Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection

Developmental Biology

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Summary

Questo protocollo descrive come produrre funzionale del seno tessuto nodale da cellule murine staminali pluripotenti (PSC). T-box3 (TBX3) sovraespressione più cardiaca miosina pesante catena (MYH6) selezione antibiotica promoter porta a aggregati altamente puri di cellule pacemaker. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") contengono più di 80% di cellule pacemaker, mostrano fortemente aumentato i tassi di battere e sono in grado di camminare miocardio ex vivo.

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Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

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Abstract

Trattamento della "sindrome del seno malato" si basa su pacemaker artificiali. Questi portano pericoli come guasto della batteria e le infezioni. Inoltre, mancano di ormone reattività e la procedura generale è costosa. "Pacemaker biologico" generati dal PSC possono diventare un'alternativa, ma il contenuto tipico di cellule pacemaker a corpi embrionali (EBS) è estremamente bassa. Il protocollo descritto combina "programmazione in avanti" del PSC murini tramite il nodo del seno induttore TBX3 con la selezione antibiotica a base MYH6-promotore. Questo produce aggregati cardiomiociti coerenti di> 80% cellule pacemaker fisiologicamente funzionali. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") sono spontaneamente contraenti a frequenze ancora non raggiunte (400-500 bpm) corrispondenti alle cellule nodali isolate da cuori di topo e sono in grado di camminare miocardio murine ex vivo. Utilizzando il protocollo descritto seno altamente purosingole cellule nodali possono essere generati, che può essere ad esempio utilizzato per il test della droga in vitro. Inoltre, i iSABs generati in base a questo protocollo può diventare un passo fondamentale verso l'ingegneria dei tessuti del cuore.

Introduction

Il termine "sindrome del seno malato" riassume molteplici malattie che portano al deterioramento del sistema di pacemaker cardiaco. Si compone di patologico, bradicardia sintomatica sinusale, blocco seno-atriale, arresto sinusale e la sindrome di tachicardia-bradicardia. In tal modo, una "sindrome del nodo del seno" è spesso accompagnata da malattie cardiache generali, come cardiopatia ischemica, cardiomiopatia o miocardite. Attualmente, gli approcci terapeutici sono basati sul impianto di pacemaker elettrici. Tuttavia, questo va insieme a una serie di rischi come infezioni e guasto della batteria. Nel complesso, l'incidenza di complicazioni è ancora molto elevato in pazienti che hanno impiantato un pacemaker. Inoltre, al contrario di pacemaker endogena, questi dispositivi non rispondono alla stimolazione ormonale.

Un futuro alternativa può contare sulla disponibilità di "pacemaker biologico" per la quale PSC potrebbero servirecome fonte cellulare adeguato e che sarebbe anche di grande valore per i test anti-droga in vitro. Eppure, un grave problema sta nella rarissima comparsa di cellule nodali del seno entro corpi embrionali (EBS) - questo genere non supera ~ 0.5% 1.

In precedenza, è stato dimostrato che "la programmazione in avanti" verso specifici sottotipi cardiomiociti è fattibile tramite la sovraespressione di diversi primi fattori di trascrizione cardiovascolari, come fattore 1 (MesP1) specifici-posteriore-mesoderma e NK2 trascrizione correlati, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Per dimensioni e la funzione del nodo senoatriale (SAN) normale, la T-box fattore di trascrizione TBX3 è cruciale, che ha dimostrato di avvio del programma di gene pacemaker e controllare differenziazione della SAN 4. Mentre questo migliorato l'aspetto delle cellule pacemaker funzionali, il contenuto ancora non ha superato il 40% ~ all'interno dell'intera popolazione di cellule cardiomyocytic.

Pertanto, una selezione di antibiotico passo basato ulteriore MYH6-promoter 5 è stato introdotto da noi. Questo conduce infine a aggregati cardiomiociti ancora inosservate ("indotte corpi seno-atriale," iSABs ") che presentano altamente aumento delle frequenze battendo (> 400 bpm) in vitro, per la prima volta si avvicinano a quelli di un cuore murino e paragonabile a coltivati ​​in vitro seno cellule nodali isolate da un cuore murino 6. Sotto l'amministrazione Isoprenalina anche frequenze battendo di 550 bpm vengono raggiunti. In particolare, iSABs consistono in oltre l'80% funzionali cellule nodali come evidente dalla vasta fisiologico analisi 7. Recentemente, diversi approcci per la generazione di cellule del seno nodali utilizzando riprogrammazione diretta 19, superficie marcatori 14 o trattamento farmacologico con piccole molecole 16,17 sono stati descritti. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha portato ad una tale elevata purezza delle cellule pacemaker e battendo frequenze vicine alla murino chearte come osservato in iSABs.

Inoltre, in un ex vivo modello coltivati ​​topo adulto fette ventricolari che hanno perso la loro attività battere spontanea, i iSABs sono in grado di integrare nel tessuto fetta, rimanendo così spontaneamente attivo e robusto stimolazione le fette di cuore a contrazioni 7. Un protocollo dettagliato per la generazione di questi iSABs è descritto in questo documento.

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Protocol

1. Raccomandazioni Prima di iniziare

  1. Non utilizzare PSC contaminati da micoplasma perché non differenziarsi correttamente in cellule del nodo del seno. Test per la contaminazione micoplasma prima di iniziare il protocollo. Fate questo utilizzando un kit PCR per una rapida, rilevamento altamente sensibile di micoplasmi e seguire il protocollo costruttore `.
  2. Per ogni piatto Petri (fase 2.3.4), cappotto una 10 cm 2 cellule piatto cultura con sterile 7 ml 0,1% di gelatina da acqua fredda pelle di pesce per 1 ora a 37 ° C. Togliere la gelatina e lasciare il piatto asciutto in condizioni sterili in un banco sterile.
  3. Prima di avviare il protocollo di differenziazione è necessario un doppio transfettato del mouse stabile ES clone linea cellulare contenente le seguenti caratteristiche: i) costitutiva over-espressione di TBX3 utilizzando un vettore di espressione di mammifero. Ii) La resistenza G418 gene sotto il controllo del promotore MYH6-5.
  4. Le cellule indifferenziate PSC devono essere co-coltivazioned con cellule feeder irradiate in condizioni standard, come descritto 1.

2. Differenziazione Procedura

  1. Due giorni prima di differenziazione - Togliere PSC da cellule di alimentazione.
    1. Aspirare il mezzo, lavare le cellule con 10 ml di tampone fosfato salino PBS, aggiungere 7 ml di soluzione collagenasi IV e incubare le cellule per 10 min a 37 ° C. Inserire un filtro sterile 40 micron in un tubo da 50 ml.
    2. Risciacquare attentamente le colonie PSC (evitare di rimuovere le cellule feeder) pipettando la soluzione collagenasi su e giù 5 volte.
    3. Trasferire la sospensione cellulare ad un filtro 40 micron, risciacquare il filtro tre volte con 8 ml di PBS. Girare intorno al filtro e metterlo a testa in giù in una capsula di Petri. Rimuovere le colonie di cellule PSC pipettando 10 ml di PBS al fondo del filtro.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 min a 300 x g.
    5. Rimuovere la PBS, sospendere le cellule in 1 ml Accutase e incubate a 37 ° C per 5 min.
    6. Aggiungere 10 ml di PBS, miscelare la soluzione di cellule pipettando su e giù per 5 volte e centrifugare per 5 min a 300 x g.
    7. Rimuovere la PBS, sospendere le cellule in 10 ml mezzo di coltura e di determinare il numero di cellulare.
    8. Seme 15.000 cellule / cm 2 su 75 cm 2 beuta filtro e coltivare per 2 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Dopo 2 giorni la muffola dovrebbe essere 50-70% confluenti.
  2. Giorno 0 - Avvio di Differenziazione
    1. Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 10 ml di PBS.
    2. Aspirare il PBS, aggiungere 2 ml Accutase e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Inserire un filtro sterile 40 micron in un tubo da 50 ml.
    3. Aggiungere 10 ml di PBS, trasferire la sospensione cellulare al filtro 40 micron, risciacquare il filtro mediante aggiunta di 10 ml di PBS e centrifugare il flusso passante per 5 min a 300 x g.
    4. Sospendere le cellule in 10 ml di terreno di differenziamento e determinare il numero di cellule.
    5. Diluire tegli cellula sospensione con terreno di differenziamento ad una concentrazione finale di 20.000 cellule / ml.
    6. Pipettare 20 ml di acqua e 5 ml di soluzione appesi goccia (HD) in una capsula Petri quadratica per evitare l'essiccamento-out del HDs.
      NOTA: Per ogni 24 piastra contenente iSABs così (vedi sezione 2.8.6.4/2.8.7) iniziano con 16 piastre di Petri.
    7. Pipettare fino a 50 ml di sospensione cellulare in un vassoio.
    8. Girare intorno al coperchio della capsula di Petri. Mettere 180 HDs ciascuno contenente 20 ml (400 cellule / HD) sospensione cellulare sul coperchio con una pipetta a 12 canali.
    9. Ruotare delicatamente intorno al coperchio e posizionarlo sulla piastra di Petri.
      NOTA: La velocità di rotazione attorno al coperchio è molto importante. Se il coperchio è girato troppo lento o troppo veloce, la tensione superficiale della sospensione cellulare non è sufficiente a trattenere l'attaccatura cade sul coperchio. Prima di provare a produrre HDs per la prima volta la pratica girando intorno al coperchio con 20 gocce microlitri di media.
    10. Coltivare le cellule per 2 giorni a 37 ° C, 5% CO 2 per far loro formare EBS.
      NOTA: Posizionare piatto Petri uno riempito con acqua sulla sommità di una pila di 5 piatti Petri. In caso contrario, l'HD nella capsula di Petri superiore si asciugherà.
  3. Day 2
    1. Ruotare delicatamente attorno al coperchio del piatto quadratica Petri e trasferire i EBs derivati ​​da due piastre di Petri (360 EBS) in una provetta da 50 ml.
    2. Attendere 10 minuti per consentire la EB si depositano sul fondo della provetta (Non centrifugare EBS).
    3. Aspirare il più media possibile, sospendere le EBs in 10 ml di medio di differenziazione e trasferire la sospensione di una capsula di Petri 10 cm.
  4. Giorno cultura 2-6 Suspension
    1. Coltivare EBS in sospensione per 4 giorni a 37 ° C, 5% CO 2, cambiare media dopo 2 giorni.
      NOTA: Anche se la capsula di Petri non è rivestito (al contrario di un piatto di coltura cellulare) EBS spesso attaccare alla superficie. Controllare le capsule di Petri per EBs collegati ogni giorno e, se necessario, scollegare i EBsdalla superficie delicatamente pipettando. Optional: Agitare le piastre di Petri continuamente durante il periodo di coltura in sospensione. Fate attenzione con la velocità dello shaker. EBS non dovrebbero accumularsi nel mezzo, né galleggiare al confine delle piastre di Petri.
  5. Giorno 6
    1. Trasferire i EBs da una piastra di Petri di un gelatina rivestite 10 centimetri 2 cellule piatto cultura.
  6. Day 7-12
    1. Le cellule dovrebbero iniziare a battere dopo 8-12 giorni. Controllare battendo foci di cellule giornaliera al microscopio. Le cellule iniziano a formare uno strato.
    2. Cambiare media giornaliera.
      NOTA: Dopo aver cambiato media, le cellule richiedono 3-4 ore per recuperare e per iniziare a battere di nuovo.
  7. Giorno 12-15 Selezione delle cellule nodali del seno.
    1. Tre giorni dopo che le cellule hanno iniziato battendo (intorno al giorno 12-15), aspirare il terreno e pipetta 10 ml di media differenziazione fresco contenenti 400 mg / ml G418 alle cellule.
  8. NOTA: E 'possibile che lo strato di cella è già staccato dalla superficie.
    1. Rimuovere accuratamente il mezzo senza aspirare lo strato di cellule.
    2. Aggiungere 10 ml di PBS e rimuovere con attenzione il PBS senza aspirare lo strato di cellule.
    3. Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi IV, trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
    4. Mescolare energicamente la sospensione pipettando su e giù 10 volte e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Deve avvenire Una sospensione di piccoli gruppi. Se ci sono ancora enormi parti del livello di sinistra, quindi ripetere il passaggio 2.8.4 altre due volte.
    5. Aggiungere 20 ml di PBS e centrifugare per 10 min a 300 x g.
    6. Aspirare accuratamente il PBS.
      NOTA: Se iSABs devono essere generati procedere con passo 2.8.7. Se Isab seno derivato nodali singole cellule devono essere generati andare avanti con il punto 2.9.
    7. Sospendere le cellulein 12 ml di mezzo di differenziazione contenente 400 mg / ml G418 e seminare su 6 pozzi rivestiti di gelatina 24 pozzi (2 ml / pozzetto).
  9. Generazione di singola cellula nodale.
    1. Sospendere le cellule dal punto 2.8.6 in 5 ml Accutase e incubare a 37 ° C per 5 minuti.
    2. Mescolare energicamente la sospensione pipettando su e giù 10 volte e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
    3. Aggiungere 20 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 x g.
    4. Sospendere le cellule in 12 ml di mezzo di differenziazione contenente 400 mg / ml G418 e seminare su 6 pozzi di una gelatina rivestite 24 pozzi (2 ml / pozzetto).
  10. Day 2 dopo dissociazione, aspirare il terreno e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere 1 ml di media differenziazione / bene.
  11. Day 4-8 dopo dissociazione, cambiare Medio ogni 2 ° giorno. Il giorno 10, dopo l'uso di dissociazione iSABs o ISAB seno derivati ​​nodale celle singole sono disponibili per ulteriori analisi.

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Representative Results

Il protocollo descritto consente la generazione di iSABs con una frequenza pestaggio di circa 450 bpm dal PSC (mostrati nel film) che si trova vicino alla frequenza battito del cuore del mouse. Dopo dissociazione iSABs (step 2.8.8) le osservati singole cellule mostrano la forma tipica di cellule del nodo del seno (cellule fusiformi e ragno) come mostrato in Figura 1. Queste cellule proteine ​​altamente espresso che sono noti per essere essenziali per la funzione del nodo del seno, come iperpolarizzazione attivato ciclico nucleotide-gated canale cationico 4 (HCN4), Connexin45 (CX45), Connexin30.2 (Cx30.2) e MYH6 (Figura 2A - C). Dopo il trattamento di cellule derivate ISAB con farmaci, le cellule mostrano il comportamento atteso: come nel nodo del seno, il bloccante dei canali divertente ZD7288 (Figura 3A) nonché la carbachol agonista del recettore muscarinico (Figura 3B), entrambe causano una battitura significativamente ridotta frequenza di deriv Isabcellule ED. L'agonista isoprenalina β-adrenergici porta ad una frequenza elevata battito (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1: forma cellulare del mandrino e ragno cellule tipica forma cellulare di ISAB fuso derivato (A) e spider (B) cell nodale. Scale bar 20 micron.

Figura 2
Figura 2: Espressione di marcatori del nodo del seno. (A) L'espressione di HCN4 (giallo) e CX45 (magenta), (B) Espressione di CX45 (magenta) e Cx30.2 (giallo) e (C) MYH6 (magenta) in cellule nodo sinusale. Di contrasto dei nuclei (turchese). Scale bar 20 micron.


Figura 3: Il trattamento farmacologico di iSABs rappresentativa battendo frequenza iSABs prima (controllo) e dopo il trattamento con ZD7288 (A), Carbachol (B) e isoprenalina (C). I dati rappresentano otto iSABs indipendenti e sono presentati come media ± SD. *** P <0.001

Figura 4
Figura 4: Schema del protocollo di differenziazione. Fumetto semplificata che riflette il diagramma di flusso sperimentale per la produzione di ISAB.

Film:. Battito di iSABs pestaggio di un tipico corpo sinoatrial indotto (ISAB) dopo dissociazione PleaSE Clicca qui per vedere il video.

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Discussion

La capacità di produrre staminali cellulari derivate cellule pacemaker cardiaco può consentire la ricostituzione del corretto ritmo cardiaco nel senso di "pacemaker biologici". Allo stesso modo, droga test in vitro potranno beneficiare di loro disponibilità. PSC può dare origine a qualsiasi tipo di cellula del corpo dei mammiferi tra cui cardiomiociti con proprietà delle cellule pacemaker 8,9,10,11,12,13. Tuttavia, in genere le popolazioni di cellule all'interno di "corpi embrionali" sono molto eterogenee, che porta inevitabilmente alla necessità di strategie di selezione e di isolamento affidabile - questo vale in particolare per il tipo di cellula molto rara di cellule nodali cardiache. Numerosi approcci basati sulla superficie esogeni ed endogeni marcatori 14, sulla somministrazione farmacologica di piccole molecole 15,16,17 e sulle strategie di riprogrammazione diretta 18,19 sono stati seguiti. Inoltre, approcci non di cellule staminali a base volte a emulare pacemaker biologiciattraverso la manipolazione di molecole effettrici terminali sottostanti sarcolemmal elettrofisiologia invece di de novo generare cellule nodali completamente funzionale 20,21.

Tuttavia, nessuno di questi si avvicinò con le necessarie alte frequenze di contrazione spontanee e purezza cellulare. Al contrario, il nostro protocollo porta a cellule che non solo presentano oscillazioni elettriche ma anche le caratteristiche di segnalazione elettrofisiologica e calcio sottili così come le caratteristiche distintive morfologiche delle cellule pacemaker endogene 7. Questa tecnologia può diventare un importante prerequisito per le alternative ai dispositivi elettronici di stimolazione.

Sebbene questo protocollo è stato ottimizzato durante il suo sviluppo, vi sono ancora alcuni passaggi che possono causare problemi: Il punto di partenza per la selezione di ISAB è critica del protocollo. Battito delle cellule è un indicatore per αMHC-Expression nel differenziare le cellule. MYH6-Expression va di pari passo con l'expressione del gene di resistenza G418. Avvio di selezione troppo presto si spegne un sacco di cellule che potenzialmente potrebbero differenziarsi in cardiomiociti e pertanto diminuire la resa complessiva delle cellule nodali del seno. Un altro punto critico è la dissociazione dello strato di cellule (passo 2.8). La ragione di questo è che le cellule formano una matrice extracellulare robusto e una forza forte è necessaria per dissociare lo strato di cellule. Se necessario, passo 2.8.4 deve essere ripetuta fino a piccoli gruppi di cellule hanno sviluppato dallo strato di cellule. Evitare dissociazione diretta dello strato di cellule ad esempio con tripsina, perché si è rivelato essere di molto bassa efficienza.

Per le applicazioni cliniche future, i seguenti ostacoli devono ancora essere affrontate: trasferimento dell'approccio alla generazione di iSABs umani che può diventare un passo fondamentale verso il futuro la terapia cellulare e in vitro di droga-test. Inoltre, la tecnica è ancora basato su modifi genetica stabilecationi di PSC e quindi dovranno essere modificate prima che possa essere applicato al paziente.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

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References

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