Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital
Medicine

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Robin, J. D., Wright, W. E., Zou, Y., Cossette, S. A., Lawlor, M. W., Gussoni, E. Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (95), e52307, doi:10.3791/52307 (2015).

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Abstract

Protocol

NOTA: I protocolli per la raccolta di tessuti umani devono essere esaminati e approvati dal comitato istituzionale IRB. Raccolta di scartati, tessuti umani de-identificato è stato approvato dal Children Hospital di Boston e Brigham and Women Hospital IRB Comitati. I metodi descritti di seguito sono stati applicati per l'isolamento di cellule miogeniche da de-identificati, scartato il tessuto. I metodi descritti sono applicabili ai tessuti raccolti da materiale paziente acconsentito.

Isolamento 1. Cella

  1. La dissociazione della biopsia muscolare e purificazione di cellule miogeniche
    1. Pre-pesare un tessuto piastra di coltura 10 centimetri in una cappa coltura tissutale biosicurezza, e poi ri-pesare il piatto contenente la biopsia muscolare per calcolare la quantità di tessuto da dissociato.
    2. Utilizzando bisturi sterili, il tessuto muscolare tritare finemente e aggiungere qualche goccia di sterile 1x HBSS per evitare che il tessuto si secchi.
    3. Aggiungere 3,5 ml ciascuno di dispase II e collagenasi D per grammo di tessuto muscolare per essere digerito. Pipettare il tessuto macinata e soluzione enzimatica attraverso una sterile 25 ml pipetta un paio di volte. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO 2 per 15 min e digerire il tessuto fino slurry passa facilmente se un sterile 5 ml pipetta.
      NOTA: tessuto dissociazione avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 min. Si prega di fare riferimento alla sezione "Risultati Rappresentante 'per ulteriori dettagli.
    4. Aggiungere 2 volumi di mezzo di crescita sterili per tessuti dissociato, filtrare attraverso un filtro 100 micron cellule sopra a 50 ml tubolare e pellet coniche per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm), a temperatura ambiente. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media.
    5. Risospendere il pellet in 1 volume di mezzo di crescita sterili ed aggiungere 7 volumi soluzione di lisi dei globuli rossi. Filtrare la soluzione attraverso un colino cella 40 micron, quindi pellet tlui cellule per 10 min a 329 xg, temperatura ambiente.
    6. Contare le cellule in un emocitometro e risospendere le cellule in 1x HBSS 0,5% BSA ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / 100 microlitri. Mettere da parte ~ 250.000 cellule in un unico tubo che verranno utilizzati come controllo negativo (senza macchia). Impostare tubi da parte ulteriori monocolore macchiati di controllo per ioduro di propidio e per CD56, che sono necessari per il corretto gating di cellule positive CD56 da FACS ordinamento. Fare riferimento alla cella manuali smistamento o consultare FACS ordinamento esperti core facility per garantire controlli adeguati sono inclusi.
    7. Macchiare le cellule da ordinare con 5μl / 10 6 cellule di anticorpo anti CD56. Incubare tutti i campioni (compresi i controlli) su ghiaccio per 30 min.
    8. Lavare i campioni a 10 ml 1x HBSS e cellule pellet per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm) in una centrifuga refrigerata a 4 ° C di temperatura.
    9. Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 ug / ml per il campione ad essere sorted per l'esclusione di cellule morte. Purificare miogenici CD56 cellule positive dalle cellule non-miogeniche utilizzando la fluorescenza attivato cell sorter.
  2. La dissociazione della biopsia cutanea
    NOTA: Dermal fibroblasti possono essere isolati da un pugno di pelle da pazienti quando biopsie muscolari non sono disponibili. Fibroblasti dermici possono essere utilizzati come biomateriale per vari studi, tra trasduzione con MyoD per generare cellule miogeniche. Inoltre, fibroblasti dermici possono essere utilizzati per generare cellule iPS, che possono essere differenziati in vari tipi di cellule per ulteriori studi.
    1. Trasportare la biopsia cutanea al laboratorio di mezzo di trasporto. Una volta ricevuto il campione, effettuare la coltura primaria appena possibile. Se la cultura primaria non è possibile stabilire il giorno stesso, conservare il campione a temperatura ambiente per una notte.
    2. Trasferire la biopsia cutanea di una piastra da 35 mm di Petri sterile nella cappa a flusso laminare.
    3. Sciacquare la biopsia cutanea in una capsula di Petri con sterili 1x PBS per rimuovere il sangue e detriti. Rimuovere il tessuto adiposo con un bisturi sterile.
    4. Aggiungere la soluzione di collagenasi 2 ml e tritare il tessuto con un bisturi, incubare a 37 ° C per 45 minuti a 1 ora, a seconda delle dimensioni del tessuto.
    5. Trasferire il tessuto digerito in una provetta conica da 15 ml, lavare la capsula di Petri con 2 ml di mezzo di coltura di fibroblasti due volte, e raccogliere il fluido nel tubo stesso.
    6. Agglomerare cellule a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    7. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 3 ml di terreno di fibroblasti per rimuovere la collagenasi, poi di nuovo cellule pellet. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media.
    8. Ripetere il passaggio 1.2.7 ancora una volta.
    9. Risospendere il pellet in cellule medie fibroblasti e la piastra 5 ml su un pallone di coltura di tessuto T25 sterile. Incubare la beuta a 37 ° C con 5% di CO 2.
    10. Valutare la cultura per il fissaggio dei fibroblasti e la crescita nei prossimi 1-3 giorni. <br /> Nota: alcuni piccoli pezzi di tessuto può anche allegare al piatto e fibroblasti migrare di questi pezzi di tessuto.
    11. Mantenere la cultura nelle stesse condizioni fino fibroblasti sono coltivate a circa l'80% di confluenza.
    12. Raccogliere fibroblasti da tripsinizzazione e trasferire su palloni di coltura fresco per l'espansione ulteriore. Eseguire tripsinizzazione lavando culture 3 volte in 1x PBS libera di Ca ++ e Mg ++. Aggiungere tripsina-EDTA (vedi Materiali Table) alle cellule (2 ml / pallone T25) per 2 minuti a 37 ° C.
    13. Split cellule staccate in fiaschi supplementari. Se alcuni pezzi di tessuto rimangono attaccati ai fiaschi T25 originali, aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco per questo pallone e più fibroblasti migreranno fuori continuamente.
      NOTA: La cultura fibroblasti espansa può essere congelato giù come P1 e conservato in azoto liquido per esperimenti futuri.

2. Immortalizzazione di cellule miogeniche

  1. Cellule di alimentazione 30 min prima di trasfezione con 5 ml di mezzi freschi integrato con 10 mM di caffeina.
  2. Omogeneizzare una miscela di 2 mg di DNA plasmidico da una preparazione midi (CDK4 o hTERT plasmide) e Polyjet ed incubare a temperatura ambiente per 15 min, come raccomandato dal produttore.
  3. Aggiungere il composto plasmide / Polyjet alle cellule PE durante la notte.
  4. Cellule feed con mezzo fresco (DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, supplementato con siero di vitello al 10%). Dodici ore dopo, raccogliere il surnatante contenente il virus e filtrare attraverso un filtro a 0,45 micron dimensione dei pori.
  5. Usare 1 ml di surnatante raccolto di infettare tutta la notte la linea di cellule PA317 confezionamento amphotropic 5 e ottenere una linea di virus producono stabile cella dopo la selezione o con 0,5 mg / ml neomicina (G418) per CDK4 o 0,5 mg / ml igromicina per hTERT.
  6. Preparare lavoro surnatanti virali coltivando le cellule di packaging stabili nei pressi di confluenza, poi raccogliendo il surnatante ogni mattina, sera e la mattina, per tre raccolti.
  7. Filtrare il surnatante virale e utilizzare direttamente o dividerli in aliquote di 1 ml e conservare a -80 ° C per un uso successivo. Si noti che il surnatante virale perde il 50% di efficienza infezione tra gelo e disgelo. Ricordarsi di candeggina-wash, prima di eliminare tutto ciò che ha toccato le particelle virali.
    NOTA: La linea cellulare PA317 virus-produzione stabile può essere congelato e mantenuta a -150 ° C per la memorizzazione permanente (congelamento medio è del 10% DMSO; 90% siero).
  8. Cellule miogeniche Piastra FACS-purificato (descritto nei passaggi 1,1-1,9) ad una densità di 5 x 10 4 cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina. Assicurarsi che le cellule sono attaccati alla piastra prima di procedere con l'infezione virale.
  9. Aggiungere 400 microlitri filtrato, freshly prodotto surnatante virale o aliquote congelate di ogni piatto sei bene durante la notte (mantenere 2 pozzi come controlli).
  10. Cambiare medio alimentando cellule con 2,5 ml / pozzetto di mezzi freschi muscolare (4: 1 di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e Medium 199 supplementato con siero fetale bovino 15%; 0,02 M tampone HEPES, 1,4 mg / L di vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L desametasone, 2.5 mg / l il fattore di crescita degli epatociti e / L fibroblasti fattore di crescita di base 10 mg). Eliminare i media e pipette contenenti le particelle virali in un contenitore di candeggina. Lasciare cellule nello stesso mezzo per 3 giorni per recuperare da infezione, poi trattare per la selezione utilizzando 400 mg / ml di neomicina (infezione CDK4) o 300 mg / ml igromicina (infezione hTERT).
  11. Mantenere le cellule sotto selezione di droga fino a quando le cellule della matrice piatto di controllo (1-2 settimane).
  12. Passaggio cellule prima che diventino confluenti (60-80% di confluenza, utilizzando 0,05% tripsina EDTA), anche durante la selectisul periodo. Cellule replate 10 centimetri in più piatti con media mioblasti fresca (come descritto in 2.11) integrati con il farmaco di selezione. Mantenere celle selezionate immortalizzate come popolazione eterogenea clonare o per ottenere un background genetico completamente omogenea (stessa inserimento del transgene in ogni cellula).
  13. Eseguire la selezione clonale utilizzando le seguenti operazioni:
    1. Seme le cellule a bassa densità (ad esempio da 300 a 500 cellule in 10 piatti cm) e mantenere per circa due settimane, fino a quando si formano piccole colonie (10-20 cellule).
    2. Rimuovere la maggior parte del mezzo, a questo punto, lasciando solo una sottile pellicola per impedire le cellule si secchi.
    3. Posizionare un anello di clonazione (con una estremità immersa in grasso per vuoto silicone) su ogni clone desiderato e aggiungere qualche goccia di tripsina / EDTA.
    4. Celle di raccolta una volta che diventano arrotondati aspirando attentamente le cellule con una punta 1 ml o una pipetta Pasteur e trasferirli al più piccolo disponibile pla pozzettite (96 o 48, 24 o 12 pozzetti).
    5. Espandere cloni come necessario per evitare confluenza locale.

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Representative Results

Figura 1 illustra alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella dissociazione tessuti primaria: l'esatta quantità di tessuto è pesato in un piatto di coltura di tessuti petri sterile (Figura 1A, B). Il tessuto viene quindi macinato finemente usando bisturi sterile, fino ad ottenere uno slurry di tessuto (Figura 1C, D). Dopo l'aggiunta di enzimi digestivi, il muscolo principale dissociazione del tessuto avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 min. La progressione della digestione tessuto viene tipicamente controllato ogni 15-20 minuti per evitare overdigestion e morte cellulare. La digestione enzimatica può essere delicatamente pipettato e mixato un paio di volte ogni 15-20 minuti. Al termine della fase di digestione, le cellule vengono filtrati attraverso un 100 micron (Figura 1E, F) e quindi un filtro 40 micron. A seconda della quantità di tessuto di base muscolare e se il campione viene ottenuto da moderatamente o gravemente muscolo colpito, il cel primaria dissociatols saranno eterogenea. Figura 1G mostra un esempio di cellule mononucleate in sospensione immediatamente dopo la digestione, mentre la Figura 1H mostra un esempio di pile dissociate 3-6 ore dopo la digestione e placcatura in piastre di coltura tissutale. Cellule miogeniche solito essere mescolati con fibroblasti e cellule adipogenico. Le cellule immunitarie possono anche essere presenti nei casi in cui l'infiammazione è associata con la malattia del paziente. Pertanto, prospettico separazione dei diversi tipi di cellule potrebbe essere auspicabile. Per potenziale isolamento di cellule miogeniche umane, CD56 o N-CAM è stato ampiamente utilizzato come marcatore affidabile 6-9. Questa purificazione potrebbe essere utile, poco dopo l'isolamento per l'arricchimento di progenitori miogenici e prima del processo di immortalizzazione cellulare. In alternativa, immortalizzazione di cellule primarie può essere eseguita in un primo, allora cellule miogeniche immortalizzate possono essere selezionati in base alla espressione di CD56 mediante FACS. A su schematicai passaggi necessari prima FACS ordinamento e un esempio di un profilo FACS è illustrata in figura 2. In breve, cellule primarie vengono contate e risospese ad alta concentrazione come indicato, viene aggiunto l'anticorpo primario (cioè contro CD56) alle cellule ed incubato per 30 minuti in ghiaccio. Dopo un lavaggio, le cellule vengono analizzate attraverso un cell sorter fluorescenza-attivato e purificati (Figura 2) .Il resa approssimativa di cellule CD56 positive varia da campione a campione, dal 40-70% delle cellule mononucleate totali. La resa varia a seconda dell'età della persona e se le cellule miogeniche sono estratte dal muscolo inalterati o malato. Muscolo Inalterato solito ha un'alta percentuale di cellule miogeniche, mentre muscolo distrofico spesso ha percentuali più basse di cellule CD56 positive. Le cellule purificate sono placcati in completo mezzo di crescita miogenico (vedi Materiali tabella). Le cellule possono essere diversi passaggi da tripsinizzazione quando REACh 60-70% di confluenza. Cellule CD56 esprimono sono miogenico e capaci di formare miotubi in vitro 10,11 .Il immortalizzazione di cellule miogeniche richiede la trasfezione sequenziale di due geni 12,13 (come schematizzato in figura 3). Ciclina dipendente chinasi 4 (CDK4) è utilizzato per superare lo stress di coltura di tessuti a causa di condizioni di coltura inadeguate, e telomerasi umana trascrittasi inversa (hTERT) impedisce l'accorciamento dei telomeri a causa del fenomeno di replica fine 12. Entrambi i plasmidi pre-virali sono nel vettore backbone pBAbe. Il costrutto del mouse CDK4 cDNA contenente il gene di resistenza alla neomicina e hTERT cDNA costrutto contenente il gene di resistenza all'igromicina. Quest'ultimo contiene anche una Herpes Simplex Virus timidina chinasi (TK) cassetta e siti loxP posto in entrambe le estremità della cassetta hTERT / TK. Ciò consente escissione dell'intera unità espressione dalla ricombinasi Cre 14 e contro-selezione con ganciclovir.

Recentemente cellule immortalizzate possono essere mantenuti come una popolazione in cui i virus sono integrati in diversi siti, o clonati, per ottenere uno sfondo completamente omogenica genetica (singolo inserimento nel genoma cellulare e la sua progenie). Nella maggior parte dei casi, isolare cloni da una popolazione principale sarà provoca lievi differenze tra cloni seconda l'inserimento della cassetta nel genoma della cellula. Inoltre, la vasta coltura di tessuti favorirà la selezione di cellule con vantaggio di crescita, piuttosto che quelli che differenziano. Iosolation di singoli cloni è fatto semplicemente seminando le cellule a bassa densità (ad esempio: da 300 a 500 cellule in 10 piatti cm) e coltivando per circa due settimane fino a piccole colonie si formano (10-20 cellule). La maggior parte del mezzo viene poi rimossa, lasciando solo un sottile velo per evitare che le cellule si secchi. I cloni sono tripsinizzate con anelli di clonazione e poi ampliato in base alle esigenze. Cloni immortalati espanso possono essere testati per l'espressione di marcatori di cellule miogeniche comuni, come CD56 da FACS, desmina ed espressione MyoD mediante immunofluorescenza, o myotube formazione sulla differenziazione. Miotubi sono più evidenti quando le cellule miogeniche confluenti (90% di confluenza) sono posti in terreno di differenziamento (DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, supplementato con siero di cavallo 2%) dopo 3-5 giorni (Figura 4). Non sono state osservate differenze in myotube formazione e nella capacità di contrazione myotube tra le cellule di controllo non-immortalizzate e delle cellule immortali (Video 1 e 2).

(Figura 5). Esempi di curve di crescita sono mostrati in figura 5A, dove è stato osservato l'accorciamento dei telomeri, come le cellule sono state ampliate per numero maggiore di passaggi. Al contrario, immortalizzazione successo è associata ad un aumento dell'attività della telomerasi (Figura 5)

Figura 1
Figura 1:.. Illustrazioni di passi critici per la dissociazione del tessuto muscolare umana primaria (A) pesatura della piastra di coltura vuoto, prima del posizionamento del tessuto e (B) seguenti posizionamento del tessuto (C) bisturi sterili vengono usati per sminuzzare la tessuti, fino (D) il tessuto chesé viene ridotta a una poltiglia. Collagenasi e dispasi vengono aggiunti e tessuti è digerito per 45-90 min, poi la digestione viene filtrato attraverso un filtro a rete di nylon di scartare i detriti (E, F). (G, H) esempi di cellule appena dissociate placcato immediatamente dopo dissociazione (G ) o 3 ore dopo la dissociazione, quando le cellule primarie iniziano a stabilirsi (H).

Figura 2
Figura 2:. Workflow di procedure necessarie per la colorazione dei mioblasti umani prima di purificazione attraverso la fluorescenza attivato cell sorter sono evidenziati i passaggi critici per la colorazione delle cellule umane prima analisi FACS. Sono indicate anche Esempi di trame FACS. Il controllo negativo (pannello di sinistra) viene utilizzato per stabilire il cancello smistamento. Nei pannelli di destra, le cellule che esprimono CD56 positivi sono gated e la Percentage di cellule positive è mostrato. Questa strategia può essere usata per purificare cellule miogeniche sia prima immortalizzazione o seguendo la procedura immortalizzazione.

Figura 3
Figura 3: Schema di produzione di virus per mioblasti immortalizzazione. Workflow della produzione retrovirus utilizzato per immortalare mioblasti. Un costrutto plasmide contenente sia CDK4 o floxed cassette hTERT-TK in un backbone pBabe (a sinistra) è transfettato nel ecotropic Phoenix (PE) linea cellulare di confezionamento notte (8-12 ore) con Polyjet. Il supernatante viene quindi trasferito dopo filtrazione sulla linea cellulare di confezionamento amphotropic Phoenix (PA317). Il supernatante da tali cellule può essere usata direttamente o le cellule possono essere selezionati sia con neomicina o igromicina per generare una linea cellulare stabile per uso futuro. Aliquote della filtEred supernatante può essere conservato a -80 ° C per un uso successivo (con una perdita di efficacia del 50%). Candeggina è utilizzato per pulire ogni consumabile utilizzato in tutti i punti della procedura.

Figura 4
Figura 4:. Schema di reversibile mioblasti immortalizzazione Workflow della procedura immortalizzazione (in alto): le cellule primarie vengono prima trasfettate con CDK4. Dopo la selezione neomicina, i mioblasti vengono transfettate con una cassetta hTERT floxed contenente due marcatori di selezione; HSV-TK e Hygromycin. Se desiderato in un secondo momento, la cassetta può essere hTERT "floxed" fuori esprimendo Cre ricombinasi e selezionando per escissione con ganciclovir. In questo modo il "ri-mortalization" dei mioblasti e la ri-apertura di accorciamento dei telomeri. Se i telomeri sono lunghe 20 kb, questo permette ancora centinaia di raddoppi, ed evita t egli complicazione della sovra-espressione di hTERT. Infine, cloni isogeni dalla popolazione immortalato possono essere isolati. La myogenicity delle celle di nuova immortalati può essere indicata mediante marcatori specifici delle cellule muscolari, come desmina (riquadro in basso a sinistra, le cellule in mezzo di crescita colorati con anti-desmina, clone D33, verde). Questo clone è così miogenico che le cellule differenziate sono visti anche se le cellule sono mantenute in condizioni di proliferazione. Quando le cellule sono differenziate in terreno di differenziamento (con siero di cavallo 2%, medio e pannelli di destra) myotube formazione diventa molto vasta. Quasi tutte le cellule colorate con l'anticorpo MF20 per embrionale catena miosina pesante (verde) e miotubi hanno molteplici nuclei di colorazione DAPI (blu, tutte le immagini). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Verifica della procedura immortalizzazione. (A) le curve di crescita dei cloni isogenico da mioblasti primari, popolazione immortale (mioblasti hTERT-CDK4) e clone re-mortalized (Myoblast floxed hTERT-CDK4) sono indicati come esempi. Nessuna differenza nei tassi di crescita erano rilevabili prima che le cellule raggiungano senescenza. Accorciamento dei telomeri è stato monitorato in funzione di raddoppi di popolazione e la lunghezza dei telomeri è stata misurata dalla FR. (B) mioblasti TRF mostrato sono esempi di punti di tempo precoce e la replica in ritardo nei mioblasti (5 punti di tempo dal PD 13-75), ri-mortalized dopo hTERT escissione (3 punti di tempo dal PD 62-152) e mioblasti immortalati (PD 75 e 200). (C) infezione hTERT successo si traduce in un aumento di attività della telomerasi. L'attività della telomerasi è stata valutata mediante ddTRAP (ddTRAP lettura, a destra, la quantificazione del saggio, a sinistra) 15 in cellule prima e dopo HTEInfezione RT. hTERT escissione abolito l'attività della telomerasi alla soglia originale visto in mioblasti. I risultati sono mostrati come prodotti telomerasi totali generati per equivalente cella (con correzione del fondo). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Clicca qui per vedere il video.
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Video 1 e 2. miotubi sono stati generati da cellule prima e dopo il processo di immortalizzazione. Le cellule sono state coltivate a confluenza in terreni di crescita e differenziazione commutati ai media per 10 giorni. In entrambi i video, contrazioni funzionali di uno o più miotubi sono rilevabili. Registrazione del spasmi spontaneaè stato fatto con un obiettivo 20X. Non sono state osservate differenze tra le cellule immortali e non immortalizzate.

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Discussion

Le cellule come una risorsa utile

L'isolamento e la cultura delle popolazioni di cellule miogeniche è estremamente utile quando si stabilisce fenotipi di malattia o in modelli in vitro di malattia. La procedura di isolamento delle cellule miogeniche qui descritto consente l'isolamento di mioblasti e fibroblasti da campioni del muscolo scheletrico, che possono poi essere propagate, differenziati, o immediatamente analizzati. La struttura e la funzione dei mioblasti possono essere valutate attraverso l'esame microscopico, la valutazione della sopravvivenza cellulare, la valutazione di fusione cellulare o mediante studi molecolari di RNA o espressione della proteina. Inoltre, mioblasti possono essere differenziati in miotubi che condividono molte caratteristiche di miofibre immaturi, che permette la valutazione diretta della funzione mioblasti nel contesto dello sviluppo muscolare e il recupero dopo danno tissutale. Mentre tutti questi fenotipi tendono ad essere abbastanza riproducibile in primi passaggi di cellule miogeniche, il comportamento di molti m primarialinee cellulari yogenic possono essere modificati nel corso di molti passaggi. Come risultato, è talvolta desiderabile per immortalare una determinata linea cellulare miogenico (come descritto qui), che può facilitare la facilità di stabilimento cultura e la generazione dei risultati riproducibili su un periodo di tempo più lungo.

Selezione di specifiche popolazioni cellulari

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule miogeniche da tessuto muscolare scheletrico mediante FACS come schema di purificazione. La strategia proposta di cellule selezione include l'utilizzo di ioduro di propidio (un indicatore di cellule morte) e CD56 (marker di cellule miogeniche) a differenziare, cellule miogeniche dal vivo da cellule morte, detriti, e le cellule non-miogeniche. Le cellule contenute nella popolazione CD56 positive progenitori miogenici comprenderanno capaci di miotubi formano, mentre la popolazione CD56-negative comprenderà cellule non miogeniche inclusi i fibroblasti e cellule eventualmente adipogenico. Ciascuna di queste frazioni possonoessere indipendente coltivate per la produzione di colture cellulari di mioblasti o fibroblasti, e la possibilità di creare colture di cellule di fibroblasti in parallelo può essere utile per gli esercizi di cellule o bancario DNA indipendenti o condizioni di controllo supplementari per saggi di essere eseguite su colture cellulari miogeniche. Ci sono diverse altre opzioni per la selezione di specifiche colture cellulari myoblastic e fibroblastiche da tessuto muscolare digerito, nei casi in cui FACS ordinamento è indesiderabile o non disponibile, che sono descritte altrove 16,17. Un metodo alternativo per separare le cellule fibroblastiche myoblastic e prevede l'utilizzo di proprietà di adesione differenziali tra questi due tipi di cellule per arricchire successivi passaggi di cellule per un dato tipo di cellula. Come fibroblasti aderiscono alla plastica molto più facilmente rispetto mioblasti, consentendo le sospensioni cellulari ad incubare in plastica per circa 1 ora nello stabilire o passaging cellule e poi il surnatante placcatura su un piatto diverso sarà Result nella rimozione di molti fibroblasti dalla sospensione cellulare 18.

Utility di fibroblasti vs. mioblasti

Biopsie muscolari di pazienti sono tipicamente utilizzati per la purificazione di cellule muscolari primarie, tuttavia mioblasti malate non possono proliferare efficace e possono subire solo pochi numero di divisioni in vitro, richiedendo così immortalizzazione cellulare per raggiungere l'elevato numero di divisioni necessarie. Dato che entrambi i fibroblasti e mioblasti possono essere isolati da biopsie muscolari, entrambe frazioni cellulari devono essere salvati da campioni di pazienti, in quanto entrambi possono essere utili e offrire molto versatile per le applicazioni a valle. Ad esempio, fibroblasti possono essere utilizzati per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che contengono molto promettente per generare numeri cellulari illimitate e il potenziale di essere indotta a differenziarsi in molteplici linee cellulari. Queste caratteristiche sono altamente desiderabili per cellule ottenute da pazientes con malattie rare, che possono potenzialmente essere corretti in vitro o utilizzati in screening di farmaci sperimentali alla ricerca di composti terapeutici. Mioblasti immortalizzate possono anche essere utilizzati in screening farmacologico. I fibroblasti possono anche essere efficacemente convertiti verso un destino miogenico da infezione con un virus che esprime MyoD 19-21. Questo metodo è stato efficacemente testato utilizzando fibroblasti estratti da pazienti con malattie muscolari e confermato che fibroblasti-MyoD espressione possono effettivamente formare miotubi che esprimono proteine ​​muscolari mature. Così, entrambi i tipi di cellule possono essere utilizzati efficacemente in varie applicazioni a valle e forniscono materiale prezioso per studi diagnostici e terapeutici.

Impatto della Immortalizzazione

L'immortalizzazione di cellule diploidi normali permette di preparare una linea cellulare umana stabile che può essere completamente caratterizzato e studiato da molti laboratori differenti. Colture primarie da indipendenteisolamenti possono variare e la loro capacità complessiva proliferativa può essere variabile quando il danno è introdotto nel processo di dissociazione o overdigestion, che può alterare il comportamento cultura. L'immortalizzazione di celle utilizzando l'espressione della subunità catalitica della telomerasi (hTERT) ha il vantaggio di mantenere un fenotipo cellulare stabile e cellule rimangono diploide. Ci sono state segnalazioni di topi che telomerasi può modulare la via di Wnt 22. Non abbiamo osservato questo fenomeno in cellule umane. Tuttavia, per evitare tale potenziale complicazione, la cassetta hTERT è fiancheggiata da siti lox, in modo che possa essere rimosso dopo telomeri sono stati allungati. Telomeri lunghi conferiscono centinaia di divisioni in più, di solito sufficienti per svolgere la maggior parte delle sperimentazioni.

Poiché l'espansione cellulare continua fornisce sempre un vantaggio selettivo per una crescita rapida, il fenotipo cellulare può occasionalmente diventare polarizzato causa la crescita eccessiva dei più rapida divisionecellule, piuttosto che i migliori cellule differenziazione. Anche se questo non è ancora rivelato un problema significativo con il metodo descritto, può essere risolto scongelamento cellule che sono state congelate all'inizio della loro storia coltura o mediante selezione clonale delle cellule che espongono il fenotipo desiderato.

Infine, mentre l'espansione di cellule miogeniche per un numero illimitato vicino presenta vantaggi per screening di farmaci e possibili modelli di malattia, le tecniche attuali hanno anche svantaggi intrinseci che impediscono l'uso di queste cellule come veicoli terapeutici in terapia cellulare, o strumenti diagnostici primari. Sia la vasta coltura in vitro e immortalizzazione passi modificare il fenotipo delle cellule muscolari rispetto al loro stato nativo. È importante sottolineare che queste cellule sono espansi in un ambiente che è molto diversa dall'ambiente naturale delle cellule satelliti principale ai loro nicchia. Pertanto, le cellule immortalizzate richiedono test di sicurezza intenso e forse svipment di nuove tecniche per poter essere reintrodotti nel muscolo del paziente umano.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood Baker Company, Inc. Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model  Beckman Coulter Model Allegra 6R If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope Nikon Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source Forma Scientific  Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Becton Dickinson Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II Roche Applied Science #04942078001 Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D  Roche Applied Science #088882001 Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free GIBCO Life Technologies #14185-052
Bovine serum albumin, fraction V Sigma #05470 Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum GIBCO Life Technologies 11965-092 Contains L- glutamine
RBC lysis solution Qiagen 158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml Sigma P4170 Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry Biolegend 318310 APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE Cell Biolabs RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174 Cell Biolabs RV-102
Pig skin gelatin Sigma G1890-500g Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet  Signagen SL100688
G418 Fisher 345812
Hygromycin EMD Biosciences 400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT not commercially available Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit Qiagen 12143
Medium 199 Life Technologies  Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies  DMEM (11965-092) Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)  #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).  Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining Developmental Hybridoma Bank MF20 Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining Thermo Scientific MS-376-S0 Clone D33
Horse serum Invitrogen 26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies 11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin Fetal bovine serum: Thermo Scientific SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized Worthington 4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free Lonza 17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes GeneMate/Bioexpress C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels Aspen Surgical 372610
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes Bellco glass 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) BD Falcon 353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) BD Falcon 352340 (40µm); 352360 (100µm)
 Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters Millipore SLHV013SL
Cloning rings Corning #3166-8 To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines 
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes Greiner bio-one 628160
Sterile scalpels DeRoyal D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks Techno Plastic Product, TPP 90026 sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

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