PU134 werd bereid door reactie van 1,0 equivalent van een PHNGAD met 2,0 equivalenten van een 4,4-methyleenbis (fenylisocyanaat), gevolgd door de toevoeging van 1,0. equivalent van een 1,4-butaandiol ketenverlenger.

  1. Meng een equivalent van de polyol PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3,2 mmol) met twee equivalenten van 4'4-methyleenbis (fenylisocyanaat) (6.4 mmol) in watervrij N, N-dimethylformamide (12 ml).
  2. Roer het reactiemengsel bij 70 ° C, onder een N2 atmosfeer.
  3. Voeg via een injectiespuit druppelsgewijs de katalysator titanium (IV) butoxide (0,8% gew).
  4. Na 1 uur, voeg een equivalent van de ketenverlenger 1,4-butaandiol (3,2 mmol). Verhoog de ​​temperatuur op 90 ° C en roer gedurende 24 uur onder een N2 atmosfeer.
  5. Na de reactie, verzamel het polyurethaan door precipitatie door toevoeging van diethylether (hexaan of water kan worden gebruikt) druppelsgewijs aan de reactieoplossing tot het neerslaan plaatsvindt.
  6. Centrifugeer de oplossing bij 5300 g gedurende 5 minuten.
  7. Giet het supernatant en drogen bij 40 ° C in een vacuüm oven totdat het oplosmiddel verdampt.
    Opmerking: Om ervoor te zorgen dat het eindproduct van de reactie hebben de juiste parameters betreffende de molecuulgewichtsverdeling, de functionele groups van het polymeer en het smelten en glasovergangstemperaturen kunnen diverse analytische technieken en methoden gebruikt, zoals gelpermeatiechromatografie of FITR spectroscopie.

3 Voorbereiding van de PU134 Solutions

  1. Weeg 200 mg PU134 in een glazen fles.
  2. Verdun PU134 een eindconcentratie van 2% in verschillende oplosmiddelen: chloroform, een combinatie van chloroform en tolueen in 1: 1 verhouding, tetrahydrofuran en combinatie van tetrahydrofuran en dichloormethaan in 1: 1 verhouding.
    Opmerking: De keuze van het juiste oplosmiddel varieert afhankelijk van het polymeer te gebruiken. Verschillende oplosmiddelen hebben verschillende kookpunten dat de oplosbaarheid van het polymeer beïnvloeden.
  3. De oplossing wordt krachtig gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een schudder bij een snelheid van 200 mot / min, totdat de oplossing homogeen en geen neerslag waargenomen.

4 Coating van Glass Slides met PU134

  1. Plaats een round 15 mm 2 dekglaasje op de spin coater.
  2. Solliciteer 50 ul van de PU134 oplossing voor elk gebruik van een pipet. Het volume van de oplossing PU134 derhalve voor gewenste dekglaasje grootte waarbij de volume verhouding proportioneel oppervlak.
  3. Draai elk dekglaasje voor 7 sec bij 23 x g.
  4. Droging dekglaasje bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan de sterilisatie.

5 Bestraling van Coverslip

  1. Gamma-bestraald polymeer beklede dekglaasje door een dosis van 10 Grays met een klinisch bestraler voor 12 minuten.
  2. UV-bestraling van polymeer coating dekglaasje met behulp van een 30 W, UV-lamp voor 16 minuten aan elke kant.
  3. Plaats de polymeer beklede dekglaasje in een geschikt weefselkweekplaat volgens formaatschuif.

6 Scanning Electron Microscopy

  1. Gouden jas polymeer dekglaasje door sputteren voor 200 sec in een atmosfeer van 5 x 10 -1 millibar druk.
  2. Leg de microgRAFIEKEN van het polymeer gecoate dekglaasje met behulp van een scanning elektronenmicroscoop in versneld spanning van 20 kV in secundaire elektronen imaging-modus.

7 Atomic Force Microscopy Waarnemingen

  1. Scan een gebied van 20 x 20 urn van het polymeer oppervlak.
  2. Het opzetten van een scansnelheid van 1,32 Hz tot 1,60 Hz.
  3. Het opzetten van een resolutie van 512 x 512 pixels in het gescande gebied.
  4. Bereken het kwadratisch gemiddelde (RMS of Rq) van de bekleding met de gemiddelde hoogte afwijkingen uit de gemiddelde beeldgegevens vliegtuig, uitgedrukt als:

    Waarbij Zi is de huidige waarde Z en N is het aantal punten in het gegeven gebied.
  5. 7.5 Bereken de afwijking of bedoel oppervlakteruwheid (Ra) van het beeld met behulp van,

    Waarbij Z (x) is de functie waarmee t beschrijfthij de oppervlakte profiel in termen van hoogte (Z) en de positie (x) van de steekproef over de evaluatie lengte "L" geanalyseerd. Ra staat voor de gemiddelde waarde van het oppervlak ten opzichte van het middenvlak.

8 Cell Culture en differentiatie

  1. Cultuur en differentiëren van de menselijke embryonale stamcellen lijn (hESC) H9, zoals beschreven in het hooi 17.
  2. Maak cellen met een dissociatie reagens en replate ze op PU134 gecoate glaasjes op dag 9 van het differentiatieproces, in aanwezigheid van een serumvrij medium zoals beschreven in Szkolnicka 18,19.
    Opmerking: Het gebruik van een enzymatische cel dissociatie voorkeur fysieke cel onthechting.

9 cytochroom P450 Functionele Assay

  1. Meet CYP3A activiteit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Incubeer hESC afgeleide hepatocyten op dag 13 of dag 19, en de media, zonder cellen - als een negatieve controle, met de juiste substrat 5 uur bij 37 ° C.
  3. Verzamel supernatanten van cellen en media, voert de test volgens instructies van de fabrikant.
  4. Meet het niveau van CYP activiteit genormaliseerd ten opzichte van het oppervlak (cm2).

10. Immunokleuring

  1. Wash hESC afgeleide hepatocyten met PBS, gedurende 1 min, tweemaal herhalen.
  2. Voeg ijskoude 100% methanol cellen vast, plaats in -20 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Was de cellen met PBS gedurende 5 minuten en herhaal twee keer.
  4. Incubeer de cellen met PBS / T (0,1% tween) / 10% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Zuig het PBST oplossing en voeg het juiste primaire antilichaam verdund in PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, incuberen bij 4 ° C onder zacht roeren O / N.
  6. Was de cellen met PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA gedurende 5 minuten en drie keer herhalen.
  7. Verdun het juiste antilichaam in PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, aan de cellen en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schudden.
  8. Was de cellen met PBS gedurende 5 minuten en drie keer herhalen.
  9. Voeg Mowiol 488 (met DAPI 1: 1000) aan elk putje, voeg een dekglaasje zachtjes aantal luchtbellen verminderen. WINKEL gefixeerde cellen bij 4 ° C in het donker. Observeer kleuring met behulp van een microscoop met een geschikte filter en tl-lamp. De optimale primaire en secundaire antilichamen zijn vermeld in tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polymer oplosmiddel beïnvloedt de topografie van het oppervlak polymeer beklede

Polyurethaan 134 werd opgelost in chloroform, alleen of in combinatie met tolueen of tetrahydrofuran of dichloormethaan en de glasplaatjes roterend bedekken met de verschillende formuleringen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en atomic force microscopie (AFM) werden gebruikt om kenmerken de fysische eigenschappen van het polymeer coatings (figuur 1). De verkregen middels tolueen of chloroform bekleding niet homogeen, waaruit een ongelijkmatige bekleding met PU134 neerslag (Figuur 1A). Daarentegen tetrahydrofuran was een geschikt oplosmiddel waarbij de spin bekleding van een meer uniform oppervlak (Figuur 1A). Oppervlaktetopografie werd gemeten met AFM met de root mean square (RMS) en de gemiddelde ruwheid (Ra). PU134 opgelost tetrahydrofuraan vertoonden een vermindering van 40% in de ruwheid in vergelijking met the andere oplosmiddelen (Figuur 1B en 1C). Deze gegevens tonen aan dat het gebruik van tetrahydrofuran als oplosmiddel verschaft een meer uniforme bekleding van PU134 voor biologische toepassingen.

Polymer topografie heeft een belangrijke impact op hepatocytfunctie

hESC efficiënt worden gedifferentieerd om lever endoderm in vitro, vertonen vele van de functies die in de volwassen lever 17-20. Hepatische endoderm differentiatie werd geïnduceerd en op dag 9 hepatoblast-achtige cellen blijken duidelijk, met de meeste cellen die cytokeratine 19 (99% ± 1.2), α-fetoproteïne (99% ± 0,6) en hepatische nucleaire factor 4α (97% ± 2.6); en lage niveaus van albumine (20% ± 1.7) (figuur 2). Op dit punt werden de cellen losgemaakt met behulp TrypLE uiten en opnieuw uitgeplaat op de verschillende oppervlakken polymeer coating. Als maat voor metabolische functie, cytochroom P450 fzalving werd beoordeeld 4 dagen na het replating. We namen een 2-voudige toename in metabolische activiteit in cellen opnieuw uitgeplaat op tetrahydrofuran / PU134 gecoate oppervlakken (figuur 3). Deze resultaten demonstreren dat hESC afgeleide hepatocyten metabolische activiteit wordt verbeterd met een gelijkmatige coating van PU134, dit in overeenstemming met eerdere benaderingen 21.

Oppervlakte sterilisatie effecten op de bioactieve eigenschappen van het polymeer

Het effect van de sterilisatie op PU134 prestaties werd ook onderzocht. Polymeer beklede glasplaatjes werden blootgesteld aan UV-of gammastraling. Fasecontrast van PU134 beklede glasplaatjes vertoonden geen algemene verschillen onderbrengen UV-of gammastraling (Figuur 4A). Deze waarnemingen werden bevestigd door SEM-analyse (Figuur 4B). De biologische werking van PU134 werd onderzocht met behulp van hESC afgeleide hepatocyten op 10 dagen post-replating. hESC afgeleidhepatocyten replated on-γ uitgestraald PU134 beklede glasplaatjes vertoonde een 3-voudige toename van CYP3A activiteit over cellen uitgeplaat on-UV bestraald PU134 beklede objectglaasjes (Figuur 4C). Deze waarnemingen toonden aan dat gammastraling was optimaal sterilisatietechniek voor onze doeleinden.

Figuur 1
Figuur 1 Optimalisatie van het polyurethaan beklede oppervlak 134. (A) Glasplaten werden bekleed met een oplossing van 2% PU134 opgelost in verschillende oplosmiddelen. Scanning Electron Microscopy (SEM) beelden van de verschillende gecoate glaasjes tonen de aanwezigheid van een homogene gecoate oppervlak en de afwezigheid van polymeer precipiteert bij tetrahydrofuran werd vergeleken met tolueen, chloroform of mengsels van de oplosmiddelen (zwart-witte pijlen). De beelden werden genomen op x1664 vergroting en schalen bars ar e onder de beelden getoond. (BC) Atomic Force Microscopy (AFM) werd gebruikt om de ruwheid van de PU134 gecoate oppervlakken geselecteerde oplosmiddelen analyseren. Analyse van de ruwheid parameters RMS (root mean square) (B) en Ra (de gemiddelde ruwheid) (C) van de verschillende oppervlakken PU134 bekleed blijkt dat de verkregen bekleding met tetrahydrofuran als oplosmiddel had gladde oppervlakken in vergelijking met de rest van de voorwaarden (n = 7). De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± sd, p <0,05 wordt aangeduid *, p <0.01 ** aangeduid en p <0,001 aangeduid ***, gemeten door studenten t-test vergeleken met dia bekleed met PU134 opgelost in tetrahydrofuran. Error bars geven 1 standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

egen "> Figuur 2
Figuur 2 Karakterisering van de hESC afgeleid hepatoblasten. Immunocytochemie toont expressie van hepatische markers AFP, CK19, HNF4α en albumine in hESC (H9) afgeleid lever endoderm. Negatieve controles werden uitgevoerd met overeenkomstige immunoglobuline G (IgG) en representatieve beelden worden weergegeven. Het percentage positieve cellen en de standaardafwijking werden geschat uit ten minste vijf willekeurige gezichtsveld dat ten minste 300 cellen per view. De beelden werden genomen bij een vergroting van 20x. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd foutbalken 1 standaarddeviatie. HNF4α, Hepatocyt nucleaire factor 4α; AFP, α-fetoproteïne; ALB, albumine; CK19, Cytokeratine 19, IgG geit, immunoglobuline G anti-geit, IgG muis, immunoglobuline G anti-muis. Klik hier om een grotere versi bekijkenOp deze figuur.

Figuur 3
Figuur 3 Functionele consequenties van de topografie van het PU134 gecoate oppervlak van de functie van hESC afgeleide hepatocyten. Meting van het cytochroom P450 3A activiteit on-hESC afgeleide hepatocyten gedurende 96 uur op glazen objectglaasjes bekleed met PU134 opgelost in verschillende oplosmiddelen. Een verbetering van de in het cytochroom activiteit van cellen die zijn aangehouden op PU134 beklede glasplaatjes opgelost met tetrahydrofuran (n = 6). De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± sd, p <0,05 wordt aangeduid *, p <0.01 ** aangeduid en p <0,001 aangeduid ***, gemeten door studenten t-test vergeleken met hESC afgeleide hepatocyten gehandhaafd op objectglaasjes bekleed met PU134 opgelost op tetrahydrofuran. Error bars geven 1 standaarddeviatie.


Figuur 4 Optimalisatie van de sterilisatie van de beklede oppervlakken. Fasecontrast (A) of SEM afbeeldingen (B) vertonen geen grote verschillen in PU134 beklede oppervlak tussen γ-straling of UV-straling (UV) behandelingen. Fasecontrast beelden werden genomen bij een vergroting van 40x en SEM afbeeldingen in 1,664X vergroting. (C) Analyse van de cytochroom P450 3A-activiteit op hESC afgeleide hepatocyten gehandhaafd gedurende 10 dagen op PU134 gecoat glas dia's. Een verhoging van de cytochroom P450 3A-activiteit in cellen uitgeplaat on-γ uitgestraald PU134 beklede objectglaasjes in vergelijking met cellen uitgeplaat op UV bestraald PU134 beklede glasplaatjes. Eenheden activiteiten zijn uitgedrukt als relatieve lichteenheden (RLU) ml -1 cm -2 cultuur oppervlak (n = 3). De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± sd, p <0,001 is aangeduid *** gemeten door studenten t-test vergeleken met hESC afgeleide hepatocyten gehandhaafd op PU134 beklede dekglaasjes gesteriliseerd door γ-straling. Error bars geven 1 standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Primaire antilichamen
Antigen Type Bedrijf Verdunning
HNF4α Konijn polyklonaal Santa Cruz 1/100
Albumine Monoklonaal Sigma 1/500
AFP Monoklonaal Abcam 1/500
Cytokeratine 19 Monoklonaal Dako 1/50
IgG Monoklonaal Dako 1/500
Secundaire antilichamen
Anti-konijn 568 Alexa Flour Geit Invitrogen 1/400
Anti-muis 488 Alexa Flour Konijn Invitrogen 1/500

Tabel 1 lijst van geoptimaliseerde primaire en secundaire antilichamen en concentraties gebruikt in deze studie. HNF4α, Hepatocyt nucleaire factor 4α; AFP, α-fetoproteïne; IgG, Immunoglobuline G.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vele huidige methoden voor hepatocyten uit stamcellen genereren afhankelijk zonder gedefinieerde matrices van dierlijke oorsprong. Deze substraten kan kostbaar en zeer variabel zijn, beïnvloeden de celfunctie en stabiliteit, wat neerkomt op een aanzienlijke belemmering voor de toepassing. Daarom voerden we een scherm voor synthetische materiaal dat de kweek van stamcellen afgeleide hepatocyten ondersteunen. We hebben ook behoefte aan een eenvoudige polyurethaan (PU134), gevormd door polymerisatie PHNGAD, MDI en een extender, die in combinatie met een robuuste hepatocyt differentiatie benadering, stabiliseert de hepatocyt fenotype en celfunctie verbetert in vergelijking met Matrigel 15.

Het hanteren van de bestaande biologische matrices, vaak gebruikt in het kweken en differentiërende stamcellen zoals vitronectine 22 laminin 521 23 of matrigel, is effectief voor de korte termijn onderhoud. Daarentegen PU134 gecoate oppervlakken een superieur substraat voor hepatocyTe cultuur. Bovendien is de optimalisatie van oppervlakte topografie en polymeer sterilisatie hebben geleid tot verdere verbeteringen in de cel prestaties, een belangrijke factor in het leveren van menselijke lever modellen op schaal met betrouwbare prestaties.

De aard van de ketenverlenger en fenylisocyanaat is een van de essentiële stappen van de werkwijze; als eliminatie of vervanging van een van beide componenten zou aanzienlijk beperken het polymeer oppervlak en dus de hechting van cellen en de functionele activiteit van stamcellen afgeleide hepatocyten. De samenstelling van het polymeer beïnvloedt fysische parameters zoals elasticiteit en bevochtigbaarheid 24, die van invloed de capaciteit van het polymeer belangrijkste extracellulaire matrix eiwitten betrokken bij hepatocytfunctie vangen. Bovendien verschillen in de katalysator, reactietijd en temperatuur beïnvloeden het molecuulgewicht van het polymeer.

De keuze van het oplosmiddel voor het polymeer re solubiliserenpresenteert een kritiek punt in de verkrijging van een geoptimaliseerd oppervlak polymeer coating. We hebben vastgesteld dat de aard van het oplosmiddel beïnvloedt de topografie van het beklede oppervlak dat direct gevolgen in de functie van de cellen 25-31 heeft. Bovendien, het spinnen tijd en snelheid ook cruciaal verkrijgen dit uniform en homogene coating. Een andere stap te nemen in overweging is het sterilisatieproces op het oppervlak polymeer beklede, de activiteit van de cellen kan worden beïnvloed door de sterilisatiebehandeling gebruikt. Dit kan door de aanwezigheid van gevoelige (en) binnen de structuur van het polymeer verschillende sterilisatie procedures 32-34.

Huidige pluripotente stamcel gebaseerde mobiele modellen bezitten fenotypische en functionele beperkingen. We geloven dat deze geoptimaliseerde polymeer beklede oppervlak vertegenwoordigt een vooruitgang in het gebied omzeilen aantal beperkingen van het gebruik van biologische substtarieven. Bovendien is de mogelijkheid om het polymeer in 3D matrices naar de verbinding van verschillende celtypes in het weefsel van belang te bevorderen, kan verder toenemen cel trouw.

Tot slot, is het gebruik van synthetische materialen steeds belangrijker in de levering van menselijke soma uit pluripotente stamcellen. We hebben een geoptimaliseerd oppervlak en coating procedure die is robuust ontwikkeld en betrouwbaar levert functionele humane hepatocyten met aanzienlijke gevolgen voor de cel-gebaseerde modellering en regeneratieve geneeskunde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DCH is CSO, directeur, oprichter en aandeelhouder van FibromEd Products Ltd MB en GPI zijn oprichter aandeelhouders in FibromEd Products Ltd

Acknowledgments

DCH, MB en FK werden ondersteund door een EPSRC Volg op het Fonds. BL-V en DS werden elk ondersteund door MRC PhD-training. KC werd ondersteund door financiering uit het Verenigd Koninkrijk Regenerative Medicine Platform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125, (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30, (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11, (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26, (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102, (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26, (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50, (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32, (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30, (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31, (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4, (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2, (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6, (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1, (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3, (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33, (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26, (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25, (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231, (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5, (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28, (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19, (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23, (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169, (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77, (1), 103-109 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics