Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Biology

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Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

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Abstract

Introduction

Les cellules vivantes Energy Bank métabolique dans la forme de graisses et d'hydrates de carbone et utilisent cette énergie pour la biosynthèse, transport membranaire et le mouvement. De l'énergie est obtenue dans le cytosol à travers la transformation des sucres alimentaires en ATP directement pendant la glycolyse. Cependant, la principale source de la production d'ATP dans une cellule est exploitée dans les mitochondries par la chaîne respiratoire mitochondriale 1. L'architecture des mitochondries fournit l'orientation spatiale nécessaire pour la production d'ATP et efficace. Les mitochondries possèdent une double membrane séparées par un espace intermembranaire et ensemble avec la matrice, le compartiment mitochondrial plus à l'intérieur, la maison des composants et de coordonner les réactions chimiques intervenant dans la génération d'ATP. La membrane intérieure contient une série de complexes de protéines membranaires qui constituent la chaîne respiratoire ainsi que de l'ATP synthase, le complexe protéique qui réunit ADP et Pi pour la formation d'ATP. L'aubergemembrane du RE est pliée en crêtes et des électrons sont transmis le long des complexes de la chaîne respiratoire par l'intermédiaire du cytochrome c, un porteur d'électrons soluble qui se déplace entre des complexes dans l'espace intermembranaire. Comme les électrons se déplacent, l'oxydation des équivalents réducteurs se produit et des ions hydrogène sont pompés à partir de la matrice de l'espace intermembranaire. Comme conséquence de la forte concentration d'ions dans l'espace intermembranaire, un gradient électrochimique construit résultant dans un potentiel de membrane à travers la membrane mitochondriale interne (Δψ) 2. L'oxygène est l'accepteur final d'électrons de la chaîne de transport d'électrons et des ions hydrogène se écouler à travers les ATP synthases à partir de l'espace intermembranaire revenir à la matrice, et, ce faisant directement provoquer la formation d'ATP. Ce procédé tel que décrit dans son ensemble est connu comme la phosphorylation oxydative. Les plis de la crêtes augmentent la surface de la membrane interne, ce qui permet le transport d'électrons maximale et la production d'ATP à l'intérieurchaque mitochondrie. Les protéines, des enzymes et d'autres molécules impliquées dans la phosphorylation oxydative sont dérivés de deux gènes nucléaires et mitochondriales. Les mitochondries contiennent leur propre ADN circulaire, codant pour 13 protéines, ainsi que les ARNt et les ARNm nécessaires pour la production d'ATP 3. Cependant, beaucoup plus de protéines sont nécessaires et sont donc codées dans le noyau. La plupart de ces protéines nucléaires codés sont ciblés sur la matrice mitochondriale par l'utilisation de préséquences à l'extrémité N-terminale de la protéine précurseur, et leur importation est entraînée en partie par Δψ 4,5.

Au-delà de la contribution aux bioénergétique d'une cellule, les mitochondries influencent également les principaux processus métaboliques telles que le TCA et le bêta-oxydation, la signalisation cellulaire par régulation de calcium, ainsi que d'un rôle clé dans l'apoptose 6. Plus précisément, pendant les périodes de stress cellulaire, les protéines famille Bcl-2 qui résident sur ou interagissent à la membrane externe mitochondriale peut causer mitochondrialperméabilité de la membrane externe (MOMP) 7,8. Au cours de la MOMP, le cytochrome c et d'autres protéines sont libérées dans le cytosol, et avec plusieurs protéines cytosoliques former un complexe appelé apoptosome 9,10. Le apoptosome active caspases qui vont à cliver les protéines cellulaires et de l'ADN pendant la phase d'exécution de l'apoptose. Dès que MOMP se produit, ΔΨ est effondré et la production d'ATP arrêtée. Ainsi, la fonction mitochondriale, comme l'apoptose est déclenchée est compromise et des changements dans ΔΨ peut être corrélée à la santé cellulaire mitochondriale et 12. Alors que l'apoptose est un critère d'évaluation dans de nombreux modèles de la maladie, la fonction mitochondriale et la modification de ΔΨ peut aussi fournir des informations précieuses sur l'origination et / ou progression de la maladie. Par exemple, des changements structurels et fonctionnels mitochondriaux ont été documentés au cours de maladies neurodégénératives 13,14.

Dans la première partie du protocole, isolation des mitochondries intactes qui conservent leur ΔΨ est décrite. Des cellules HEK-293T ont été exposées à différentes concentrations et combinaisons de TNF-α recombinant, IL1-β et IFN-γ pour induire l'apoptose. Ces cytokines ont été choisis parce qu'ils sont fréquemment signalés à être élevée dans les échantillons primaires septiques humaines 15 et la voie extrinsèque de l'apoptose peut être déclenchée par l'interaction de se lier à son récepteur TNF-α 6. Comme il existe des variations subtiles nécessaires pour isoler les mitochondries fonctionnelles de tissus primaires par rapport à des cellules en culture, et parce que de nombreuses recherches utilise des animaux, le protocole décrit également comment isoler les mitochondries de foie et la moelle épinière antérieure de la sclérose latérale (ALS) modèle de souris.

La seconde partie du protocole a été conçu pour contrôler des perturbations au potentiel de la membrane mitochondriale en utilisant un colorant fluorescent sensible au potentiel d'un lecteur de plaque fluorescente. Différences entre le statut cellulaire (à savoir, en bonne santé vs malsaine) se différencient par la quantification de la résistance de ΔΨ de mitochondries isolées conjointement avec des agents de découplage, des inhibiteurs de la chaîne respiratoire, des inhibiteurs et des ionophores complexes, lesquels provoquent une dissipation du potentiel de la membrane mitochondriale. La sain les mitochondries, plus le changement de ΔΨ lors d'un traitement avec des inhibiteurs mitochondriaux, par conséquent, la réponse des mitochondries peut être utilisé comme un indicateur de la fonction mitochondriale (dys).

Utilisation des mitochondries isolées plutôt que dans l'évaluation in situ de la fonction offre la preuve définitive que d'une pathologie ou de traitement module directement changements à l'organite 16-18. Bien qu'il existe des méthodes de la littérature pour isoler les mitochondries de cellules en culture, ils sont vagues 17 et / ou utilisent de l'équipement spécialisé 16. Ce protocole décrit en détail la méthode d'isolement et estfacilement adaptable à d'autres lignées cellulaires, y compris les tissus et les cultures primaires 13,14,19,20. De nombreuses études de mitochondries isolées utilisent les mêmes découpleurs et inhibiteurs mitochondriaux utilisés dans ce protocole, mais avec une électrode Clark (21 est un exemple représentatif de nombreux articles dans la littérature), qui est encore un morceau très spécifique et spécialisée de l'équipement. En outre, cette méthode traditionnelle a des limitations telles que faible débit et haute complexité 22,23 et nécessite une quantité importante de mitochondries (~ 500 ug / réaction). Dans ce protocole, la fluorescence TMRE potentiel de membrane de la sonde de détection est utilisé en conjonction avec un lecteur de plaque fluorescente, qui est une machine standard dans de nombreux laboratoires. TMRE est largement considéré car il pénètre rapidement les cellules et les mitochondries isolées et peut être utilisé à de faibles concentrations 24. Plusieurs réactions peuvent être rapidement mis en place en tandem et lots analysés en utilisant ce protocole. En outre, la réactions nécessitent une petite quantité beaucoup de mitochondries isolées (~ 10 pg / réaction). En exigeant moins de matériaux, échantillons de tissus ou de culture cellulaire plus petits peuvent être utilisés comme point de départ pour l'isolement de mitochondries, plusieurs répétitions ou réactions peuvent être mis en place, et assez matériel potentiellement pour d'autres expériences de mitochondries isolées telles que la production d'ATP, la consommation d'oxygène, ou l'importation les dosages sont possibles.

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Protocol

Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Université Wake Forest de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences.

1. Les modèles pour les enquêtes

  1. La culture cellulaire
    1. Maintenir des cellules de rein embryonnaires humaines (HEK-T293), les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur bovin foetal, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de L-glutamine, à 37 ° C dans 5% de CO2.
    2. Cultiver les cellules dans des flacons T75 et leur permettre d'atteindre 90% de confluence.
    3. Effectuer le fractionnement cellulaire par traitement à la trypsine (0,25% de trypsine-EDTA) pendant 3-5 minutes à 37 ° C dans 5% de CO 2
    4. Aspirer les médias et resuspendre le culot cellulaire dans des milieux de culture.
    5. cellules de semences dans le ballon ou la plaque appropriée 7 x 10 4 cellules dans un flacon T75 48 heures avant la cytokine traitement. Cela devrait donner ~ 70% de la densité au moment du traitement.
    6. cellules de mourir de faim de sérum 24 heures plus tard en aspirant les médias et le remplacer par le même volume de milieu sans sérum (DMEM, stérile).
    7. Préparer TNF-α, IL1-β, IFN-γ et, à partir de poudre lyophilisée avec de l'eau ultra-pure à une concentration de travail de 5 pg / ul, 10 ng / pl et 10 ng / pl, respectivement et les ajouter aux puits / flacons.
    8. Traiter de sérum de cellules privées par l'addition de cytokines solubilisés directement dans le milieu de culture cellulaire de flacons appropriés. Les traitements consistaient en des cytokines individuelles, un cocktail de tous les trois (dénommé "* 3"), ou sterile eau comme témoin (dénommé "0").
    9. Incuber les cellules traitées pendant 24, 48 ou 72 heures avant que l'évaluation et la récolte.
  2. L'évaluation de viabilité cellulaire
    1. Ajouter une solution à 5 mg / ml d'acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) dans 1 x PBS.
    2. Pour les plaques à 12 puits, ajouter 100 ul de solution de MTT à chaque puits et mélanger doucement en tournant pour assurer une distribution uniforme.
    3. Incuber les plaques pendant 15 min-1 heure à 37 ° C dans 5% de CO 2, et vérifiez sous un microscope pour la présence de coloration violette. Si aucun violet est présente, agiter à nouveau et permettent aux cellules de incuber dans des intervalles de 5 min jusqu'à ce que le violet est observé. La quantité de temps nécessaire doit être déterminé par chaque chercheur.
    4. Aide d'une pipette à répétition, ajoutez 700 pi de MTT solvant (HCl 4 mM et 0,1% de NP40 dans l'isopropanol) à chaque puits et basculer la plaque (s) à la température ambiante pendant 5 à 10 min, ou jusqu'à ce que la couleur pourpre avait laissé les cellules . Si pourprecouleur ne sort pas des cellules, ajouter un 200 pi supplémentaires de solvant et de continuer à tourbillonner.
    5. Pour l'analyse, prendre 100 pi de chaque puits et la placer dans une plaque de 96 puits et lire sur un lecteur de plaque à l'aide de 570 nm et une longueur d'onde de 630 nm de référence, cependant 595 nm est également acceptable tant que les mesures sont prises à des paramètres cohérents.
  3. modèle animal de la SLA
    1. Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Université Wake Forest de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences.
    2. Effectuer génotypage avec des amorces standards contre SOD1 mutante 25.

2. Isolement des mitochondries

NOTE: Il est important de travailler rapidement et de garder tout sur la glace tout au long de la procédure.

  1. Préparation du tampon d'isolement des mitochondries (MIB), un tampon d'isolement de la moelle épinière (SC MIB) et de tampon expérimental (EB)
    1. Préparer les solutions d'achat d'actions suivantes à l'avance pour MIB et EB.
    2. Ajouter 1 M Tris / MOPS en dissolvant 12,1 g de base Tris dans 70 ml de H 2 O. Ajouter MOPS sèches pour obtenir pH à 7,4. Réglez le volume à 100 ml final. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
    3. Faire une M Kphos en mélangeant 80,2 ml de K 2 HPO 4 et 19,8 ml de KH 2 PO 4. Entreposer à la température ambiante.
    4. Ajouter 0,2 M EGTA / Tris en ajoutant 3,8 g de l'EGTA à 10 ml de H 2 O. Ajouter 1 M Tris / MOPS jusqu'à dissolution, ~ 30-40 ml. Ajuster à 50 ml, filtre stérile et stocker à température ambiante. Notez que le pH sera de 6,7 ~.
    5. Faire une M glutamate en faisant 10 ml deSolution 1 M d'acide glutamique. Filtre stériliser et stocker 4 ° C.
    6. Faire une Malate M en faisant 10 ml d'une solution M d'acide malique. Ajouter Tris / MOPS à 50 mM. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
    7. Assurez-MIB à une concentration de saccharose 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, et 1 mM d'EGTA / Tris. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
    8. Assurez-MIB SC à une concentration de 250 mM de saccharose, 20 mM de HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM d'EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM de DTT, et cocktail inhibiteur de protease.
    9. Assurez-EB à une concentration de 125 mM de KCl, 10 mM de Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamate, malate de 2,5 mM, 1 mM de phosphate de K, pH 7,4, 10 mM d'EGTA et / Tris. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
  2. la préparation de l'équipement avant la récolte des cellules.
    1. Rincer un petit récipient en verre et l'homogénéisation pilon trois fois à l'eau stérile et placer sur la glace.
    2. Recueillir des éléments nécessaires comme une perceuse standard, SCRA cellulairepers, 1,5 ml, 15 ml et 50 ml tubes et des solutions.
  3. Les mitochondries Isolation
    1. Les cellules cultivées
      1. Pour chaque type d'échantillon, utiliser deux flacons T175 de cellules.
      2. Veiller à ce que les cellules sont ~ 90% de confluence et l'utilisation dans des expériences de contrôle, ou plaque et traiter comme décrit ci-dessus à l'étape 1.2.
      3. Sur la paillasse, les médias Aspirer et laver les cellules adhérentes deux fois avec 15 ml de PBS 1x chaque fois.
      4. Aspirer le tampon et racler flacons pour éliminer les cellules adhérentes à partir du fond du flacon.
      5. Ajouter 15 ml de PBS 1x à chaque flacon, tourbillon, et transfert à individuels tubes de 15 ml et le lieu coniques sur la glace.
      6. Une fois raclage est fait, centrifuger les tubes pendant 5 min à 700 xg, 4 ° C en utilisant une centrifugeuse dessus de table en utilisant un rotor à godet oscillant.
      7. Aspirer les surnageants de chaque pastille et remise en suspension dans 1 ml de MIB.
      8. Combiner les deux suspensions et de transférer à un petit récipient en verre pour l'homogénéisation.
      9. Ajouter MIBdans le récipient jusqu'à ce que le tampon atteint la première ligne. Homogénéiser les cellules avec le pilon attachés à une perceuse à vitesse moyenne pendant trois passes. Assurez-vous que le navire est sur la glace lors de cette étape, ne pas enlever le pilon au-dessus du liquide et d'utiliser une vitesse constante avec des passes continues.
      10. Transférer la solution homogénéisée dans un tube conique de 50 ml.
      11. Aspirer la solution dans une seringue de 3 ml en utilisant un 1 ½ aiguille de calibre 18 pouces et l'expulser dans le tube conique sur glace avec une aiguille de calibre 27 ½ pouces. Veiller à expulser la solution contre la paroi interne du tube à utiliser que la force de rupture de la membrane cellulaire.
      12. Répéter les étapes de seringue pour un total de cinq fois.
      13. Transférer la solution dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 5 minutes à 600 xg, 4 ° C dans une centrifugeuse de dessus de table au moyen d'un rotor à godet oscillant.
      14. Retirez délicatement le surnageant et répartir entre trois tubes de 1,5 ml.
        REMARQUE: Mitochondria sont dans le surnageant après cette première rotation à basse vitesse, tandis que les membranes cellulaires et les cellules non rompues sont rassemblées en un culot.
      15. Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
      16. surnageants de Aspirer et combinent les pastilles dans 100 ul MIB et placent immédiatement sur la glace.
        NOTE: Les mitochondries sont dans le culot après cette spin-haute vitesse. Les mitochondries sera généralement de maintenir leur potentiel de membrane pour ~ 2-3 ions glace après isolement et sont plus stable comme une solution de réserve concentrée dans MIB.
    2. isolement de mitochondries à partir de tissu de souris
      1. Anesthésier la souris selon le protocole IACUC. Définir un vaporisateur à 5,0% pour induire une anesthésie. A confirmé que l'animal est anesthésié par un manque de réflexe pincée de pied ou réflexe clignotent lorsque l'œil est approché ou tapoté avec un coton-tige. Garder la souris sous anesthésie à toute la procédure chirurgicale en le mettant à l'évaporateur entre 1,5% et 2,0%.
      2. Excise le foie et la moelle épinière de chaque animal et le lieu séparément dans le froid de la glace 1x PBS - / - pour rincer toute trace de sang.
      3. Pour le foie, le tissu transférer à un plat peser sur la glace et les couper en petits morceaux à l'aide d'une lame de rasoir frais pendant 1 min.
      4. Ajouter tissus et tampon approprié (MIB pour le foie ou SC MIB pour la moelle épinière) à la cuve jusqu'à ce tampon atteint la première ligne. Homogénéiser le tissu avec le pilon à la main pendant cinq passes. Assurez-vous que le navire est sur la glace lors de cette étape, ne pas enlever le pilon au-dessus du liquide et d'utiliser une vitesse constante avec des passes continues.
      5. Transférez les homogénats pour nettoyer tubes de 15 ml.
      6. Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 750 xg, 4 ° C pendant 10 min.
      7. Enregistrer les surnageants dans des tubes propres et placer sur la glace.
        REMARQUE: Les mitochondries sont dans le surnageant après cette première rotation à basse vitesse, tandis que les membranes cellulaires et les cellules non rompues sont rassemblées en un culot.
      8. Remettre en suspension les pastilles de la moelle épinière in 500 pi de SC MIB.
      9. Re-homogénéiser chacun trois fois, seulement à mi-chemin le remplissage avec de la cuve SC MIB cette fois.
      10. Transférer le nouveau homogénat dans un tube frais.
      11. Centrifuger le rotor dans un angle fixe à 750 xg, 4 ° C pendant 10 min.
      12. Moissonneuse ces nouveaux surnageants, qui contiennent plus de mitochondries, le premier surnageant de chaque échantillon.
      13. Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
      14. surnageants de Aspirer et remettre en suspension les boulettes de foie dans 500 pi de MIB et les pellets de la moelle épinière dans 50 ul SC MIB et placer immédiatement sur la glace.
        NOTE: Les mitochondries sont dans le culot après cette spin-haute vitesse. Les mitochondries sera généralement de maintenir leur potentiel de membrane pour ~ 2-3 ions glace après isolement et sont plus stable comme une solution de réserve concentrée dans MIB.
      15. Effectuer un dosage de la concentration de protéine pour estimer la concentration de la solution dans les mitochondries. Suivre les instructionss à l'aide d'un kit commercial Protein Assay ou méthode similaire 26. Les concentrations typiques de mitochondries sont les suivants: 2 flacons T175 rendements ~ 2 mg / ml, une foie de souris ~ 3-5 mg / ml, et une moelle épinière de souris ~ 1-3 mg / ml.
  4. c dosage de Cytochrome utilisant une R & D Rat / Souris Cytochrome c Quantikine ELISA Kit (adapté du protocole fourni par le fabricant).
    1. Immédiatement avant la mise en place des réactions, diluer mitochondries à 0,5 mg / ml concentration travailler avec EB et distribuer mitochondries dilués dans 1,5 ml tubes pour les réactions (généralement de 30 à 50 pi de mitochondries par tube).
    2. Ajouter soit EB ou le DMSO, à 1% du volume total, les mitochondries dilué et incuber les réactions sur la paillasse pour 7-10 min. Ces réactions sont stables pendant jusqu'à 30 minutes à la température ambiante si une période de temps plus longue est nécessaire.
    3. Pellet mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min et soigneuxLy séparer le surnageant et placer chacun dans un séparées tubes de 1,5 ml.
      REMARQUE: Tubes peut soit être congelé à -20 ° C pour une analyse ultérieure ou utilisé immédiatement.
    4. Déterminer la libération de cytochrome c par une comparaison de la concentration de cytochrome c dans le culot et le surnageant 27.
      1. Préparer les échantillons en solubilisant les pastilles dans le volume initial de la réaction avec 0,5% de TX-100 dans du PBS 1x.
      2. Pour chaque échantillon, préparer deux puits de la plaque ELISA, une pour le culot solubilisé et maintenant une pour le surnageant du mélange réactionnel par addition de 100 ul de conjugué de cytochrome c (utiliser directement de la bouteille) plus 100 ul de 0,5% Tx- 100 dans PBS 1x, et puis tout de la pastille ou le surnageant échantillon.
      3. Vortex doucement la plaque un réglage bas (niveau 2-4) pendant 20 secondes pour mélanger, couvrir et laisser incuber pendant 1 heure, 37 ° C.
      4. Ensuite, laver la plaque quatre fois avec le tampon de lavage dilué selon le fabriles instructions er. Retirer tout excès de solution en appuyant sur les puits sur une serviette en papier.
      5. Ensuite, ajouter 150 ul de 1: 1 A + B solution de développement dans chaque puits et incuber la plaque pendant 20 à 30 min à l'obscurité à température ambiante.
      6. Enfin, ajouter 50 ul de solution d'arrêt à chaque puits et prendre des lectures d'absorbance à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Calculer la quantité de libération du cytochrome c en comparant la quantité de cytochrome c dans le culot par rapport surnageant pour chaque réaction.

3. Évaluation de la fonction mitochondriale (Dys)

  1. Immédiatement avant les réactions sont mises en place, diluer mitochondries à 0,5 mg / ml concentration de travail avec EB et placés dans des tubes de 1,5 ml pour les réactions (typiquement de 30 à 50 ul de mitochondries sont utilisés par tube).
  2. Traitements mitochondriales
    1. Ajouter des traitements appropriés (contrôle EB, 1 uM FCCP mélangé avec 50 nM valinomycine, 10 uM roténone, 5 uM oligomycine, 2 mM de KCN, ou 200 uM d'ADP, des concentrations finales) pour séparer les réactions à 1/10 du volume total des mitochondries dilué. Incuber les réactions sur la paillasse pendant 7 min.
      NOTE: Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de ces substances que l'ingestion accidentelle ou absorption par la peau pourrait être nocif.
    2. Diluer TMRE, reconstitué dans de l'eau stérile à une concentration de travail de 100 um et stocké à -20 ° C, à 2 uM et ajouter un volume égal au volume de réaction mitochondrial.
    3. Incuber les réactions sur la paillasse pendant 7 min.
    4. Pellet mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
    5. la moitié de la charge du volume de surnageant de chaque échantillon sur une plaque 396 puits et lire fluorescence.
      NOTE: excitation et d'émission de longueurs d'onde TMRE doivent être optimisés selon les instructions du fabricant en utilisant le volume et la plaque qui sera utilisé pourle dosage. Utilisation d'une plaque de 384 puits standard noir avec 25 ul de 1 uM TMRE (concentration finale de réaction), le signal le plus fort a été obtenu en utilisant des longueurs d'onde d'excitation / émission   485 nm / 535 nm.
    6. Calculer la différence de pliage entre la fluorescence commande (EB) et chaque traitement en divisant la valeur de fluorescence relative (RFU) obtenu à partir du lecteur de plaques pour l'échantillon expérimental par la RFU de l'échantillon de contrôle.

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Representative Results

Le traitement des cellules HEK-293T avec 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, et 75 ng / ml d'IFN-γ (* 3) pour 24 à 48 heures conduit à des quantités progressives de la mort cellulaire (Figure 1A ). La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant des dosages MTT et démontre qu'il existe toujours ~ diminution de 10% de la viabilité cellulaire à un traitement de 24 heures et environ 20% de diminution de traitement 48 h. Les cellules traitées avec des concentrations similaires (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, et 75 ng / ml d'IFN-γ) produire des résultats de la mort cellulaire similaires à 48 h, et le traitement avec des cytokines individuelles révèle que la diminution viabilité est due à combinatoire affecte (figure 1B). Les données de viabilité de la figure 1B représentent la moyenne +/- écart-type de trois expériences séparées de chacun d'exécution en triple exemplaire, et le serrage des barres d'erreur montrent la reproductibilité des données. La quantité de cytokines peut être ajustée dans ce protocole de traitement à plus elucidate la contribution de chaque cytokine sur la mort cellulaire, et des cytokines supplémentaires ou d'autres facteurs pourraient également être inclus, aussi longtemps que les contrôles appropriés sont exécutées.

Isolement des mitochondries à partir de cellules et de tissus a été décrite dans la littérature depuis les années 1940, 28,29. La prémisse de la procédure est la rupture des cellules suivie par centrifugation différentielle, où mitochondries bruts sont connus pour sédimenter à ~ 10 000 x g. De nombreux protocoles qui utilisent mitochondries isolées nécessitent doubles membranes intactes qui peuvent maintenir leur potentiel de membrane, et il est donc nécessaire d'évaluer l'intégrité fois l'isolement est terminée. Au cours de l'élaboration du protocole d'isolement de mitochondries à partir de cellules HEK culture, un dosage du cytochrome C a été utilisé pour indiquer si les mitochondries intactes ont été obtenus. Utilisation cytochrome c disponible dans le commerce des kits ELISA, les mitochondries ont été quantifiées après isolement et dilués dans EB, puis soit EB ou le DMSOajoutés et les réactions à incuber sur la paillasse. Ensuite, en séparant les mitochondries à partir de surnageant environnante, l'analyse du contenu du cytochrome c des deux fractions a été utilisée comme gabarit pour mitochondrial intact de la membrane; si la majorité du cytochrome c est retenu dans le culot mitochondrial ensuite les mitochondries sont considérées comme intactes, alors que si plus de 15% du cytochrome c se trouve dans le surnageant, puis les mitochondries ont été considérés comme inappropriés pour des études fonctionnelles. Comme on le voit dans le tableau 1, le protocole décrit rendement ~ 12% libération du cytochrome c et ~ 15% lorsque mitochondries isolées sont pré-traitées avec du DMSO. Des résultats similaires ont été rapportés antérieurement pour des mitochondries isolées à partir d'autres lignées cellulaires ou de tissus d'origine animale 19,20,27. En variante, l'intégrité mitochondriale peut également être évaluée avec TMRE, qui a été utilisé lors de l'isolement de foie de souris et les mitochondries de la moelle épinière. Lors de la première developme de protocole d'isolementnt, essais évalués mitochondries isolées de foie et la moelle épinière de santé, les mitochondries de souris normales. Pour chaque échantillon, ΔΨ a été évaluée en comparant le signal de fluorescence à partir de mitochondries isolées traités par EB à celles incubées avec FCCP + valinomycine (tableau 2). Un ratio de fluorescence entre les mitochondries traitées et non traitées de> 1 a été utilisé comme une indication de mitochondries intactes, en bonne santé.

Une fois les protocoles d'isolement de mitochondries réussies ont été développées, les mitochondries isolées de contrôle, des cellules non traitées et * 3 cytokine cellules traitées ou des souris normales et SOD1 ont été analysés. mitochondries HEK des deux groupes ont été traités avec divers découpleurs et inhibiteurs et ΔΨ mesurées par les changements à TMRE absorption. La différence fois dans le contrôle EB traité mitochondries découplant / inhibiteur mitochondries traitées indique une différence dans la force de ΔΨ entre les deux groupes (données représentatives et Calcal- dans le tableau 3). En outre, le pour cent de diminution de cellules non traitées au * 3 cellules traitées signifient que la santé mitochondrial a été affectée par les traitements de cytokines, corroborant les données de viabilité cellulaire (Figure 2). Evaluation de l'absorption par la force ΔΨ TMRE utilisant des mitochondries isolées de foie et la moelle épinière des quatre souris individuelles normale, de contrôle par rapport aux quatre souris SLA indiquent que la santé des tissus peut également être évaluée en utilisant ce protocole. Comme illustré par les différences de pliage et pourcentage de diminution dans ΔΨ, la comparaison des EB-traitement et FCCP + valinomycine-traitement des mitochondries des animaux témoins et des maladies progressé sont significativement différentes (tableau 4; voir aussi référence 13 & 14).

Figure 1
Figure 1: La mort cellulaire induitd * 3 par traitement est progressive dans le temps et une plus grande qu'avec les traitements de cytokines individuelles. (A) cellules HEK-293T ont été traités pendant 24 ou 48 heures et la mort cellulaire a été mesurée en utilisant un test MTT. Les valeurs ont été normalisées à un contrôle, les échantillons non traités et les données représentent des mesures effectuées en triple pour n = 3, +/- l'écart type. (B) des cellules HEK-293T ont été traitées avec des cytokines individuelles ou un cocktail (* 3) pendant 48 heures et la mort cellulaire évaluée par test MTT. Les données représentent n = 5 pour chaque individu de cytokine et pour n = 6 * 3, +/- l'écart type.

Pellet (UA) Surnageant (UA) % Libération du cytochrome c
0 0,818 0,115 12,6 ± 2,27
DMSO 0,793 0,142 15,3 ±; 2,23

Tableau 1:. Rétention de cytochrome c des mitochondries isolées à partir de cellules en culture Les données représentent la moyenne de n = 4, +/- l'écart type.

foie 1 foie 2 la moelle épinière 1 la moelle épinière 2
RFU EB 97830 94132 339716 290154
F / V 435188 461299 385366 482480
rapport 4,45 4,9 1,13 1.66
EB = tampon expérimental et F / V = ​​FCCP + valinomycine.

Tableau 2:. Mesure de ΔΨ de mitochondries isolées à partir de tissus de souris normales Deux animaux séparés ont été utilisés pour isoler le foie et la moelle épinière des mitochondries en tandem (par exemple le foie et la moelle épinière 1 1 sont du même animal).

EB oligo pourrir KCN ADP F / V
RFU 0 4844 12507 12734 9925 10892 4844
* 3 6517 13639 12435 10235 13154 6517
Différence Fold 0 N / A 2,58 2,63 2,05 2,25 2,65
* 3 N / A 2,09 1,91 1,57 2.02 2,18
% De baisse 0 vs. 3 * 18,94 27,41 23,35 10,24 17,67
EB = tampon expérimentale; oligo = oligomycine; pourrir = roténone; KCN = cyanure de potassium, et F / V = ​​FCCP + valinomycine.

Tableau 3: Les données brutes et les calculs de cellule culture isolé expériences de mitochondries.

Figure 2
Figure 2: mitochondries isolées à partir de cellules de cytokine traités ont diminué potentiel de membrane. Pour cent de diminution de ΔΨ pour 0 vs * 3 pour chaque traitement par rapport au témoin, tel que calculé dans le tableau 2. Les données représentent des moyennes de réactions en double pour n = 3 (oligomycine, la roténone et FCCP / valinomycine) ou n = 2 ( KCN et ADP) +/- écart-type. * = P-valeurs statistiquement significatives basées sur des calculs de différence de pliage; p = 0,03, 0,01 et 0,05 pour oligomycine, la roténone et FCCP / valinomycine, respectivement.

Moelle épinière Foie
Replier Différence Contrôle 1,54 ± 0,48 3,20 ± 1,56
SOD1 1,10 ± 0,30 3,12 ± 1,75
% De baisse 28,1 2,48
p-valeur 0,03 0,41

Tableau 4: mitochondries isolées de la moelle épinière des souris SOD1 ont diminué potentiel de membrane tel qu'évalué par FCCP + valinomycine données représentent la moyenne des quatre animaux par groupe..

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Discussion

Le traitement des cellules HEK-293T avec les cytokines recombinantes provoque des quantités modérées de la mort cellulaire de plus de 48 h (Figure 1). La quantité de la mort cellulaire induite par TNF-alpha traitement est similaire aux études précédemment rapportées 30 et la viabilité cellulaire diminue après co-administration de multiples cytokines qui sont supérieures à des quantités sommatives avec toute cytokine seule est également conforme à la littérature 31,32. La capacité d'ajuster les quantités et les types de traitements de cytokines ainsi que la comparaison des cocktails à cytokines individuelles font de ce modèle de culture cellulaire attrayante pour étudier les effets spécifiques de l'exposition de cytokines sur les cellules rénales. En outre, les résultats sont très reproductible et facile à réaliser (figure 2). Considérations à garder à l'esprit comprennent la confluence des cellules. Par exemple, les cellules traitées à 100% de confluence ne répondent ainsi aux mêmes concentrations de cytokines lorsqu'ils sont traités à 70-80% confluence. En outre, le nombre de passages des cellules ont été soumis doit être suivi, comme réponse des cellules pourrait être influencée avoir été en culture pendant trop longtemps (plus de 8 à 12 semaines après la décongélation). Bien que le traitement de cellules en culture avec des cytokines diminution de la viabilité cellulaire et de la santé par la suite mitochondrial, il est loin d'être un modèle de septicémie en soi. Cependant, l'utilisation d'un modèle plus cliniquement pertinente, comme utilisant des cellules primaires de rein isolées de souris et / ou le traitement avec des cytokines naturellement sécrétée par les cellules stimulées THP1 33, est un prolongement naturel de ce travail. Compte tenu de l'écart dans la compréhension de l'insuffisance rénale au cours de la septicémie, de tels modèles de culture de cellules et l'évaluation des mitochondries pourrait donner un aperçu des mécanismes initial ainsi qu'une plate-forme préliminaire pour tester l'efficacité de composés pharmaceutiques comme des traitements préventifs ou d'intervention.

Mitochondries isolées à partir de cellules en culture ou des tissus animauxpermettre la capacité d'évaluer rapidement l'impact des traitements cellulaires ou progression de la maladie sur la santé des mitochondries. Les protocoles d'isolement et d'évaluation ne sont pas exigeants techniquement à réaliser, et pourraient être facilement modifiés pour l'usage avec d'autres lignées de cellules ou de tissus primaires. Le MIB et EB utilisé pour chaque type d'échantillon sont bonnes recettes de départ qui peut être ajustée si nécessaire si une cellule ou un tissu type particulier a des exigences différentes. Par exemple, l'addition de BSA acide gras libre est généralement nécessaire pour une utilisation avec des neurones, comme inclus dans le protocole de la moelle épinière 15,34. Le procédé de rupture des cellules peut également être modifiée en utilisant plus de expulsions de seringues ou de modifier à la main homogénéisation au lieu d'utiliser une perceuse ou vice versa. En outre, ré-homogénéisation du premier culot de centrifugation, comme cela se fait dans le mode opératoire de la moelle épinière de mitochondries, peut être nécessaire pour obtenir une quantité satisfaisante de mitochondries. Un bon indicateur qu'un protocole d'isolement produit mitochondri viablesun est l'utilisation de la cytochrome c ELISA. Ce test est une alternative rapide et facile à analyse par transfert Western du cytochrome c communiqué et est également une évaluation utile de libération du cytochrome c après le traitement des mitochondries avec des peptides ou d'autres composés 19,27. En variante, TMRE peut être utilisé pendant le développement de protocoles, mais il est important d'évaluer les mitochondries isolées à partir d'un échantillon qui est connu pour être en bonne santé. En outre, lors de l'isolation mitochondries à partir de tissus de souris qui ne sont pas décrits régulièrement dans la littérature, les mitochondries hépatiques peuvent servir de contrôle positif ainsi que utilisé pour définir une base de référence. Par exemple, comme dans ce protocole, les foies de tous les animaux, à la fois au cours du développement de protocole ainsi que des expériences ont également été excisés et utilisés pour l'isolement de mitochondries. Une autre considération pour une préparation est la quantité de mitochondries obtenues à l'issue de la procédure d'isolement. Si la concentration des mitochondries est de 1 mg / ml ou moins,Les résultats d'analyse peuvent se avérer peu fiables (observations non publiées VDGM). Soit la quantité de matière de départ, MIB recette ou la méthode de la perturbation doit être optimisée avant de passer à des essais fonctionnels. Une fois un protocole d'isolement réussi est atteint, les mitochondries peuvent également être utilisés dans d'autres essais tels que la teneur totale et la production d'ATP ATP 13,14.

Le protocole de fonctionnement des mitochondries décrit ici permet de mesure indirecte de l'absorption mitochondriale de la TMRE potentiel de détection de colorant utilisant un lecteur de plaque fluorescente standard. Après mitochondries ont été isolés et les produits chimiques appropriés ajoutés, ils sont incubés avec TMRE et ensuite rassemblées en un culot. En traitant des cellules ou des animaux entiers et isoler les mitochondries avant ΔΨ évaluation des variables de confusion tels que le transport multi-résistante ou ATP flux sont évités. La quantité de fluorescence dans le surnageant est ensuite analysé, étant entendu que la plus saine les mitochondriesplus leur ΔΨ et donc plus l'absorption de TMRE. En conséquence, la quantité de fluorescence dans le surnageant doit être inférieure dans les mitochondries saines et plus dans les mitochondries malsaines. En incluant une EB-seul traitement, la différence de pliage de fluorescence entre cette commande et couplés mitochondries peut être calculée. Un autre contrôle importante avec chaque ensemble de réactions de fonctionner est TMRE seul. Le résultat de ce contrôle fournit une possible lecture maximale fluorescent. Depuis le TMRE ajouté à des réactions est fraîchement diluée, il existe une variabilité inhérente. Par exemple, TMRE-seules les lectures de ~ 20 000, 25 000 et 30 000 ont été atteints à divers moments au cours du développement de protocole. Si la seule TMRE signal est beaucoup plus grande que ne importe lequel des échantillons de mitochondries traitées et / ou si les mitochondries traitées sont pas significativement différente de l'absence de traitement, puis l'isolement des mitochondries couplé était probablement pas réussi. La diminution de la ΔΨ telle que mesurée par un rapport obtenuen suivant ce protocole est similaire à montants déclarés antérieurement pour le contrôle, les cellules saines 2,35. La comparaison des changements ΔΨ de mitochondries isolées de contrôle, des cellules HEK-293T non traitées et des cellules 3 * de cytokine traités démontré que la diminution de la viabilité cellulaire observée dans des essais MTT se traduit par une diminution de la fonction des mitochondries. Ce test de lecteur de plaque pourrait facilement être utilisé avec mitochondries isolées de toute source et utilisés pour examiner des modèles de maladies comme la SLA, comme démontré ici 13,14.

Plusieurs études ont utilisé des colorants fluorescents spécifiques pour détecter MOMP mitochondries, qui était important dans la genèse de ce test de lecteur de plaque. Cependant, ces études utilisent soit des cellules entières pour dépister des composés qui bloquent ou inciter MOMP 35,36, explorer de nouveaux ΔΨ détection colorants 2 ou identifier d'autres formats tels que la cytométrie de flux sur une puce 37. Ce protocole est unique en ce sens qu'il décrit annonceetailed méthode pour isoler et utiliser les mitochondries pour enquêter rapidement les effets du traitement de cellules entières grâce à une réponse à des composés qui modifient ΔΨ connus. Ce protocole utilise une variété de découpleurs et inhibiteurs, et indique que l'un d'eux serait appropriée pour évaluer la santé des mitochondries. Ainsi, alors que ce particulier centres d'investigation sur les modifications mitochondriales à cause du stress cellulaire ou d'un dysfonctionnement cellulaire progressif, le protocole pourraient également être utilisés pour explorer les changements dans le métabolisme mitochondrial par l'utilisation de composés spécifiques et / ou l'addition de sources d'électrons tels que le succinate et le NADH .

Considérations importantes lors de l'exécution de l'évaluation des mitochondries isolées comprennent la cohérence des volumes de traitement, en gardant le mitochondries dans MIB et les diluer dans EB immédiatement avant les traitements vont être mis en place, et en utilisant les mitochondries à moins de 3 h de l'isolement pour assurer leur ΔΨ est encore étant maintenue. Lechoix de TMRE par rapport aux autres colorants fluorescents spécifiques à mitochondries tels que JC-1 est due à la possibilité d'utiliser de faibles concentrations et de la simplicité d'analyse de fluorescence en utilisant une seule longueur d'onde. Cette méthode peut être effectuée de manière similaire en utilisant la microscopie à fluorescence ou cytométrie de flux 2,38 37 cependant l'utilisation d'un lecteur de plaque prend moins de temps et nécessite moins de 35 optimisation. En outre, ce protocole est beaucoup moins exigeante techniquement, plus rapide à effectuer, et plus facilement reproductible par rapport à l'aide d'une électrode de Clark 22 (Del Gaizo Moore, observations non publiées). Titrant quantités de chaque traitement mitochondrial peut fournir d'autres renseignements sur la fonction mitochondriale et l'optimisation des concentrations doit être effectuée. Le volume total des réactions mitochondriales peut être ajusté à la suite de la quantité de l'échantillon obtenu lors de l'isolement ainsi que le nombre de réactions nécessaires de traitement. Si possible, un montant forfaitaire de 50 μ; L est utilisée; Toutefois, aussi peu que 20 ul de mitochondries produit des résultats fiables.

Alors que ΔΨ en corrélation avec la consommation d'oxygène, le test présenté ne mesure pas directement la consommation d'oxygène. Bien fluorescente sonde de détection de l'oxygène tels que MitoExpress ont été développés, sans doute pour éviter certains des chutes de l'aide d'un Clark Electrode précité, le prix par réaction et l'exigence de plus grandes quantités de mitochondries par dosage restent limitant. Par conséquent, l'utilisation de TMRE et découpleurs de ΔΨ classiques ou des inhibiteurs présente plusieurs avantages. Encore une fois, l'analyse des lots de plusieurs échantillons ou des traitements multiples / échantillon, reproductibilité, faible exigence de la matière de départ et / ou plus faible quantité de mitochondries isolées nécessaire par réaction rendre ce protocole attrayant.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

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