Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Bioengineering

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Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

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Abstract

Introduction

Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d'une surface par balayage sur une zone de l'échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine 1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l'échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques - y compris les protéines, l'ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l'analyse des échantillons fixés dans l'air ou de l'état quasi-native dans un liquide 2-5.

Outre sa capacité d'imagerie à haute résolution dans l'ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d'interaction (d'adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l'échantillon 5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l'échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu'à ce qu'il perd le contact avec l'échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l'applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d'élasticité pour mesurer la rigidité d'un matériau, et les forces d'adhérence peuvent être obtenues.

Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d'un support solide - habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium 7 oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating 8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées 10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions 11 à 15.

Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d'approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L'épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force 6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN 6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d'insaturation) et modifié par des agents de la membrane 16 actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué 17 et d'autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d'approche affectent également la force de percée 15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques 11,19, les changements de composition dépendant 12,20, ainsi que des effets d'autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane 21.

Le plat d'orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d'autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface 22 et la microscopie à fluorescence 11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes.

Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l'AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L o) et désordonnés (L) d phases liquides ont été caractérisées 11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d'autres processus cellulaires 23,24.

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Protocol

1. Préparation de bicouches lipidiques supportées (SLB) 11,12,21

  1. Préparation de lipides Mélange vésicules multilamellaires et Suspensions
    1. Préparer les tampons suivants à l'avance.
      1. Préparer tampon PBS à des concentrations de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 et NaCl 137 mM, pH 7,2.
      2. Préparer SLB (soutenu bicouche lipidique) à des concentrations de tampon NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
      3. Préparer une solution de 1 M de CaCl2.
    2. Dissoudre les lipides suivants dans le chloroforme à une concentration désirée: par exemple, la di-oléyl-phosphatidylcholine (DOPC) à 25 mg / ml, la sphingomyéline (SM) à 25 mg / ml et le taux de cholestérol (Chol) à 10 mg / ml.
    3. Prenez 18,38 pi de DOPC, 17,10 pi de SM et 11,30 pi de Chol pour faire une solution avec 1 mg de lipides totaux dans un 2: 2: 1 DOPC: rapport molaire Chol: SM. Variez les volumes en conséquence sur la base du concentrations des lipides préparés en 1.1.2. Cependant, maintenir le rapport molaire de 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, que de changer le rapport molaire va changer les caractéristiques de phase de la membrane 25.
    4. Mélanger la solution complètement au vortex. Ajouter un colorant fluorescent lipidique à 0,05% en moles si l'on veut visualiser la bicouche par un microscope à fluorescence.
      Remarque: La famille de dialkylcarbocyanines à longue chaîne, comme l'a fait, Dil et DiO couvrent un large éventail de longueurs d'onde et peuvent être idéalement utilisés pour marquer des membranes lipidiques. En variante, des lipides marqués par fluorescence, tels que la phosphatidyléthanolamine ou la rhodamine-BODIPY-cholestérol peuvent être utilisés. Dans tous les cas, la concentration du colorant doit être optimisée en fonction du réglage de la microscopie, en gardant à l'esprit que des concentrations élevées du fluorophore lié au lipide peuvent modifier le comportement des lipides 19.
    5. Séchez le chloroforme en utilisant du gaz N 2 (ou tout gaz inerte disponibles tels que Ar et He).
    6. En outre t secil lipide mélange sous vide pendant au moins 1 heure.
      Note: Si vous rangez ce mélange lipidique, purger l'air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. Aliquoter excès de lipides-en-chloroforme dans de petits flacons bruns. Séchez-les d'une manière similaire à celle du mélange de lipides, déplacer l'air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C.
    7. Dissoudre les lipides séchés dans du tampon PBS à une concentration de 10 mg / ml.
    8. Vortex vigoureusement le mélange pendant environ 20 sec à 1 min pour obtenir une suspension trouble, contenant des vésicules multilamellaires. Assurez-vous que la il n'y a pas de films lipidiques coller aux parois de la fiole.
    9. Distribuer cette suspension dans 10 aliquotes (1 mg de lipides fait 10 aliquotes).
    10. Stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
  2. Préparation de vésicules unilamellaires
    Remarque: Les diverses tailles des vésicules unilamellaires peuvent être préparés en utilisant le procédé de sonication ou le procédé d'extrusion. Sonication utilise sound énergie pour agiter le mélange et séparer les couches de la suspension multilamellaire. Ceci est indiqué par le nettoyage de la suspension brumeux. Extrusion force les vésicules multilamellaires de passer à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore définie.
    1. Méthode de Sonication
      1. Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB.
      2. Transférer le mélange dans de petits (2 ml) flacons de verre plafonnés et sceller avec du Parafilm.
      3. Soniquer le mélange à la température ambiante dans un bain sonique pendant 10 min ou jusqu'à ce qu'il devienne clair pour donner de petites vésicules unilamellaires (SUV, en dessous de 50 nm de diamètre).
    2. Extrusion Méthode
      1. Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB.
      2. Transférer la suspension dans un tube cryogénique.
      3. Geler la suspension de lipides en immergeant le tube cryogénique pour quelques secondes dans de l'azote liquide.
      4. Décongeler lesuspension lipidique en immergeant le tube cryogénique dans un bain d'eau à température ambiante ou 37 ° C pendant quelques minutes. Répétez les étapes de gel-dégel au moins 10 fois.
      5. Pour extruder la suspension de lipides, en utilisant une membrane de polycarbonate de 200 nm de taille de pores (d'autres tailles de pores sont disponibles comme, 100 nm ou 400 nm) et un dispositif d'extrusion 26 commerciale.
        Remarque: Actuellement, il existe deux dispositifs d'extrusion disponibles dans le commerce: une extrudeuse manuel est disponible pour de petits volumes (200 pi à quelques ml). Dans ce cas, l'échantillon est extrudé à travers la membrane en poussant manuellement la suspension avant et en arrière entre deux seringues. Selon le fabricant, devraient être combinées pour atteindre son volume minimum de la mise en place des aliquotes lipidiques. Pour de plus grands volumes (jusqu'à 50 ml) dispositifs plus sophistiqués qui sont utilisés dans la suspension est forcée à travers la membrane de polycarbonate à l'aide de gaz comprimé. SET-UP et extrusion conditions peuvent changer selon le model. Reportez-vous aux instructions du fabricant avant de l'utiliser. Ce protocole se réfère à l'extrudeuse manuelle pour les petits volumes.
      6. Equilibrer l'extrudeuse dans l'eau en faisant passer l'eau à travers l'extrudeuse. Plonger la membrane dans l'eau.
      7. Placer la membrane entre les deux pistons, l'assemblage du dispositif et équilibrer dans du tampon, en faisant passer le tampon à travers l'extrudeuse, d'une seringue à l'autre. Cette étape permet de tester en outre la perméabilité du système. En cas de fuite, démonter et le remonter à nouveau changer la membrane.
      8. Prendre la suspension de lipides en utilisant une seringue de l'extrudeuse («côté sale ').
      9. Fixer la seringue contenant la suspension de lipides sur une chambre et la seringue vide sur la chambre adverse.
      10. Poussez la seringue sur une extrémité. Filtrer la solution à travers la membrane et dans la seringue opposée. Ceci est la passe 1 er.
      11. Passer à travers la membrane pour un total de 31 fois cesque la solution se termine sur la seringue opposée («côté propre»).
        Remarque: Vérifiez la membrane après extrusion. Si elle a été rompue, puis procédé d'extrusion a échoué et doit être répétée.
      12. Vider la seringue dans un petit tube. Grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont stables pendant 1-2 jours si elles sont conservées à 4 ° C.
  3. Préparation de Mica et Lamelles
    1. Laver lamelles de première dans l'eau puis dans l'éthanol. Sécher à l'air.
    2. Prenez disques de mica et de décoller la couche externe avec du ruban adhésif.
    3. Fixez le disque de mica sur la lamelle. Colles optiques transparents est optimisé de manière que l'on peut vérifier les bicouches avec un microscope à fluorescence.
    4. Attacher des cylindres en plastique (diamètre extérieur 2,5 cm, 2 cm de diamètre intérieur et 0,5 cm de hauteur) en utilisant de la colle optique / graisse. Assurez-vous que tout est scellé et qu'il n'y a pas de fuites. Utiliser de la graisse quand on veut réutiliser les bouteilles, car ils peuvent être facilement détachés de ee lamelle et lavé. Les dimensions des cylindres en plastique dépendent de la taille du support de cantilever AFM et doivent être ajustés en conséquence.
  4. Dépôt de vésicules unilamellaires sur support solide
    1. Pipeter l'ensemble de la solution de liposome directement sur le mica. Ajouter davantage de tampon SLB pour atteindre un volume de 300 pi.
    2. Ajouter 0,9 pl d'une solution de chlorure de calcium M pour atteindre une concentration finale de 3 mM de Ca 2+.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 2 minutes et ensuite à 65 ° C pendant au moins 10 min. Toujours couvrir les bicouches avec le tampon. Le contact avec les bulles d'air et aériennes détruire. Pendant l'incubation, ajouter plus de mémoire tampon si nécessaire, surtout si incubation à des températures plus élevées.
      Remarque: Les températures d'incubation varient en fonction des mélanges lipidiques et les phases nécessaires. Le temps d'incubation d'au moins 10 min est nécessaire pour former des bicouches en charge, mais il pourrait être plus long, en fonction de la température et de la composition.
    4. Lavageavec la bicouche chaude (65 ° C) de 15 à 20 fois SLB tampon pour éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées. Prenez soin supplémentaire pendant les étapes de lavage pour garder la bicouche sous tampon et pipeter doucement la solution de lavage pour éviter de détruire la bicouche.
    5. Bicouches frais pris en charge à la température ambiante avant les mesures de l'AFM. Cela est nécessaire pour former les différentes phases de la membrane ainsi que de minimiser la dérive thermique dans l'instrument.

2. microscopie à force atomique Mesures 11,12

  1. Imagerie
    Remarque: Effectuez imagerie par microscopie à force atomique en mode contact ou en mode taraudage. Image supportés bicouches en solution; ne permettent pas de solution à évaporer complètement car cela va détruire les bicouches. Comme on pouvait travailler avec tampon, s'il vous plaît respecter les consignes de sécurité à faire en sorte qu'une partie de l'AFM est protégée contre les déversements de liquides.
    1. Sélectionnez un cantilever douce (inférieure à 0,2 N / m constante de ressort est conseillé) et le monter à til AFM. Le choix de la raideur en porte à faux est plus critique pour la spectroscopie de force (et cela sera discuté plus tard).
    2. Monter l'échantillon sur la scène de l'AFM et assurez-vous que tous les modules de vibration-isolement sont allumés. Attendez au moins 15 minutes pour équilibrer et de réduire la dérive thermique du système. Selon l'AFM set-up, tuning et d'imagerie spécifications peuvent varier. Consultez le manuel du fabricant.
    3. Approchez l'échantillon avec la pointe de l'AFM jusqu'à ce contact.
    4. Depuis bicouches lipidiques sont habituellement de 4 nm de hauteur, utiliser le Z-gamme de l'instrument qui donnera la plus haute résolution z (par exemple 1,5 um).
    5. Sélectionnez une région à l'image. Pour avoir un aperçu de la bicouche lipidique, 50 um x 50 um ou 25 um x 25 um région sera un bon point à l'image de départ. Si les petites fonctionnalités apparaissent, on peut image dans des zones plus petites (10 um x 10 um, ou 2 x 2 pm pm). Le choix de la zone de formation d'image dépend également de la r travailange du scanner piézoélectrique. S'il vous plaît consulter le manuel de l'instrument pour cela.
    6. Comme bicouches sont très fragiles, régler le point de la pointe AFM de jeu lors de l'imagerie de garder la force au minimum et corriger la dérive thermique, tout en maintenant le contact avec l'échantillon. En mode de contact, de minimiser le point de consigne. En mode tapping, maximiser le point de consigne.
    7. Traiter les images en ajustant chaque ligne de balayage à des fonctions de mise à niveau de polynômes. Effectue la suppression de la ligne pour les scans qui perdent contact avec la membrane en utilisant le logiciel propriétaire de l'entreprise de fabrication de l'AFM.
  2. Spectroscopie de force
    1. Calibrer le cantilever en suivant les instructions selon le protocole du fabricant. L'étalonnage permet la conversion du signal électrique des photodiodes de force (Figure 1B).
      1. Calibrer la sensibilité de la pointe pour mesurer la déviation que le mouvement z-piézo (en unités de longueur) à la place du signal électrique en volts.
      2. Calculer la constante de ressort en porte à faux en utilisant la méthode de fréquence de bruit thermique, habituellement incorporé dans le logiciel de l'AFM. Dans ce procédé, tracer l'amplitude de vibration de bruit par rapport à la fréquence d'oscillation, la création d'un diagramme de densité spectrale de puissance. Cette parcelle se montrer un pic autour de la fréquence de résonance. La fréquence où l'amplitude is la plus grande est la fréquence de résonance. Monter une fonction lorentzienne autour du pic de calculer automatiquement la constante de rappel par le logiciel. Certaines des ressources utiles pour la théorie de la méthode de bruit thermique sont données dans les références 27-30.
    2. Après imager une zone de la bicouche, sélectionner une région de 5 x 5 pm pm dans la bicouche à effectuer la spectroscopie de force.
    3. Mettre en place l'AFM afin qu'il prenne courbes de force dans une grille de cette région 16 x 16. Cela se traduit par 256 courbes de force par région. L'espace entre deux points voisins devrait être suffisant pour éviter que la surface de la membrane est sondée par un point coïnciderait avec le point suivant. Cela dépend sur le rayon de la pointe. Une distance de 100 nm entre deux points serait idéal. Diviser la région x 5 pm 5 pm en 16 x 16 grille. Selon la taille de la phase, on peut sélectionner une région plus ou moins grande, et ensuite ajuster la taille de la grille en conséquence.
    4. Ensemble piézo-z de déplacement400 nm. Cela détermine la portée maximale de mouvement de la z-piézo. Il devrait être assez grand pour faire en sorte que le cantilever a complètement rétractée loin de l'échantillon entre les deux mesures.
    5. Réglez la vitesse d'approche de 800 nm / s et se rétracter vitesse à 200 nm / sec. Utiliser une vitesse d'approche entre 400 à 6000 nm / s en fonction de la composition de la bicouche lipidique et de la phase à étudier 6,16.
    6. Après la mise en place de tous les paramètres, acquérir courbes de force, en appuyant sur le bouton "run" du logiciel de l'AFM.
    7. Enregistrer courbes de force que la force en fonction des courbes de hauteur (une mesure de mouvement z-piézo). Ceci ne tient pas compte de la flexion de la poutre lors du contact avec l'échantillon. Lors de l'étape de traitement de données, le logiciel de l'AFM permet correction pour cantilever pliage pour obtenir la force en fonction des courbes de séparation pointe de l'échantillon (figure 1C), ce qui donnera des valeurs correctes pour l'épaisseur de la bicouche. Les valeurs de correction sont habituellement incorporés dans le calibration, qui est enregistré avec chaque courbe de force. Calculer la séparation pointe-échantillon en soustrayant la déviation verticale du mouvement piézoélectrique à un moment donné.
      Remarque: Le pic de la courbe de force d'approche (la valeur de la force descend même si le mouvement en porte à faux est toujours sur le cycle d'approche) est la force de rupture de la membrane, tandis que la différence entre la position de ce pic et la position du point où la force commence à se lever à nouveau fournit l'épaisseur de la membrane.
    8. Acquérir au moins 500 courbes de force pour chaque condition d'obtenir de bonnes statistiques. Tracer un histogramme des valeurs en utilisant des programmes comme origine ou de MatLab, et monter les histogrammes pour une distribution gaussienne pour obtenir le pic et la largeur de la distribution.

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Representative Results

Bicouches lipidiques supportées composées de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été imagées en AFM (Figure 2 AC). En raison de la composition des lipides, SM / Chol-riche et DOPC L o L d riches en phases ont été observés. Le profil de hauteur de l'imagerie AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane. En regardant le profil de hauteur, l'épaisseur de la bicouche peut être mesurée en présence de défauts dans la membrane (figure 2B), ou la différence de hauteur entre les L O / L d phases peut être fournie. En outre, l'AFM permet de sélectionner précisément les régions représentant ces phases et analyser leurs propriétés mécaniques à l'aide de spectroscopie de force (Figure 2 D - F). Les courbes de force issus de la mode de la spectroscopie de force sont utilisés pour mesurer la force de percée en trouvant la valeur de la force au sommet de la courbe de force (figure 2D et E), et de la membrépaisseur de ane en soustrayant la valeur de la distance depuis le sommet de la courbe de force à la valeur de la distance lorsque la courbe de force commence à augmenter à nouveau (figure 2D et F).

La sensibilité des mesures AFM est fonction du matériau piézo-électrique et des boucles de rétroaction électroniques. En tant que tel, avant de faire des expériences, il est important de se familiariser avec l'AFM mis en place. Il ya deux instrument commun mis en place pour les matériaux piézoélectriques: (1) scanner de tube dans lequel l'échantillon est placé sur le dessus du matériau piézo-électrique et l'échantillon est scanné sur une pointe immobile; ou (2) la flexion étape où l'embout est monté sur le matériau piézo-électrique à la place de l'échantillon. Dans ce dernier cas, le matériau piézo-électrique et d'autres composants électroniques sont protégés des éclaboussures. Un grand nombre de modèles de l'AFM pour des applications biologiques ont cette configuration.

Au cours de l'imagerie, de la pointe de l'AFM peut perdre le contact avec l'échantillon et conduire à me erronéeasurements. Selon le nombre de balayages sont perdus, l'image peut être corrigé en éliminant les lignes de balayage et en utilisant un filtre à moyenne intensité pour calculer les nouvelles valeurs de zone périphérique (figure 3). Cependant, dans la plupart des cas, cela ne donne pas une bonne image et il est recommandé de simplement jeter l'image. Il existe d'autres objets qui doivent être surveillés. Ceux-ci proviennent de endommagées bouts arrondis / / sales ainsi que la diffraction de la tache laser derrière la console 31. Dans ces cas, les images doivent être jetés et la pointe de l'AFM doivent être remplacés.

Lors des mesures de spectroscopie de force, plusieurs défis peuvent se présenter: (1) l'absence de pics (figure 4A), (2) la présence d'épaules au lieu des pics de bien-définis (figure 4B), (3) une petite montée et plafonnement subséquent à très faible forces (figure 4C - D). L'absence d'un pic peut être attribuée à la mesure dans une région sans bilconditions ayer ou à l'acquisition ne sont pas optimisés. Il est recommandé que l'image de l'AFM est acquis avant de faire la spectroscopie de force pour vous assurer que la bicouche est en effet mesuré. Conditions d'acquisition ainsi que pointe spécifications / cantilever influent sur ​​la probabilité d'un événement novateur sur 17. Une astuce nette peut facilement perforer une bicouche, en tant que telle, la force de percée peut apparaître faible ou ne pas apparaître du tout, car il est au-dessous des niveaux de bruit. . L'augmentation de la vitesse d'approche augmente également la force de percée 16. Comme la bicouche est pressé par la pointe, les molécules de lipides réagissent aussi à dissiper cette force. À une vitesse d'approche inférieur, la bicouche lipidique a suffisamment de temps pour équilibrer avant l'étape suivante de la force, ce qui augmente la probabilité qu'un événement de rupture peut se produire. À une vitesse d'approche élevée, les rampes de force plus rapide que la réaction des lipides et, par conséquent, la probabilité d'un événement de rupture est inférieure à la même force. Il est possIble qu'en utilisant la vitesse d'approche élevée, la consigne est atteinte avant les pauses bicouches résultant en aucun pics observables. Il n'y a pas de rapports pour expliquer l'apparition de la courbe des épaules sur mais nous postulent que cela pourrait être dû à la compression matériel avant percée. En outre, un plateau ou pics larges à des forces très faibles peuvent indiquer la présence de saleté ou de matière lipidique en vrac dans la pointe. Conseils peuvent accumuler de la saleté et du matériel lipidique en l'espace de plusieurs mesures. La saleté et attaché à la pointe, il est émoussé, augmentant ainsi la force de percée.

Il est recommandé que les courbes de force sont acquises dans les différents domaines si ces problèmes se posent. Une deuxième recommandation est de changer des conseils (ce qui nécessitera recalibrage). Enfin, la vitesse d'approche peut être nécessaire d'ajuster ou de l'utilisation d'une pointe avec des spécifications différentes (rayon de la pointe et de rigidité) peut être envisagée. La force de rupture varie entre 0-50 nN 6, en tant que tel, til Constant Spring du cantilever peut être dans la gamme de 0,05 à 0,7 N / m. La plupart des leviers commerciaux ont un rayon de pointe nominale autour de 20-40 nm. Au lieu d'utiliser des conseils classiques, cantilevers sans pointe pourraient également être achetés et des sphères de rayon connu (qui sont généralement monodisperse dans la distribution de la taille) pourraient être attachés à eux. Pour obtenir des données reproductibles, toujours utiliser les mêmes conditions d'acquisition et les spécifications en porte à faux pour la même série d'expériences.

Figure 1
Figure 1: Principes de spectroscopie de force (A) Séquence de l'approche-retrait de la console de l'échantillon.. La ligne rouge montre la déflection du cantilever de sa position d'équilibre (ligne noire). (B) l'étalonnage de luge convertit signal électrique (en volts) pour forcer (en Newtons). Par l'acquisition de la sensi cantilevertivité et constante la déviation verticale (en volts) ressort est convertie en distance et la distance en vigueur en utilisant la loi de Hooke. (C) En cas de contact dans les mesures de spectroscopie de force, z-piézo mouvement de balayage ne ​​prend pas en compte le cantilever flexion. Une correction pour cela peut être fait en soustrayant la déviation verticale, x (en unités de distance) à partir du mouvement piézo-z, z (également en unités de distance). De cette manière, la séparation bout-échantillon réel, au lieu de simplement le mouvement z-piézo, peut être signalé, qui est une mesure plus précise des distances et il est important pour mesurer l'épaisseur de l'échantillon.

Figure 2
Figure 2:. AFM du Bureau de la normalisation (A) Schéma de SLBS composé de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se séparent en liquide désordonné (L d) et le liquide commandé (L o) phases. (B (C) correspond au carré jaune B (10 um x 10 um). L o et L d phases sont étiquetés. Le profil de la ligne ci-dessous correspond à la ligne jaune dans l'image. La phase L o apparaît 1-2 nm supérieure à la phase L d. (D) une courbe de force échantillon montrant comment la force de rupture et de l'épaisseur de la membrane sont dérivés. (E) la force de rupture et (F) de distribution d'épaisseur de membrane de L d et L o phases avec ajustement gaussien pour la quantification.

Figure 3
Figure 3: perte de contact lors de l'imagerie conduit à. SM: Chol lignes de balayage qui ne correspondent pas au reste de l'image Une bicouche composée de DOPC en charge (2: 2: 1) avec perte de contact dans certains balayages de lignes. Barre d'échelle 2 um.

Figure 4
Figure 4:. Défis en spectroscopie de force (A) Quelques courbes de force aura pas de pics. (B) La courbe peut avoir les épaules au lieu des pics bien définis. (C) Après une légère augmentation d'un plateau peut se produire en l'absence du pic. (D) L'apparition d'un plateau avec un pic bien défini.

région de la membrane Percée de travail (NN) Épaisseur de la membrane (en nm)
L d phases 6 ± 1 4.7 &# 177; 0,5
L o de phase 8 ± 1 6 ± 1

Tableau 1: propriétés membranaires de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBS La phase Ld a une force de percée de 6 ± 1 NN et une épaisseur de 4,7 ± 0,5 nm. Le L o a 8 ± 1 NN et une épaisseur de 6 ± 1 nm. La différence de hauteur entre les deux phases est de 2 ± 1,4 nm.

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Discussion

SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L D et L o phases. La phase L o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de 11 Ld. La séparation de la L o L d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circulaires surélevées au-dessus de l'ambiante (Figure 1B, C). Les plates-formes sont les L o phases entourés par les L d phases. des défauts de membrane (ou des trous dans la membrane) sont également considérées (figure 1B, flèche bleue) et un profil de hauteur à travers ce défaut montre l'épaisseur de la bicouche. Le / L o différence de hauteur Ld peut également être examiné en regardant un profil de hauteur de l'AFM (figure 1C).

La préparation de lipidemélange est très important car la composition détermine les propriétés bicouches. Lors de la préparation de la bicouche supportée, il est important de travailler à des températures indiquées pour la bonne formation des lipides phases (étape 1.4.5). Au cours de l'imagerie, en gardant une faible force est très important afin de ne pas détruire la bicouche, ni à accumuler de la saleté sur la pointe.

Après l'imagerie AFM, les régions du SLB sont sélectionnés et sondés en utilisant la spectroscopie de force. Spectroscopie de travail nous permet de sonder d'autres propriétés de la membrane, en particulier la force de rupture (figure 1D). La L d et L o phases montrent la force de rupture et épaisseur différente (figure 1E, F). Les propriétés sont résumées dans le tableau 1. Nous notons que par rapport à Chiantia et al. 11, des valeurs semblables pour vigueur percée dans le L phase d ont été obtenus, mais une valeur inférieure pour la phase L o. Cela pourrait êtreen raison de plus faibles quantités de cholestérol dans les membranes utilisées (nous avons utilisé DOPC: SM: Chol rapport 2: 2: 1, tandis que ils ont utilisé de 1,5: 1,5: 1). Cela démontre également l'importance de mélanger le rapport lipides droit - un facteur critique dans la reproductibilité des résultats. En outre, en utilisant différents lipides (longueur de chaîne, et le degré d'insaturation) modifie également les propriétés de deux couches 6,15,18.

Durant le tracé de la répartition des forces révolutionnaires est utile et peut déjà montrer des différences dans les propriétés bicouche, une analyse plus approfondie de la répartition de la force de percée peut être utilisée pour déduire d'autres propriétés mécaniques y compris la tension de la ligne et la propagation pression 11,17,21. En bref, la probabilité, P (F) de mesure d'une certaine force de rupture, F, est décrit par le modèle de continuum de nucléation 11,15,17:

Equation 1

où: A représente la Resonafréquence nce du cantilever, K est la constante de rappel du cantilever, v est la vitesse de l'approche, Γ est la tension de la ligne (l'énergie de pointe nécessaire pour maintenir un trou dans la membrane ouverte), R est le rayon de l'AFM pointe, k B est la constante de Boltzmann, T est la température, et S est la pression étalement ou l'énergie associée à fermer le trou (en face de la tension de la membrane - l'énergie nécessaire pour être exercée par la membrane pour ouvrir un trou 32). Cette équation peut être intégré et dP / dF peut être calculée comme suit:

Equation 2

A, K, R sont des propriétés de l'AFM cantilever / astuce qui peut être acquis par un étalonnage en porte à faux. T et V sont des paramètres expérimentaux qui doit être maintenue constante tout au long des expériences. dP / dF est ensuite monté sur l'histogramme pour acquérir la tension de ligne et la pression d'étalement. Comme plusieurs paramètres affectent P (F), expémentalistes sont invités à utiliser des conseils similaires et les conditions d'acquisition d'avoir des valeurs comparables pour tension de la ligne et la pression se propager. La contamination de la pointe de l'AFM (y compris la saleté et des vésicules non fusionnées sur la pointe acquise lors de l'imagerie) conduit à des résultats non reproductibles. En outre, le choix du support affecte les propriétés mécaniques de la membrane 20.

Une autre technique qui peut caractériser les propriétés mécaniques du bicouche lipidique est l'aspiration de la micropipette de vésicules unilamellaires géantes (33) GUVs. Dans cette technique, la tension de la membrane est calculé à partir de la déformation lors de l'aspiration GUVs. En outre, en augmentant l'aspiration, on peut calculer la tension à laquelle la rupture de l'GUV (ou tension de lyse) 34, qui pourrait être lié à la tension de ligne dans le modèle continuum de nucléation. Un inconvénient de cette technique est la complexité du calcul de la tension de la membrane à la phase des membranes de séparation, que les différentes phaSE ont des propriétés mécaniques différentes 35. Ceci est en contraste avec la spectroscopie de force AFM, où différentes phases peuvent être caractérisés séparément. En outre, alors que de nombreux GUVs sont nécessaires pour produire des résultats statistiquement pertinents, l'AFM peut produire une répartition par SLB. Cependant, la membrane remodelage effets (par exemple, tubulure et invaginations) sont plus facilement visualisées avec GUVs, faisant d'eux de meilleurs systèmes pour caractériser ces effets liés forme-ensemble avec des propriétés mécaniques.

Dans d'autres applications pour étudier les effets des protéines membranaires sur les propriétés bicouches, protéines purifiées peuvent être incorporés dans ces vésicules de faire protéoliposomes. Une technique utilise pour ce faire des détergents pour aider à stabiliser les protéines et l'insérer dans la membrane. Une purification ultérieure par Chromatographie de dialyse ou d'exclusion de taille élimine les protéines libres et de détergent dans une solution 36. Une autre approche nécessite le marquage desles protéines purifiées (par exemple, l'histidine ou streptavidine tags) et en intégrant des partenaires d'affinité pour cette balise dans les liposomes (avec nickel-nitriloacétique acide (Ni-NTA) ou des lipides biotinylés).

En résumé, nous avons décrit un procédé pour analyser des bicouches lipidiques. Grâce à sa haute résolution, l'AFM peut révéler des structures sous-micrométriques dans la membrane, qui comprennent les phases lipidiques entre autres. la spectroscopie de force, ici utilisé pour caractériser les membranes lipidiques, peut également être utilisé sur des protéines de membrane et d'autres biomolécules sur la membrane.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, le cancer Centre allemand de recherche, l'Université de Tübingen, et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (accorder. Pas 0312040).

Nous remercions Eduard Hermann de nous aider à automatiser l'analyse des données de la courbe de la force et le Dr Jakob Suckale la lecture attentive de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

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