Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Embryonale chick retina cellekulturer udgør værdifulde værktøjer til undersøgelse af fotoreceptor biologi. Vi har udviklet en effektiv genoverførsel teknik baseret på ex ovo plasmid elektroporation af nethinder før kulturen. Denne teknik forøger transfektionseffektiviteten i øjeblikket tilgængelige protokoller, hvilket gør genmanipulation muligt for dette system.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Keglen fotoreceptor-berigede kulturer afledt af embryonale chick nethinder er blevet et uundværligt redskab for forskere i hele verden studerer biologi retinale neuroner, især fotoreceptorer. Anvendelserne af dette system ud over grundforskning, da de let kan tilpasses til højt gennemløb teknologier for lægemiddeludvikling. Imidlertid har genmanipulation af retinale fotoreceptorer i disse kulturer vist sig at være meget udfordrende, udgør en vigtig begrænsning for anvendeligheden af ​​systemet. Vi har for nylig udviklet og valideret en ex ovo plasmid elektroporation teknik, der øger hastigheden af transfektion af retinale celler i disse kulturer med fem gange sammenlignet med andre aktuelt tilgængelige protokoller 1. Ved denne fremgangsmåde embryonale chick øjne er tømte i trin 27, RPE fjernes, og retinal koppen er placeret i et plasmid-indeholdende opløsning og elektroporeret under anvendelse af let konstrueres kun-lavet elektroder. Nethinder derefter dissocieres og dyrkes under anvendelse af standardprocedurer. Denne teknik kan anvendes til overekspression undersøgelser samt til nedregulering af genekspression, fx via anvendelse af plasmid-drevet RNAi teknologi, der almindeligvis opnå transgen ekspression i 25% af fotoreceptor befolkning. Den video format denne publikation vil gøre denne teknologi let tilgængelig for forskere på området, hvilket muliggør studiet af gen-funktion i primære retinale kulturer. Vi har også inkluderet detaljerede forklaringer om de kritiske trin i denne procedure for et vellykket resultat og reproducerbarhed.

Introduction

Dissocierede cellekulturer fra embryonale chick nethinder er ofte blevet brugt til at studere forskellige aspekter af fotoreceptorer cellebiologi, herunder deres overlevelse 2-9, differentiering 10-12, neuritvækst 13, og meget mere. Fordelene ved dette system, der er udviklet i 1980'erne af Ruben Adler og samarbejdspartnere og perfektioneret af hans og andre grupper 14-20, bor i de iboende egenskaber chick som en dyremodel 21. Den store størrelse af chick øjet, selv ved fosterstadiet, giver store mængder materiale for kulturer. Desuden, når kulturer udføres ved anvendelse af embryonale dag (ED) 5 - 6 nethinder, 55 - 80% af deres progenitor celler differentierer som fotoreceptorer 14,15,18,22,23, og da ca. 86% af fotoreceptorerne i dette dyr er kegler 24, disse kulturer er særligt egnede til undersøgelser, der fokuserer på denne celletype.

Vi har for nylig udvikPED og karakteriseret en simpel teknik, som muliggør højeffektiv plasmid transfektion af cellerne i disse kulturer, og dermed udvide anvendeligheden af dette system ved at lette genetisk missexpression undersøgelser 1. Udviklingen af ​​denne teknik stammede fra et tomrum i den videnskabelige litteratur af metoder, der vil tilvejebringe et acceptabelt niveau for transfektion at muliggøre undersøgelse af genfunktion i en celle uafhængig måde. Dette skyldes delvist, at primære neuronale kulturer er notorisk svære at transficere 25,26. Nogle af de mest almindeligt anvendte teknikker tidligere tilgængelige til dette formål inkluderet kemiske transfektionsfremgangsmåder såsom lipofektion eller calciumphosphat-medieret transfektion, der resulterer i effektiviteter i størrelsesordenen 3-5% og kan være en betydelig toksicitet 27-32. Selv om anvendelsen af ​​plasmider med en enzymatisk reporter systemet kan omgå problemet med ringe transfektionseffektivitet ved at forstærke signalet, ikke dediskriminere celle-specifikke effekter, og deres resultater er baseret på en lille celle befolkning, der måske ikke er repræsentative for hele. En anden meget anvendt metode i chick, RCAS virusinfektion, er kun for prolifererende celler og dermed ikke egnet til dette primære retinal kultur-system 33.

I den nuværende protokol embryoniske kyllinge øjne er tømte i trin 27 (ED 5), det retinale pigmenterede epithelium (RPE) fjernes, og retinal koppen er placeret i et elektroporation kammer fyldt med et plasmid-indeholdende opløsning og elektroporeret under anvendelse af specialfremstillet elektroder, efterfulgt af retinal dissociation og kultur under anvendelse af standardteknikker 21. Efter optimering denne procedure har vi været i stand til konsekvent at opnå transfektionseffektiviteten af ​​størrelsesordenen 22% af det samlede antal celler i kultur og 25% i fotoreceptor befolkningen alene, uden at det går overlevelse og differentiering egenskaberkulturer 1. Her giver vi en detaljeret protokol beskriver alle de vigtige trin i denne procedure for at sikre succes og reproducerbarheden af ​​denne teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i dette arbejde blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der anbefales af Animal Care og brug Udvalg på Johns Hopkins University.

1. Forud for tid: Udarbejdelse af Instrumenter, reagenser og fade

  1. Fremstilling af æg: Inkuber befrugtede White Leghorn hønseæg ved 37,5 ° C og 60% relativ fugtighed i 5 dage i et æg inkubator.
    BEMÆRK: En inkubator med rokkende kapacitet kan være nyttige for standardisering og synkronisering fosterudvikling, men vuggende er ikke strengt nødvendig for resultatet af denne protokol.
  2. Plasmidpræparat:
    1. Design plasmidkonstruktion til gen-overekspression eller nedregulering (for eksempel gennem anvendelse af RNAi teknologi 1,34) efter behov. Omfatter et reportergen (såsom EGFP, RFP eller LacZ) i konstruktionen når det er muligt.
      BEMÆRK: Nogle almindeligt anvendte promotorer, såsom CMV, kan blive bragt til tavshed efter gang. Den KAG salgsfremER (kylling beta-actin-promotor med CMV-enhanceren) er et meget godt alternativ, yde effektiv langsigtet ekspression af genet af interesse 35-37.
    2. Fremstilling af et plasmid opløsning ved en koncentration på 1,5 pg / pl i sterilt PBS. EKSTRA: Forbered plasmid løsning forud for tid og gemme det frosne indtil den er klar til brug.
      BEMÆRK: Højere plasmid koncentrationer ikke fører til en betydelig stigning i effektivitet, mens anvendelse af lavere plasmid koncentrationer lavere transfektionseffektiviteten 1.
  3. Elektroder:
    1. Til anoden brug en tyk guld tippet elektrode (se tabel for specifikke materialer / udstyr). Tørres af med 70% ethanol.
      BEMÆRK: Isolering af guldet tippes elektroden, mens omkring 0,5 mm udsættes for, er det tilrådeligt at minimere lækage af den elektriske strøm. Information til isolerende materiale kan findes i Tabel over specifikke materialer.
    2. Lav en katode ud af en 2,5 mm firkantet box filament, 4,5 mm bred (normalt anvendes i mikropipette aftrækker). Ved hjælp af pincet, fortryde den firkantede boks og ret glødetråd i en lang strimmel. Derefter, under dissektionsmikroskop og ved hjælp af en lineal som en guide, bøje af filamentet til et kvadrat "U" form 3 mm lange ved basis og 2 mm høje ved den ene side, med den anden side den resterende længde af filament (figur 1 , C - D). Ved hjælp af pincet, dyppe elektroden i 96% ethanol og flamme for at sterilisere. Så vedhæfte en elektrisk føring med et lille krokodillenæb til længere arm af elektroden.
  4. Elektroporering Chamber Setup:
    1. Forbered elektroporation kammer ved at skære låget af en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og anbringe det, flade side nedad, til en 100 mm petriskål under anvendelse af tape (figur 1E).
      BEMÆRK: Anden beholder i form af en brønd af tilsvarende størrelse ville arbejde; imidlertid et mikrocentrifugerør låg er let tilgængelig og autoklaveres. Brøndenskal være stor nok til at rumme en kylling øje og katodeelektrode, men ikke så stor, at det resulterer i et spild af plasmid opløsning.

2. Ex ovo Elektroporation Procedure

  1. Udarbejdelse af instrumenter:
    1. Sterilisere mikro-dissektion værktøjer (2 par store buede Moloney pincet til åbning æggeskaller og øse ud embryoner, 2 par fine-tip buede Dumont pincet til at fjerne RPE, et par Bonn tandede pincet til at fjerne linsen og glaslegemet) ved at dyppe tips i 96% ethanol og flambering. Ren dissektion anvendelsesområde ved hjælp af klude dyppet i 70% ethanol. Varm en flaske sterilt calcium og magnesium-fri Hanks Balanced Salt Solution (CMF-HBSS) i en 37 ° C vandbad. Fyld 100 mm sterile petriskåle til 3/4 fuld med varmt CMF-HBSS.
    2. Placer elektroporation kammer under en anden ren dissektion mikroskop og fyld med 120 ul plasmid løsning. Tilslut elektroder apparat elektroporering, hvilket gørsikker custom-made elektrode er forbundet til den negative pol og guld tippet elektrode til den positive pol.
  2. Embryo Kollektion:
    1. Rens æggene ved at tørre skaller med klude vædet i 70% ethanol. Oprethold steril procedure i hele resten af ​​protokollen at undgå at udføre forurening ind i kulturer. Brug store buede Moloney pincet forsigtigt åbne et hul i æggeskallen ved forsigtigt at trykke på den afrundede spids af et æg (æteren kammer) og derefter gribe og trække shell stykker.
    2. Med et andet par pincet fjerne membraner og indsamle foster ved at øse det ud af ægget (pas på ikke at beskadige embryoet). Placer den i et fad med CMF-HBSS.
      BEMÆRK: Indsamle så mange embryoner som nødvendigt for at opnå det ønskede antal retina kopper for elektroporation som angivet i 2.4.4
    3. Kritiske trin: Stage embryoner i henhold til Hamburger og Hamilton 38.
      BEMÆRK: For at opnå optimal effektivitet embryonerskal være i trin 27 (figur 2A).
    4. Euthanize embryoner ved halshugning ved hjælp Moloney pincet.
  3. Indhentning Retinale Cups:
    1. Brug fine Dumont pincet, omhyggeligt enucleate øjnene og overføre til en ny CMF-HBSS fad.
    2. Startende fra den bageste del af hvert øje, tæt på synsnerven, og ved anvendelse af to fine Dumont pincet, indføre spidsen af ​​hvert pincet mellem neurale nethinde og RPE og omhyggeligt dissekere ud RPE være forsigtig for ikke at beskadige den neurale nethinden (figur 2B).
      BEMÆRK: Manglen på Ca2 + og Mg2 + i opløsningen vil hjælpe RPE løsnes fra neurale nethinde lettere.
  4. Elektroporering:
    1. Opsæt elektroporator parametre til at levere 5 firkantede pulser af 15 volt, 50 ms varighed, og 950 ms interval. Place 'U' formet negativ elektrode inde elektroporation kammer (mikrocentrifuge låg fylded med 120 pi plasmid-indeholdende opløsning).
    2. Ved hjælp af buede Dumont pincet overføre en retinal cup til elektroporation kammer (ved øse, ikke presning), og placere den inde i 'U' formet elektrode, med den bageste del af nethinden mod bunden af ​​elektroden og linsen opad ( Figur 2D).
    3. Placer anode, så det rører den forreste del af øjet, ved siden af ​​objektivet, og ved hjælp af elektroporator fod pedal levere de elektriske impulser.
    4. Overfør elektroporeret retinal cup til en ny petriskål med CMF-HBSS og elektroporation procedure gentages med hver af de resterende retinale kopper.
      Kan elektroporeret Op til 6 retinale kopper med det samme plasmid løsning uden en betydelig nedgang i transfektionseffektiviteten: BEMÆRK.
    5. Fjern linsen og glaslegeme af hver elektroporeret retinal bæger ved at tage fat dem med Bonn fortandede pincet og forsigtigt at trække gennem than elev åbning, mens du holder øjet på plads med bagsiden af ​​de buede Dumont pincet.
    6. Fortsæt til dissociation og kultur af de elektroporerede retinale celler efter standardprocedurer.
      BEMÆRK: For en detaljeret protokol om dissociation og kultur chick retinale celler refererer til Vergara og Canto-Soler, 2012, Ekstra fil 4 21 I denne protokol cellerne podet ved lav densitet på polyornithin-belagte 6-brønds plader eller 35. -mm retter (6 x 10 5 celler / 35 mm-diameter hul eller skål). Det anvendte medium er medium 199 med penicillin / glutamin, 10% føtalt kalveserum (FCS), og linolsyre-BSA ved 100 ug / ml. Kulturerne holdes i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO2. Ved anvendelse af denne procedure, 5 - kan typisk opnås 6 x 10 6 celler pr hvert trin 27 elektroporeret øje.
      BEMÆRK: Ideelt set bør ikke mere end 3 timer passere mellem embryonindsamlingsteam og celle plating, for at sikre god celleoverlevelseog minimere stress. En typisk timing for observation og yderligere analyse er efter 4 dage i kultur, da der på dette tidspunkt cellerne har opnået gode morfologiske og molekylære differentiering og overlevelse er stadig høj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her præsenterer vi en enkel protokol til plasmidtransfektion ind tømte chick retinale pokaler til efterfølgende dissocieret cellekultur. Transfektion opnås ved elektroporering under anvendelse af let at gøre brugerdefinerede elektroder (figur 1 - 2). De i denne protokol beskrevne parametre er blevet optimeret for at opnå transfektionseffektiviteten der spænder mellem 20 og 27% (med et gennemsnit på 22%) (figur 3D). Bemærk, at for de ovenfor anførte grunde, er disse resultater kvantificeres efter 4 dage i kultur. I denne sammenhæng transfektionseffektivitet refererer til procentdelen af ​​celler, der udtrykker transgenet inden for den samlede cellepopulation. Hvis kun fotoreceptor befolkning tages i betragtning, transfektionseffektiviteten stige til et gennemsnit på 25% (figur 3D). Dette er et vigtigt træk, da disse typer af kulturer primært bruges til at undersøge fotoreceptorer.

Cellekulturer, der er blevet electroporat ed hjælp af denne teknik er ikke skelnes fra deres ikke-elektroporeres modstykker i deres morfologi under DIC belysning, celle overlevelse karakteristika, og udtryk for molekylære markører såsom visinin (en meget anvendt markør af fotoreceptorer) og Pax6- 1.

Figur 1
Figur 1. Making af elektroderne. (A - D) Katoden er lavet af en firkantet kasse filament (A), som først rettede (B) og derefter bøjet med pincet ind i et firkantet "U" form (C - D). Anoden er en tyk guld tippes elektrode (D); Læg mærke til isolering omkring anodeelektroden, efterlader kun 0,5 mm i spidsen udsættes for. (E) Elektroporation setup. Indsatte viser større forstørrelse af indrammede areal.pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Forberedelse af retinale Cups til Elektroporation. (A) Chick embryo på Hamburger og Hamilton fosterstadiet 27. (B) RPE fjernes omhyggeligt fra de tømte øjne ved hjælp af skarpe Dumont pincet. (C) Den retinal kop på højre er blottet for RPE og klar til elektroporation. (D ) Katoden elektrode er anbragt inde i en elektroporation kammer lavet af et 1,5 ml mikrocentrifugerør låg fyldt med plasmid opløsning. Den nethinden kop er omhyggeligt overført til katoden opad, og anodeelektroden er placeret på toppen, ved siden af linsen. Klik her for at se en større versionaf dette tal.

Figur 3
Figur 3. Effektivitet af transgen ekspression i dyrkede celler efter Elektroporation (A - C). Retinale kopper blev elektroporeret med en GFP-ekspressionsplasmid, dissocieret og dyrket i 4 dage. Fluorescens mikrofotografier viser DAPI farvede kerner (A) og GFP udtrykke retinale celler (B). Anti-Visinin antistof farvning blev udført for at identificere fotoreceptorer (C). (D) graf, der viser transfektionseffektivitet opnås ved ex ovo elektroporering, repræsenteret som procentdelen af GFP-udtrykkende celler blandt de totale cellepopulation (DAPI positive), eller blandt fotoreceptor befolkningen, navnlig (Visinin positive). Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SEM for 5 uafhængige eksperimenter. Målestokken i (A - C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske skridt for succes i denne protokol er at vælge den rette fase af embryoner. I tidligere udgivelser, er en række embryonale stadier givet for disse kulturer, typisk defineret af dages inkubation eller embryonale dage (ED); dermed er det normalt antages, at bruge ED 5 til ED 6 embryoner vil give tilsvarende resultater. Men vi har fundet, at på scenen 27 (ED 5), vil transfektionseffektivitet være omkring 22% af den totale cellepopulation, som anført ovenfor; endnu effektivitet vil falde til 16%, hvis du bruger stadie 28 embryoner (ED 5.5), og til 12% på stadium 29 (ED 6) 1. Andre kritiske trin omfatter opretholde sterile forhold i hele processen; erhverve den nødvendige håndelag for at undgå at beskadige nethinden under dissektion og elektroporation; og undgå lange huller fra tidspunktet for embryonindsamlingsteam til tidspunktet for cellens plating.

En anden vigtig overvejelse for at sikre god transfektion effektitikker er koncentrationen af ​​plasmidet-opløsning: Den anbefalede 1,5 pg / pl er den laveste koncentration, vi testede, som ikke resulterer i et fald i effektiviteten. Denne koncentration svarer til en stor mængde plasmid materiale i betragtning af at de retinale kopper bades i denne løsning. Ved hjælp af mindste størrelse og der vil rumme øjet (såsom et mikrocentrifugerør låg) kan minimere dette problem. Desuden kan flere øjnene elektroporeret under anvendelse af den samme opløsning; Vi har ikke set en reduktion i effektivitet, når elektroporere op til 6 retinale kopper hinanden i den samme plasmid løsning, og mere kunne muligvis blive udført, men vi kan ikke bevidne forskellen i effektiviteten derefter.

Tidligere publicerede protokoller har typisk tilvejebragt lav effektivitet af genoverførsel for denne type kultur, og dermed de ofte var afhængige af teknikker, der måler et produkt af enzymatiske reaktioner på en celle lysate med henblik på at øge følsomheden. En sådan fremgangsmåde har den ulempe ikke giver mulighed for diskrimination celletype og forlade sig på et lavt antal celler er ansvarlige for den observerede udfald, hvilket ikke altid være reflekterende adfærd af den større cellepopulationen. En anden måde at omgå problemet med lav effektivitet er at udføre gentransfektionstest in vivo, før øjet enucleation og kultur. Dette er en brugbar fremgangsmåde, men det kan normalt kun anvendes på specifikke eksperimentelle paradigmer, da både plasmid elektroporation og RCAS virusinfektion (en fælles gentransduktion vektor i chick) typisk skal udføres på tidligere udviklingsstadier, hvilket skaber en tidsforskydning mellem transfektion og kultur. Dette er en vigtig overvejelse, fordi i denne tidsforskydning cellerne udsættes for virkningerne af både det ekstracellulære mikromiljø samt intracellulære faktorer, som har væsentlige konsekvenser i fortolkningen af ​​experimental resultater. I modsætning hertil den betydelige stigning i genoverførselseffektivitet opnås med ex ovo elektroporation metode giver mulighed for undersøgelse af genfunktion i en celle-intrinsisk måde. Desuden kan fordelen ved denne høje hastighed transfektion øges yderligere, når det anvendes i forbindelse med automatiseret høj-throughput celleanalyse 1.

Ved de indledende faser af udviklingen af denne teknik fastholdt vi elektroporeres RPE-blottet øjestykker i kultur i 24 timer for at vurdere effektiviteten af elektroporation opnået med forskellige forhold 1. Selvom vi ikke har forsøgt at kultur dem i længere tid, vores erfaringer viser, at den protokol, der er beskrevet heri også kunne anvendes på undersøgelser afhængige af retinale organotypiske eksplantater, forudsat passende langsigtede eksplantatet dyrkningsbetingelser anvendes.

Endelig vil det være muligt at udvide anvendeligheden af ​​ther ex ovo elektroporation tilgang til andre dyremodeller. For eksempel i vores erfaring transfektion af muse øjne på postnatal dag 1 eller 4 ved anvendelse af denne protokol gav kvalitativt gode resultater i eksplantatkulturer, men når dissocierede cellekulturer blev forsøgt transfektionseffektivitet var i størrelsesordenen 6%, svarende til den af ​​andre teknikker. Således kunne dette være et simpelt alternativ til andre protokoller til denne dyremodel, men det vil være nødvendigt at være optimeret til det særlige system, hvis der kræves høje virkningsgrader. Af note, som anført ovenfor, fosterstadiet på tidspunktet for elektroporation var nøglen til højeffektiv resultatet opnået i chick, så denne parameter bør overvejes nøje ved anvendelsen af ​​teknik til andre modeller.

Som konklusion kan ex ovo elektroporation teknik udvide anvendeligheden af in vitro-retinale systemer effektive værktøjer til at supplere in vivo studier, der tilbyder new muligheder for retinal forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55, (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50, (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28, (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34, (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121, (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8, (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19, (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243, (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99, (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178, (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5, (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27, (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34, (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153, (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140, (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75, (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64, (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271, (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104, (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25, (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25, (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50, (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294, (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148, (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37, (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195, (4), 231-272 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics