Quantificação de Orofacial nos fenótipos
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

Biology

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Summary

Um método para quantificar o tamanho e forma orofacial de embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Neste protocolo, as medições de tamanho tradicional são combinados com morfometria geométrica para permitir análises mais sofisticadas de desenvolvimento orofacial e defeitos.

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Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

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Abstract

Xenopus tornou-se uma ferramenta importante para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial e defeitos. Um método para quantificar o desenvolvimento orofacial irá permitir uma análise mais rigorosa dos fenótipos orofaciais mediante revogação com substâncias que podem manipular geneticamente ou molecularmente a expressão do gene ou a função da proteína. Usando imagens bidimensionais dos chefes embrionárias, dimensões, tais como tamanho tradicional orofacial largura, altura e área- são medidos. Além disso, uma medida de arredondamento da abertura da boca embrionária é usada para descrever a forma da boca. Morfometria geométrica destes dois imagens tridimensionais também é executada para fornecer uma visão mais sofisticada de mudanças na forma da região orofacial. Marcos são atribuídos a pontos específicos na região orofacial e coordenadas são criados. A análise de componentes principais é usada para reduzir coordenadas marco para componentes principais que, em seguida, discriminam o tratamentogrupos. Estes resultados são exibidos como um gráfico de dispersão em que os indivíduos com formas orofaciais semelhantes se agrupam. Também é útil para executar uma análise da função discriminante, que compara estatisticamente as posições dos pontos de referência de entre dois grupos de tratamento. Esta análise é apresentada em uma grade transformação, onde mudanças na posição do marco são vistos como vetores. A grade é sobreposto a estes vetores para que um padrão de deformação é exibido para mostrar onde as posições marco significativas mudaram. As mudanças de forma na análise da função discriminante baseiam-se numa medida estatística, e, por conseguinte, pode ser avaliada por um valor de p. Esta análise é simples e acessível, necessitando apenas de um estereoscópio e software freeware, e, portanto, será um recurso valioso de pesquisa e ensino.

Introduction

Entre os tipos mais prevalentes e devastadores de defeitos congênitos humanos são aqueles que afetam a boca e face, tais como fendas orofaciais um. Crianças com estruturas orofaciais malformados passar por várias cirurgias ao longo da sua vida e luta com desfigurações faciais, voz, audição e problemas alimentares. Portanto, facilitando novas pesquisas no desenvolvimento crânio-orofacial e é fundamental para a prevenção e tratamento destes tipos de defeitos congênitos em humanos. Xenopus laevis surgiu como uma nova ferramenta para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial (alguns exemplos incluem 2,3,4 -11). Portanto, um método quantitativo para analisar tamanho e forma as mudanças durante o desenvolvimento da cabeça e do rosto desta espécie poderia ser muito poderosa 3.

Aqui, apresentamos um método desse tipo; combinando medidas tradicionais de tamanho, com morfometria geométrica adaptados de um estudo Xenopus 12 13-15. O objetivo deste protocolo é permitir que pesquisadores para quantificar o tamanho e formas facial para distinguir entre diferentes fenótipos orofaciais durante o desenvolvimento normal e anormal. Essa análise permitirá uma melhor diferenciação entre defeitos craniofaciais sutis, como os decorrentes de efeitos sinérgicos de genes e / ou fatores ambientais. Além disso, este método de quantificação também poderia revelar até mesmo ligeira melhoria ou resgate de um defeito orofacial. Este, portanto, faz com que seja um guia útil na análise de potenciais terapias.

A combinação das medidas faciais e morfometria geométrica que apresentamos aqui permite uma análise estatística mais abrangente, tanto em tamanho e forma da região orofacial do que os protocolos actuais, que utilizam, em grande parte apenas um ou outro 15-18. Além disso, apresentamos uma forma simples de avaliar tanto a medial e planos laterais deo rosto sem a necessidade de equipamentos de imagem tridimensional sofisticado usado em estudos atuais 13,19.

Demonstramos esse protocolo em Xenopus laevis embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico que induz o desenvolvimento orofacial anormal e um 2,3 fenda palatina mediana. A quantificação das dimensões e forma da região orofacial nestes embriões revelou mudanças no terço médio da face, que é análogo aos seres humanos com fissuras palatinas semelhantes e modelos de mouse 20,21. No entanto, este protocolo pode ser utilizado para avaliar os efeitos de outros compostos no desenvolvimento orofacial substâncias naturais, tais como, herbicidas, ou proteínas, tais como factores de crescimento. Além disso, o tamanho e forma alterações orofaciais decorrentes de perturbação da expressão génica por via da perda ou ganho de experiências de função (utilizando morpholinos anti-sentido ou Crispers / Talens) pode também ser quantificada usando este protocolo. Por fim, desenvolvemos este método specificalmente para avaliar a morfologia de Xenopus; no entanto, é facilmente modificado para análise de qualquer vertebrado. Outras aplicações também poderia incluir o uso deste protocolo para a comparação de espécies estreitamente relacionadas para estudos evolutivos ou ecológicos. Embora o exemplo que fornecemos aqui utiliza este protocolo para descrever a análise da região orofacial, que poderia ser facilmente modificado para análise de outras regiões, órgãos ou estruturas.

Este protocolo quantificação orofacial vai se tornar um recurso valioso para a comunidade de pesquisa, bem como uma excelente ferramenta de ensino para os alunos de graduação como uma demonstração em vídeo.

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Protocol

Todos os experimentos realizados utilizando Xenopus laevis foram aprovados pelo IACUC (protocolo nº AD20261).

1. Reagentes Preparar e materiais necessários

  1. Reagentes:
    1. Faça 1 L de 10x MBS (Modificado salinos de Barth) solução 22. Adicionar NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), e NaHCO3 (25 mM) a 1 L de água destilada. Ajustar o pH para 7,8 com NaOH.
    2. Adicione 1 L de 1x MBS diluindo 100 ml de 10x MBS solução em 900 ml de água destilada. Adicionar 0,7 ml de uma solução M de CaCl2.
    3. Adicione 1 L de MBS 0,1x diluindo 100 ml de solução 1x MBS, em 900 ml de água destilada. Para 1 L de solução de MBS 0,1x, adicionar 1 ml de 10 mg / ml de solução de gentamicina para uso na cultura do embrião.
    4. Adicione MBS elevadas de sal por dissolução de 4 ml de 5 M de NaCl em 100 ml de 10x MBS. Em seguida, adicione água destilada até que o volume total é de 1 L.
    5. Faça etanol 70% por diluição de 100% eThanol de etanol a 70% com água destilada.
    6. Adicione BMS-543 por preparação de uma solução stock de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO).
    7. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) por adição de 4 g de paraformaldeído em pó a 50 ml de água destilada. Aquecer numa placa de aquecimento a aproximadamente 65 ° C, altura em que adicionar 5 NaOH M gota a gota, até que a solução limpa.
      1. Uma vez que a solução limpa, retire do fogo e adicione 50 ml 2x PBS e 100 mL de Tween-20. Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente em gelo. Ajustar o pH a entre 7,2 e 7,5 utilizando HCl.
    8. Adicione uma solução salina tamponada com fosfato com Tween (PBT) por dissolução de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 800 ml de água destilada. Usando HCl, ajustar o pH para 7,4. Adicionar 2 ml de Tween-20. Ajustar o volume final com água destilada até 1 L. igual
    9. Faça uma solução de cisteína dissolvendo 1 g de cisteína em 50 ml de água destilada ou 0,1x MBS. Adicionar 1,5 mL de 5 M NaOH umnd ajustar o pH para 7,8.
    10. Adicione uma solução estoque de 10% de benzocaína através da adição de 10 g de pó de benzocaína a 100 ml de EtOH a 100%. Para eutanásia de adultos do sexo masculino e embriões prontos para fixação, diluir a uma solução de 0,05%.
    11. Adicione uma solução de armazenamento dos testículos por adição de 1 ml de soro de vitela a 9 ml de tampão de L15.
  2. Ferramentas necessárias e Equipamentos:
    1. Obter o equipamento listado na tabela de materiais e equipamentos, mostrada na Figura 1.
    2. Modificar uma ferramenta pipeta. Colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro para uma chama de um queimador de Bunsen. Gire a ponta da pipeta até que derreta e forma uma extremidade selada arredondado.
    3. Nivelar modelagem da argila para o fundo de uma placa de Petri de plástico, alisando-se a cobrir a totalidade da placa (qualquer tamanho pode ser utilizada) (Figura 1Aiv).
      1. Pressione levemente uma agulha provocação direto para o prato forrado de argila em um ângulo de 45 °. Segure a agulha lá, e mova lentamente a Petriprato horizontalmente para criar uma linha deprimida (Figura 1bi). Repita o procedimento para o número desejado de linhas.
      2. Utilizar a extremidade de uma ferramenta de pipeta de vidro para tornar superficiais, depressões circulares em cada linha do prato alinhado com argila para colocar cabeças de embrião (Figura 1Bii) e ajuda na organização dos embriões, enquanto que fotografa.
      3. Para a fotografia, preencher prato com PBT (Figura 1Biii). Entre os usos, lavar muito bem o prato e a superfície da argila com água esterilizada, seguida de etanol a 70%.

2. Xenopus laevis Embrião Cultura e Inibidor Tratamentos

  1. A fertilização in vitro e cultura de ovos de Xenopus:
    1. Obtenha e cultura Xenopus laevis embriões usando métodos padrão publicado 22,23.
    2. Resumidamente, a eutanásia um macho adulto por submersão em uma solução de benzocaína 0,05%. Dissecar testículos e armazenar na memória de armazenamento testículos. Injetarfêmeas adultas com gonadotrofina coriónica humana (HCG), a recolha de ovos em MBS elevados de sal, e fertilizar in vitro com testículos dissecados (Figura 2A, B).
    3. Cultura de embriões em MBS 0,1x a 15 ° C até à fase desejada é atingida (embriões nos estágios de acordo com a tabela normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop e Faber 24,25).
      1. Aqui, os embriões de cultura até o estágio 22 (após a fertilização 24 hr (hpf)), e remover a membrana vitelina sob microscópio estereoscópico usando dois pares de fórceps afiadas. Transferência de embriões com um padrão, descartável pipeta de transferência para uma placa de Petri limpo (100 mm de diâmetro) contendo 30-40 ml de 0,1x MBS.
  2. Inibidor de tratamentos de embriões de Xenopus (ilustrados na Figura 2):
    1. Encha as cavidades necessárias de uma placa de cultura de 24 cavidades com 1 ml de MBS 0,1x utilizando uma pipeta calibrada pelo homem. Demarcar o exterior do poço com uma marca de ponta finaer (Figura 2D, inserção). Use também o marcador para rotular os conteúdos a serem adicionados a cada poço 24 na tampa bem prato de cultura. Copie esta informação em uma página de 24 poços set-up no caderno de laboratório.
    2. Transferir 5-10 embriões em cada poço usando um padrão, descartável pipeta de transferência (Figura 2C). Inserir o mesmo número de embriões em cada poço.
    3. Atestar ou remover os MBS 0,1X para que ele fique ao nível do 1 ml linha marcada (Figura 2D). Adicionar o volume apropriado de DMSO (de modo que o volume final de DMSO é de 1%) e agitar suavemente. Ter cuidado de não adicionar DMSO demasiado perto dos embriões, e evitar o contacto dos embriões com a superfície do tampão.
    4. Adicionar o volume adequado de produto químico aos poços e agitar suavemente novamente. Aqui, adicionar 1 ul de 10 mM de BMS-453 (um antagonista do receptor de ácido retinóico) e 9 mL de DMSO a 1 ml de MBS 0,1x.
    5. Se o produto químico é sensível à luz, vagamente embrulhar o culprato tura em papel alumínio. Embriões em cultura a 15 ° C incubadora até o estágio desejado. Neste exemplo, o tratamento de embriões para 16-18 hr.
  3. Lavar embriões fora do tratamento e criação até estágios de girinos:
    1. Remover um meio a três quartos da solução com uma pipeta de transferência descartável. Tenha cuidado para não perturbar os embriões. Usando uma nova pipeta, encher o bem com 0,1X MBS. Repita isto 3-6 vezes.
    2. Embriões de transferência para uma grande placa de Petri (150 mm de diâmetro) contendo 100 ml de MBS 0,1x com gentamicina (1 mL / L). Incubar os embriões a 15 ° C até atingirem a fase de 42-45 (hpf 82-100).
    3. Alterar o MBS 0,1X solução contendo gentamicina diariamente, e remover embriões mortos imediatamente para evitar a contaminação ou a morte de outros embriões. Anote o número de embriões mortos em caderno de laboratório.
  4. Fixação de embriões em paraformaldeído (PFA):
    1. Fix embriões entre os estágios 42 e 45 (82 e 100hpf, respectivamente), transferindo-os para um novo 24 bem placa de cultura contendo 1-2 ml de MBS 0,1X. Rotular a tampa com a mesma informação que o tratamento set-up descrito acima (seção 2.2.1).
    2. Remover o máximo MBS 0,1X de cada bem quanto possível, ao mesmo tempo deixando embriões abrangidos e garantir o mínimo de contato para evitar lesões. Adicionar 1-2 ml de solução de 0,05% de benzocaína em MBS 0,1x e incubar os embriões até já não são sensíveis a estímulos.
    3. Adicionar 1-2 ml de 4% PFA. Alternativamente, coloque embriões em tubos de microcentrífuga marcados para fixação, se preferir.
    4. Incubar embriões em PFA durante 24 horas a 4 ° C num agitador rotativo. Remover PFA realizando 3-4 lavagens com PBT longo de um período de 3-5 horas.

3. Fotografar Região Orofacial de Xenopus girinos

  1. Preparação pré-fotografia (isto é ilustrado na Figura 3):
    1. Coloque embriões fixas em uma grande placa de Petri (150mm de diâmetro) contendo cerca de 100 ml de PBT.
    2. Faça duas incisões para cortar a cabeça do corpo (Figura 3A, sólidas linhas pretas). Em primeiro lugar, segurar o embrião com um par de pinças e fazer uma incisão no lado posterior do intestino com um bisturi estéril (Figura 3B). Fazer uma segunda incisão no lado anterior do intestino, perto do coração, para remover completamente a cabeça (Figura 3C).
    3. Pipeta cortou cabeças de embriões em um prato forrado de argila (parte 1.2.2) usando um padrão, descartável pipeta de transferência.
      1. Para vistas frontais, use dois pares de fórceps para posicionar as cabeças de embriões lado posterior para baixo dentro das depressões circulares. Usando a pinça para manipular, tanto na cabeça do embrião e a argila circundante, embriões de posição de tal modo que eles estão voltados para a câmara e não são inclinadas para trás ou para os lados (Figura 3D). Com cuidado, empurre o barro circundante ao redor da cabeça usando uma pinça e / ou o vidroferramenta pipeta para proteger a cabeça no lugar.
      2. Para vistas laterais, use uma pinça para posicionar as cabeças de embriões dentro das depressões circulares de tal forma que eles estão do seu lado, de frente para a mesma direção, e são planas contra o barro. Manipular a cabeça do embrião e a argila circundante de modo a que as glândulas de cimento de todos os embriões estão posicionados para baixo no mesmo ângulo (Figura 3E). Use as linhas desenhadas com a agulha provocação como um guia para garantir a precisão quando se toma medidas laterais.
  2. A captura de imagens da cabeça de girino:
    1. Fotografe o chefe do girino usando qualquer microscópio de dissecação com uma câmera digital ligado e o software da câmera correspondente. Utilizar a maior ampliação que pode ser mantido constante para todos os embriões.
    2. Centralize embriões e enfrentá-los todos na mesma direção. Capturar imagens usando as melhores condições de iluminação que permitem a imagem mais precisa da região orofacial. Posiçãoluzes para evitar sombras excessivas. Salve as imagens como arquivos .tiff com a maior resolução possível.

4. Medição e Análise Facial Tamanho Dimensões em Xenopus girinos

  1. Medir dimensões orofaciais (resumidos na Figura 4):
    1. Determinar a largura da face. Identificar os pontos em que a parte ventral de cada olho de reunir as periferias da face (Figura 4A, setas), e medir a distância entre estes pontos (Figura 4A, linha vermelha).
    2. Determine a altura da face. Primeiro, determinar a linha média, medindo a distância entre cada olho e cálculo da metade da prova. Em seguida, desenhe linhas horizontais que marcam os dorsais maioria das bordas dos olhos eo ponto mais dorsal da glândula de cimento (Figura 4B, linhas brancas). Na linha média, medir a distância entre as linhas horizontais (Figura 4B, linha vermelha).
    3. Determine tele orofacial. Use as mesmas linhas horizontais que marcam as bordas dorsal dos olhos e da glândula de cimento para orientar medidas de área (Figura 4C, linhas brancas). Iniciar no ponto onde a marcação a parte superior da glândula cimento linha horizontal encontra na periferia do lado esquerdo da face (Figura 4ca).
      1. Seguir ao longo da orla da face englobando o olho até ao ponto em que a marcação de topo dos olhos linha horizontal encontra a periferia da face (Figura 4BC). Continue a traçar ao longo desta dorsal linha mais horizontal até o ponto onde se encontra com a periferia do lado direito da face (Figura 4cc).
      2. Seguir a baixo ao longo da orla da face englobando o olho até ao ponto em que a marcação de topo da glândula cimento ventral linha horizontal mais satisfaz a periferia do lado direito da face (Figura 4CD). Continue a traçar ao longo desta linha unt horizontal inferioril se encontra com o ponto em que o rastreamento começou. Use software de edição de fotos para calcular a área dentro do traçado.
    4. Determine o comprimento do focinho. Nas imagens laterais, faça uma linha vertical que marca o anterior do olho. Em seguida, medir a distância horizontal a partir do ponto mais anterior, onde o cara encontra a borda dorsal da glândula de cimento para a marcação do segmento anterior do olho (Figura 4D) linha vertical.
    5. Determinar a largura da boca. Medir a distância horizontal entre os pontos esquerdo e direito, onde os superiores e inferiores "lábios" da boca abrindo meet (Figura 4E). Estes poderiam ser considerados o sapo equivalente das comissuras labiais.
    6. Determine o arredondamento boca. Calcule boca redondeza como uma proporção inversa em que (4 × [Área]) / (π × [Eixo principal] 2 >).
      1. Use a ferramenta Lasso em uma foto-editor para traçar as bordas da abertura da boca, como mostrado na Figura 4F. Selecione Analisar na barra de ferramentas principal, e escolher Medida. Em alternativa, o cálculo circularidade partir da medição da área e do diâmetro da abertura da boca.
  2. A análise dos dados das dimensões faciais:
    1. Entrada as medições de dimensões faciais em um programa de análise de dados para comparar o grupo de tratamento com o controlo. Determinar a média de cada medida para ambos os grupos experimentais e de controle para criar gráficos de barras. Determinar o desvio padrão, a fim de criar as barras de erro. Realizar testes t de Student para comparar estatisticamente os grupos.
      NOTA: Esta informação pode ser bastante variável, devido aos ligeiramente diferentes ritmos de desenvolvimento entre os embriões.

5. Análise Quantitativa Forma Orofacial e Morfometria

  1. Marcos lugar e creaarquivo te marco de coordenadas (ilustrada na Figura 5A).
    1. Escolha Marcos essas que eles captam a forma da imagem de alvo, e pode ser repetidamente colocada no mesmo local relativo em todas as amostras a serem analisadas. Se a estrutura não existe em todas as amostras, não coloque um ponto de referência sobre essa estrutura.
      1. Aqui, colocar 24 pontos de referência para representar o terço médio da face com marcas distintivas, tais como os olhos, narinas e boca. Para manter a consistência, coloque marcos no meio do caminho entre os marcos colocados anteriormente (por exemplo, marcos boca, Figura 5AI).
    2. Capturar coordenadas marco e criar "marco coordenar arquivo". Abrir a primeira imagem de uma face girino (por exemplo, o primeiro embrião de controlo).
      1. Selecione a aba Plug-ins na barra de ferramentas principal e escolha Pointpicker no menu suspenso. Selecione a guia somar pontos e colocar marcos em locais desejados como marcos aparecerá como cruzes multicoloridas (
      2. Mova locais marco após a colocação selecionando a ferramenta Mover cruzes. Quando todos os marcos foram colocados sobre a imagem, selecione a guia Exibir resultados na barra de ferramentas principal e escolha Show (Figura 5Aii) para visualizar as coordenadas marco e copiar para um programa de planilha (Figura 5Aiii).
      3. Ao colar essas coordenadas deste primeiro embrião para um programa de planilha, deixe uma linha vazia acima dos dados. Na coluna B desta linha vazia (linha 1), tipo "LM =" com o número de pontos de referência da amostra. Aqui, digite "LM = 24", já que 24 marcos foram criados (Figura 5Aiii, caixa vermelha).
      4. Na linha abaixo do pontos de dados, tipo "ID =" com um nome de identificação da amostra. Aqui na Figura 5Aiii, digite "ID = CON1", já que este é coordenar o marco dados do primeiro embrião de controle (Figura 5Aiii, seta vermelha).
      5. NOTA: É importante que cada embrião é dado um nome único no "ID =" linha. Aqui, por exemplo, o seguinte conjunto de coordenadas marco é dado o ID de "CON2", uma vez que foi o segundo embrião no grupo de controle.
      6. Copie todo o segunda e terceira colunas em um documento de texto e salvar como um arquivo .txt.
  2. Configure o programa de software para análise de dados de morfometria (ilustrada na Figura 5B).
    1. Aqui, selecione Criar novo conjunto de dados no menu principal do programa de software de morfometria. Nomeie o arquivo e os dados constantes nas caixas apropriadas (por exemplo, "Ácido retinóico inibição" e "marcos faciais", respectivamente) na tela pop-up (Figura 5Bi). Importe o arquivo como um TPS, e select o arquivo de texto de coordenadas para criar o conjunto de dados (Figura 5Bi, seta vermelha).
    2. Alinhamento de dados e procrustes caber:
      1. Realizar um ajuste procrustes e alinhamento. Destaque o conjunto de dados na guia Árvore de Projetos, escolha Preliminares na barra de ferramentas principal, e New Fit Procusto no menu suspenso.
      2. Escolha Alinhar por Principal Axis e selecione Executar Procusto Fit na parte inferior da caixa (Figura 5Bii, seta vermelha). Volte para as preliminares menu drop-down, selecione Gerar Covariance Matrix (Figura 5Biii) e selecione Executar.
      3. Ver as correlações da matriz de covariância na guia Resultados.
    3. Crie um arquivo "classificador", atribuindo a cada amostra no conjunto de dados para a variável classificador apropriado para distinguir se ele pertence no grupo experimental e no grupo controle.
      1. Rotular duas colunas em uma planilha. Rotular o cabeçalho da primeira Column com "ID" e introduzir o mesmo do ID fornecido para cada amostra (por exemplo, CON1, RARINHIB1, e assim por diante; A Figura 5Biv). Rotular o cabeçalho da segunda coluna com "tratamento" e de entrada em cada célula o grupo de tratamento que corresponde ao exemplo listado na ID da célula adjacente.
      2. Aqui, use etiquetas "Controle e RAR INIBIDOR" como classificadores (Figura 5Biv). Copie em um arquivo de texto e salvar como um arquivo .txt. Variáveis ​​Import Classificadores para o programa de software de morfometria. Escolha do jogo por Identifier, e abra o arquivo de texto (Figura 5Bv).
  3. Criar uma análise de componentes principais (PCA) dispersão, selecionando no menu suspenso e escolher Variação Análise de Componentes Principais (Figura 6AI). Em seguida, selecione a guia Gráficos para ver três guias adicionais: muda de forma PC, autovalores e dezenas de PC (Figura 6Aii). A guia pontuações PC exibe a bivariate diretor scatterplot componente do ajuste de dados marco Procusto (Figura 6Aii).
    1. Para mudar os componentes principais são traçados, abrir o menu pop-up no espaço enredo e selecionar o eixo desejado para mudar (Figura 6Aiii, seta vermelha).
    2. Selecione a ferramenta de Pontos de Dados Color (Figura 6Aiii). Selecione classificadores importado anteriormente (Seção 5.2.2) no segundo menu pop-up que aparece para determinar a cor de cada categoria (Figura 6Aiv).
    3. Ver a quantidade de variância capturada por cada componente principal na guia Resultados (Figura 6AV). Gráfico de exportação como um arquivo .bmp.
  4. Criar uma grade transformação análise da função discriminante (DFA) no programa de software de morfometria escolhendo Análise de função discriminante na aba Comparação (Figura 6BI). No menu pop-up, certifique-se de que o conjunto de dados apropriado é selected eo tipo de dados é as coordenadas Procrustes-fit.
    1. Destaque os pares de grupos a serem comparados e executar 1.000 testes de permutação (Figura 6BII).
    2. Sob Graphics, ver o mapa do vetor das coordenadas na guia Forma Diferença (Figura 6Biii). Se a imagem é invertida, abrir o menu pop-up no espaço plano para virar o diagrama na orientação correta (Figura 6Biii).
    3. A direção dos vetores reflete a diferença forma a partir do primeiro grupo em relação ao segundo, que é exibida no menu Função discriminante antes de executar a análise (Figura 6BII). Para inverter a direção dos vetores, abrir o menu pop-up no espaço trama e mudar o sinal do fator de escala de modo que é negativo (Figura 6Biii, iv). O valor da escala é definida como um fator de dez que melhor representa as diferenças estatísticas na posição marco between os dois grupos sem distorção, e geralmente é deixado no padrão (Figura 6Biv).
    4. Também no menu pop-up, mudar o gráfico para uma grade transformação para sobrepor os vetores dentro de uma grade (Figura 6Biii, v).
    5. Especifique o número de linhas horizontais e verticais da grade no menu pop-up (Figura 6Biii, v).
    6. Exportar o gráfico como um arquivo .bmp.
    7. Ver as distâncias Procusto e Mahalinobis e p-valores sob a guia Resultados (Figura 6Bvi).
  5. As análises morfométricas adicionais que são úteis para a avaliação de mais do que um grupo de tratamento
    1. Criar uma análise de componentes grade transformação diretor. The Shape PC Muda guia exibe o mapa vetor de mudanças de forma representando variação dentro de cada grupo da amostra. Use o menu pop-up na área de plotagem para orientar a imagem corretamente e sobrepor vetores dentro de uma grade de transformação. Defina o fator de escalapara o valor no eixo dos x do gráfico de contagens de PC que corresponde ao centro estimado do grupo de controlo. Exporte a imagem como um arquivo .bmp.
    2. Criar um gráfico de dispersão CVA. Sob a guia de comparação na barra de ferramentas principal, selecione Canonical análise de variáveis, e destacar o conjunto de variáveis ​​classificador que foi importado anteriormente (ver Secção 5.2.3). Selecione 1000 iterações para testes de permutação e selecione Executar. Selecione a guia pontuação CV para ver o gráfico de dispersão CVA bivariada. Este é codificados por cores com base nos classificadores carregados. Alterar o esquema de cores, trazendo até o menu pop-up no espaço parcela (ver Secção 5.3.3). Exportar como um arquivo .bmp.
    3. Criar uma grade transformação CVA. Uma grade de transformação dos resultados CVA pode ser gerado quando se compara mais de dois grupos. Sob a guia Gráficos, escolha muda de forma CV para visualizar a grade de transformação das coordenadas de referência. Abra o menu pop-up no espaço plano para mudara direcção do vector, sobrepor os resultados para uma grelha de transformação, e especificar o número de linhas de grelha. Exportar o gráfico como um arquivo .bmp.

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Representative Results

Aqui, foi demonstrada uma análise quantitativa do tamanho e forma orofacial para comparar os embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico (RAR inibidor) a controlos não tratados. Os embriões foram tratados com uma concentração de 1 uM de inibidor químico esta fase de 24 a 30 anos (26-35 hpf), lavou-se para fora, e fixado em fase 42 (82 hpf). Eles foram, em seguida, processada e analisada como descrito no protocolo. Os resultados são dados originais, mas consistente com as observações em publicações anteriores 2,3. Embriões de controlo foram tratados com o veículo, DMSO, e desenvolvida de forma normal (Figura 7aa, ii). Os embriões tratados com uma concentração de 1 uM do inibidor de RAR mostrou ligeiro estreitamento da face, anomalias do olho, e uma abertura de boca embrionário mal formada que foi dada forma mais triangular (Figura 7Aiii, iv).

Em primeiro lugar, as dimensões tradicionais orofaciais foram medidos e estão resumidos na Figura 7B. S Serviço Estatístico significância foi determinada através da realização de um teste t de Student assumindo variância desigual entre os inibidores de embriões tratados e controlos para cada medição. Descobrimos que tanto comprimento do focinho e largura da face foram significativamente menores em inibidores de embriões tratados com RAR em relação aos controles (valores de p = 0,0062 e 0,0058, respectivamente; Figura 7Bi, ii). Enquanto altura da face e da boca redondeza foram significativamente aumentados (valores de p = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), largura da boca foi significativamente reduzida (p = 2,5175 x 10 -10; Figura 7Biii-v) .A resultados mostraram não haver diferença significativa na área orofacial global entre os dois grupos (p = 0,3754; Figura 7Bvi). Estes dados mostram que a perda da sinalização do ácido retinóico em um momento específico em resultados de desenvolvimento em um focinho mais curto, ligeiro estreitamento da região do terço médio da face, e malformação da abertura embrionária boca.

nt "> Para fornecer uma visão sofisticada das mudanças no formato da região orofacial embrionário em resposta a sinais de redução de ácido retinóico, que ao lado de morfometria geométrica utilizada análises. Após a identificação e alinhando marcos orofaciais usando software de análises morfométricas, que, em seguida, examinaram a variância dentro de cada grupo através de análise de componentes principais (PCA). Quando os dois primeiros componentes principais foram plotados contra os outros, embriões inibidor RAR tratados eram claramente distinto de controles ao longo do eixo PC1 (Figura 7C). Este teste também mostrou os outliers no set- amostra ilustrada por dois embriões tratados inibidores que não se aglomeram, com o resto do grupo (Figura 7C, setas).

Em seguida, as diferenças estatísticas para a forma da região orofacial entre inibidores de embriões tratados e controlos de RAR foram avaliados e visualizados através da realização de uma análise da função discriminante (DFA). O Procusto distância bntre os dois grupos foi significativamente diferente (distância = 0,2665, p <0,0001, Figura 7D), indicando uma mudança na forma orofacial quando a sinalização de ácido retinóico é interrompido. De fato, mudanças dramáticas na posição dos marcos laterais na região orofacial indicam um estreitamento do formato do rosto respectivo à altura em inibidores de embriões tratados (Figura 7D). Além disso, a ligeira mudança para o exterior na posição dos marcos nasais (Figura 7D, setas) revela a anormalidade na posição narina nestes embriões que é consistente com a diminuição da excrescência do focinho. As mudanças nos marcos que definem as bordas da abertura da boca mudanças de posição mostra que refletem a formação de uma boca em forma triangular abertura que é consistente com a fenda mediana relatada em nossos estudos anteriores 2,3. Além de mudanças de vetores, o padrão de deformação da grade de transformação também ilustra mudanças no formato ou noofacial região. A deformação na região da face média é consistente com a hipoplasia maxilar e estreitamento geral facial visto em embriões com sinais de ácido retinóico diminuída (Figura 7D).

Os resultados da análise da função discriminante (DFA) mostram mudanças de forma que eram consistentes com a nossa análise qualitativa, bem como revelando algumas mudanças que não foram adequadamente capturados por meio de medições tradicionais tamanho sozinho. Por exemplo, enquanto que a área orofacial não foi significativamente diferente entre os controlos e inibidor de embriões tratados (Figura 7Bvi), a grade de transformação DFA revelou alterações dramáticas na região consistentes com o estreitamento facial visto em embriões tratados com inibidores (Figura 7A, D). Além disso, os padrões de deformação e marco turnos da abertura da boca, juntamente com a mudança significativa que vimos na boca redondeza, ilustram a malformação da boca abrindo em forma inibidor tratado Embryos. Em resumo, uma combinação de medições tradicionais de dimensões faciais e análise de morfometria geométrica ilustra as alterações na forma e tamanho da região orofacial quando os sinais de ácido retinóico são interrompidos.

A Figura 1
Figura 1. materiais necessários. (A) Ferramentas para análise de dados. (I) 24 poços, (ii) padrão pipeta de transferência descartável, (iii) Dumont # 5 fórceps Inox, (iv) revestido de argila placa de Petri, (v) agulha provocação reta, (vi) ferramenta pipeta de vidro, (vii ) bisturi estéril, descartável. (B) Preparação do prato alinhado com argila. (I) Uma agulha provocação reta é usada para desenhar linhas horizontais no barro. (Ii) Uma ferramenta pipeta de vidro é usado para fazer depressões circulares ao longo de cada linha. (Iii) O prato é preenchido com PBT para imagiologia.

page = "always"> A Figura 2
Figura 2. A fertilização in vitro e cultura de ovos de Xenopus. (A) A seguir à injecção HCG, fêmeas adultos de Xenopus laevis são induzidas a pôr ovos. (B) Os ovos são recolhidos em MBS elevadas de sal, fertilizado com testículos extraídos a partir de um macho, e cultivadas utilizando métodos padrão. (C) Os embriões são transferidos para uma 24 poços contendo prato MBS 0,1x utilizando um padrão, descartável pipeta de transferência (D). Uma pipeta calibrada-homem é usado para medir a 1 ml em um poço vazio, e um marcador é utilizado para demarcar este nível no lado de fora de todos os poços contendo embriões (no detalhe). 0,1x MBS é então adicionado ou retirado para que ele esteja nivelado com esta marca.

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Figura 3. Preparação de cabeças de embrião para a imagem latente. (A) Diagrama das duas incisões necessárias para remover as cabeças, as linhas pretas cheias. Barra de escala = 400 pm. (B) A primeira incisão é feita na extremidade posterior do intestino para remover a cauda e de libertação de pressão a partir do bisturi. Barra de escala = 400 pm. (C) A segunda incisão é feita na extremidade anterior do intestino, perto do coração, para separar completamente a cabeça. Barra de escala = 400 mm. (D) vista frontal da linha de cabeças de embriões colocados em argila. Barra de escala = 650 mm. (E) vista lateral de linha de posição cabeças de embriões em argila. Scale bar = 500 mm cg: glândula de cimento.

Figura 4
Figura 4. medidas de tamanho tradicionais de dimensões orofaciais. (A) largura Face. As setas indicam os pontos em que a parte ventral do olho encontra a periferia da face. Linha vermelha é a largura da face, medida como a distância entre esses pontos. Linhas de barra de escala = 210 M. (B) Altura Face. Brancas são guias desenhadas antes da medição na margem dorsal dos olhos e da borda dorsal da glândula de cimento. A linha vermelha representa a altura da face, medida como a distância entre estas duas guias na linha média da face. Barra de escala = 210 M. (C) área Orofacial. As linhas brancas são guias desenhadas antes da medição. (A) O ponto em que a guia inferior encontra a borda ventral do olho esquerdo. Linha vermelha mostra o traçado ao redor do olho esquerdo. (B) O ponto em que o bordo dorsal do olho satisfaz o guia de topo. A linha azul indica a fronteira dorsal da área orofacial, traçada ao longo da guia de topo na extremidade dorsal dos olhos. (C) O ponto onde o guia top atende a periferia facial direita. Mostra linha verdeo traçado em torno do olho direito. (D) o ponto em que o bordo ventral do olho direito se encontra com o guia inferior. Linha amarela mostra limite ventral da área orofacial, traçou ao longo da guia inferior na borda dorsal da glândula de cimento. Barra de escala = 210 M. (D) comprimento do focinho. Linha branca é a borda anterior do olho e é desenhado como um guia antes da medição. A linha vermelha é focinho comprimento, medido a partir desta linha até ao ponto em que o bordo dorsal da glândula cimento preenche a periferia lateral da face. Barra de escala = 300 M. Largura (E) Boca. Arrows são os pontos onde a lábios dorsal e ventral se encontram. A linha vermelha representa a largura da boca, medida como a distância entre estes dois pontos. Barra de escala = 200 M. (F) Boca redondeza. O perímetro da abertura da boca é traçada e mostrada em vermelho. CG: glândula de cimento. Barra de escala = 200 M.

"Figura Figura 5. Captura de marcos e preliminares para análises de morfometria geométrica. (A) Usando o software de edição de fotos e um programa de planilha para colocar marcos e coordenadas de captura. (I) cruzes coloridos são os marcos colocados na imagem usando a ferramenta de adicionar pontos em ImageJ para representar a forma da região orofacial. (Ii) os dados Landmark é exibido usando a ferramenta Exibir resultados. (Iii) dados Landmark é copiado e colado em uma planilha. Acima da segunda coluna é um cabeçalho que identifica o número de pontos de referência e indicado por "LM = 24" (caixa vermelha). Abaixo a segunda coluna de dados, a amostra é dado um nome único e denotado por "ID = CON1" (seta vermelha). Isto é repetido para todas as imagens em um conjunto de amostras e os dados são salvos como um arquivo de texto. (B) a análise dos dados preliminares em um softw morfometria geométricasão programa. (I) O arquivo de texto criado a partir do software de edição de fotos é importado para o programa de morfometria, MorphoJ, como um arquivo de TPS. Arquivo é indicado pela seta vermelha. (Ii) Landmark dados de coordenadas está alinhado por Procusto ajuste por eixos principais. A seta vermelha indica a execução do alinhamento. (Iii) A matriz de covariância de Procusto ajuste marcos é gerado no menu Preliminares. (Iv) Um arquivo classificador é criado em uma planilha. Coluna A e B são dadas cabeçalhos "ID" e "tratamento", respectivamente. Dada a cada amostra na coleta de dados são marco de entrada da ID na coluna A, eo grupo de tratamento a que cada amostra pertence é a entrada na coluna B. (v) O arquivo classificador é importado para o programa de morfometria como um conjunto de variáveis ​​classificador e Matched por identificador para o conjunto de dados escolhido. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.

A Figura 6
Figura 6. A análise estatística em software de morfometria. (A) Análise de Componentes Principais (PCA) (i) PCA é seleccionado a partir do separador Variação. (Ii) Os dois primeiros componentes principais marcos Procusto são exibidos como um gráfico de dispersão na guia pontuações PC. (Iii) Um menu pop-up é levantada no espaço trama. Este menu é usado para mudar os componentes principais são plotados contra os outros (seta vermelha) e para colorir os pontos de dados (destacado em azul). (Iv) Os pontos de dados são coloridas de acordo com as variáveis ​​classificador no menu pop-up. (V) Porcentagem de variância capturada por cada componente principal é visto na guia Resultados. (B) Função Análise Discriminante (DFA) (i) DFA é selecionado a partir da guia de comparação. (ii) O conjunto de Procusto dados coordenadas for selecionado para DFA, e os classificadores anteriormente enviados são escolhidos para o agrupamento. Os grupos desejados a serem comparadas são escolhidos e testes de permutação são executados. (Iii) os resultados do DFA são exibidos como um mapa do vetor no guia Forma diferença. Um menu pop-up no espaço gráfico pode ser usado para orientar corretamente a imagem. (Iv) Ao selecionar a guia Set Fator de Escala no menu pop-up, o sinal do fator de escala pode ser alterada. (V) O mapa do vetor é alterada para uma grade de transformação com o número desejado de linhas de grade, escolhendo Alterar o tipo de gráfico no menu pop-up do mapa vetor. (Vi) A distâncias de Mahalanobis e Procrustes e p-valores correspondentes são vistos sob a guia Resultados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Análise Orofacial de controle e RAR inibido embriões tratados. (A) (i, ii) Imagens representativas de controlos. Barras de escala = 270 pm. (Iii, iv) Os embriões tratados com uma concentração de 1 uM do inibidor de RAR, BMS-453. Barras de escala = 260 pm. (I, iii) frontal vista. Abertura da boca é delineada em pontos vermelhos. (II, IV) vista lateral. CG:. glândula de cimento (B) dimensões orofaciais tradicionais de controle (preto) e inibidor tratado (azul) embriões. (I) comprimento do focinho, em mm (ii) largura de face, em mm (iii) altura da face, em mm (iv) a largura da boca, em mm (v) circularidade boca, um número menor de unidades determinada em ImageJ usando a equação: (4 × [Área]) / (π × [Eixo principal] 2). (Vi) área Orofacial, em mm (C) Análise de Componentes Principais. Os controles são em inibidores de embriões tratados preto e RAR estão em azul. Setas pretas indicam os outliers. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) Análise de função discriminante exibindo a distância Procusto e p-valor, para além de uma grade de transformação. Fechado final do círculo de vetor é a posição do marco em inibidor RAR embriões tratados. O final da linha do vector de referência é a posição em controlos. Setas pretas indicam mudança de marcos nasais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Xenopus laevis tornou-se uma ferramenta útil para dissecar os mecanismos de desenvolvimento de desenvolvimento orofacial subjacente; no entanto, atualmente não há protocolos que descrevem tamanho e forma as mudanças desta região em sapos. O método aqui descrito vai contribuir significativamente para o campo do desenvolvimento orofacial, permitindo a quantificação mais rigorosa dos fenótipos orofaciais em Xenopus e outros vertebrados.

O primeiro aspecto, mais crítico de executar corretamente este protocolo é a capacidade de medir dimensões faciais e determinar a colocação marco tanto de forma precisa e reprodutível. Para este fim, é fundamental que os rostos embrionárias ser fotografado no mesmo ângulo, direção e ampliação. Um cuidado especial deve ser tomado para obter medidas precisas do comprimento do focinho, uma vez que é difícil de manipular embriões lateralmente e conseguir a colocação consistente. Ter uma única pessoa realizar todas as medições sobre os sdia de AME minimiza este tipo de erro, enquanto maximiza a reprodutibilidade dos resultados. O segundo aspecto mais crítico de garantir bons resultados é a redução da variabilidade desnecessárias, tais como diferenças de desenvolvimento ou de fundo genético. Isto é especialmente importante quando se avalia a significância estatística entre os defeitos sutis. Embriões, por conseguinte, precisa de estar na mesma fase, quando tratados e fotografados. Além disso, cuidados devem ser tomados para garantir as taxas de desenvolvimento são equivalentes entre e entre os grupos de tratamento. Para diminuir esses problemas com a variabilidade, certifique-se de que todos os embriões são dos mesmos pais e são o estágio combinado no início do experimento. Também reduzir as fontes externas de variabilidade, como fontes diferentes de buffer e volumes, diferentes números de embriões, e distribuições nas placas de cultura (por exemplo, evitar a aglomeração).

Um passo fundamental na avaliação das mudanças de forma, através da morfometria geométrica é o alignment de marco coordena via Procusto ajuste. Por aplicação deste algoritmo matemático, qualquer informação sobre o tamanho ou diferenças na rotação da imagem é removida. A matriz de covariância posteriormente gerado determina as correlações não-padronizados de coordenadas de referência entre todos os embriões no conjunto de dados, em que multivariada techniques- estatística como componente principal ou função analyses- discriminante podem ser realizadas.

A análise de componentes principais (PCA) reduz uma amostra complexa de um conjunto menor de variáveis ​​chamadas componentes principais 26. O primeiro componente é responsável por mais variância dentro do conjunto de amostras, com cada componente subseqüente representando o resto. Ao traçar os dois primeiros componentes uns contra os outros software de morfometria usando amostras, que são mais semelhantes do cluster juntos. Desta forma, o PCA discrimina grupos dentro de um conjunto de amostras, ao mesmo tempo, determinar a variação dentro deles. No somE casos, os grupos não podem ser claramente distinguidos um do outro e se sobrepõem ao longo de um ou ambos os eixos. Neste caso, é vantajoso para traçar outros componentes (por exemplo, PC3), a fim de revelar as características subtis por grupos que são discriminados. Isto é especialmente relevante quando a variância total é distribuído de forma mais uniforme entre os primeiros diversas variáveis.

A análise da função discriminante (DFA) de Procusto dados ajuste determina se as amostras em um conjunto de dados são efetivamente discriminadas em grupos pelas variáveis ​​contínuas que os definem. As amostras são, portanto, classificadas em grupos anteriores à análise, e as variáveis ​​são traduzidos em componentes chamados funções discriminantes para determinar a relação estatística entre os grupos 27. Antes de executar esta análise, é importante para indicar o número de testes de permutação. Estes testes de permutação aleatória dos dados de tal forma que todas as suposições sobre sua distribuição são Eliminated. Mais iterações de teste de permutação aumentar a precisão do valor de p. Quando visualizado como uma grade de transformação, alterações significativas na posição de referência entre os grupos em comparação sejam exibidos. Além disso, o padrão de deformação da grade revela onde as mudanças ocorrem de forma. O inconveniente desta análise é que ela só pode ser utilizada para comparação de dois grupos. Se houver três ou mais grupos em um conjunto de amostras para comparação, é melhor para realizar uma análise de variáveis ​​canônicas. Isto é semelhante a um DFA na medida em que gera um p-valor estatístico; no entanto, ela mostra mudanças que ocorrem ao longo de todo o conjunto de amostra, para além das que ocorrem entre os grupos individuais dentro desse conjunto.

A principal limitação deste protocolo de quantificação orofacial é que ela só pode ser aplicado a dados bidimensionais. Nossos objetivos futuros incluem o uso de tomografia computadorizada ou microscopia confocal para desenvolver métodos semelhantes para a análise dos dados tridimensionais. Por outro lado,trabalhar com imagens bidimensionais também é um dos principais pontos fortes deste protocolo. Somente stereoscopes básicos equipados com câmeras são necessárias para capturar imagens do rosto embrionário. O OpenWare utilizado para esta análise de dados também aumenta a acessibilidade deste método, enquanto diminui o custo. Além disso, um conhecimento avançado de imagiologia sophistical, análises estatísticas, ou programação de computador não é necessária para extrair resultados significativos e significativos a partir dos dados. Na verdade, esta técnica está sendo ensinada como parte de um curso de laboratório de graduação no departamento de VCU de biologia. Assim, o protocolo de quantificação orofacial aqui apresentado é fácil de aprender e aplicar num curto período de tempo. Como uma representação de vídeo, passos críticos, como o posicionamento embriões e na navegação do software são destacados para garantir o protocolo pode ser utilizado com sucesso mesmo por estudantes e pesquisadores treinados. Em resumo, este protocolo irá fornecer um recurso valiosopara a comunidade de pesquisa e como ferramenta de ensino.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Start-up verbas para A. Dickinson de VCU apoiaram este trabalho.

Os autores gostariam de agradecer Dan Nacu por seu talento artístico na criação da ilustração esquemática.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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