Name: A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri un sistema di espressione efficiente e a basso costo per produrre granzime umane glicosilate e attive in cellule HEK293T. Questo metodo ottimizza la resa per studi di biologia cellulare e applicazioni terapeutiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Novartis per la Ricerca Medico-Biologica e dal Pool di Ricerca dell'Università di Friburgo (a MW). Ringraziamo Li Zhao, Zhan Xu e Solange Kharoubi Hess per il supporto tecnico, così come Radu Aricescu e Yvonne Jones (Oxford University, Regno Unito) per aver fornito il plasmide pHLsec e Thomas Schürpf (Harvard Medical School) per le utili discussioni.

1. Produzione del plasmide espressione pHLsec-GZM <ol><li> Preparare RNA totale da cellule NK umane (cellule primarie preparato come al 26 o la linea delle cellule NK NK-92 che esprimono tutte le cinque Gzms umane), utilizzando un metodo di isolamento RNA adatto e invertire trascrivere con un primo filamento kit cDNA sintetizzare, a seguito della manufacturer` raccomandazioni s. Amplificare GZM cDNA usando la PCR e clonazione in pHLsec come descritto in 23 (gentile dono di Radu Aricescu e Yvonne Jones, dell&#39;Università di Oxford, Regno Unito) utilizzando i siti AGEI e KpnI (Figura 1). NOTA: Utilizzare i seguenti primer indicati nella tabella 1. </li><li> Confermare inserti corretti di sequenziamento. Espandere i plasmidi di espressione nelle cellule DH5α e purificare utilizzando un kit di isolamento plasmide privo di endotossine e seguire le istruzioni del produttore. </li><li> Risospendere i plasmidi purificati in privo di endotossine, acqua sterile ad una concentrazione di 2 mg / ml e conservare a -20 ° C untiuso l. </li></ol> 2. Espressione dei Gzms nelle cellule HEK293T <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare terreno di coltura standard. Per di Dulbecco modificato (DMEM) contenente alte concentrazioni di glucosio (25 mm), Glutamax (4 mm), piruvato di sodio (1 mm) aggiungere il 10% di siero standard fetale bovino (FCS), la penicillina (100 unità / ml), streptomicina ( 100 mg / ml). </li><li> Preparare medio trasfezione. Per mezzo di coltura senza penicillina streptomicina aggiungere 25 mg / ml clorochina (aggiungere appena il giorno della trasfezione da 1,000x scorte in PBS, conservati a -20 ° C). </li><li> Preparare mezzo privo di siero cultura: per mezzo privo di siero per HEK293 cellule aggiungono glutamina (4 mm), la penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml), e di 2,5 mg / L amfotericina B. </li><li> Preparare le soluzioni descritte in Tabella 2 e filtro con un filtro da 0,45 micron prima dell&#39;uso: </li></ol></li><li> Espansione cellule HEK293T <ol><li> Crescere HEK293T cellule in 20 ml di cultomedio ure con 150 x 25 millimetri piatti di coltura dei tessuti. </li><li> Cellule Split a 80% di confluenza (split-rapporto di 1: 4, di solito ogni giorno 3 °). Cellule liberamente allegare, possono essere staccati meccanicamente senza tripsinizzazione rigorosamente pipettando su e giù. </li><li> Cellule piastra la sera prima trasfezione per dare il 60-70% di confluenza al giorno di trasfezione (densità di semina ~ 2 x 10 5 cellule / ml). Una dimensione di preparazione al solito composto da 20-25 piatti della cultura. </li></ol></li><li> Fosfato di calcio trasfezione <ol><li> 1 ora prima della trasfezione, cambiare il terreno di coltura standard per 20 ml di mezzo di trasfezione. Vicino alla fine di questo step 1 ora di incubazione, miscelare 400 mg di DNA plasmidico con 10,95 ml DDH 2 0 e 1,55 ml di 2M CaCl 2 in provette da 50 ml (1 tubo / 5 piatti). </li><li> 1 a 2 minuti prima della trasfezione, aggiungere 12,5 ml 2x HBS a 12,5 ml della soluzione di DNA-Calcium, mescolare per inversione dei tubi e incubare per 30 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungi the composto preparato in 2.3.2 direttamente alle cellule (5 ml per piatto), goccia a goccia nel mezzo. Spruzzare uniformemente su tutta la superficie, girando il mezzo per un colore leggermente arancione. </li><li> Incubare le piastre di coltura per 7 a 11 h in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2 in aria umidificata). Dopo l&#39;incubazione, un bel precipitato è visibile. Rimuovere il supporto transfezione, lavare accuratamente con PBS preriscaldata e aggiungere 20 ml di terreno di coltura senza siero preparati a 2.1.3. Incubare per 72 ore in un tessuto culturale incubatore. </li><li> Analizzare l&#39;efficienza di trasfezione ed espressione eseguendo un campione (~ 20 ml) del surnatante cellulare su SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue per visualizzare una banda granzyme. </li></ol></li><li> Purificazione di Gzms dalla cultura surnatante da Nickel-IMAC <ol><li> Dopo l&#39;incubazione, decantare il surnatante di colture cellulari in 250 mL e chiaro per centrifugazione. Effettuare un primo giro (400 xg, 10 min, 4 °C) che cancellerà il mezzo da cellule indipendenti. Trasferire il surnatante in freschi 250 ml provette e centrifugare a 4000 xg, 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti rimanenti. </li><li> Aggiungere 5 ml di 5 M NaCl, 6,25 ml di 2 M Tris-Base (pH 8) e 1 ml di 0,25 M Niso 4 per 250 ml di surnatante eliminato. Filtrare il surnatante con un gruppo filtro di vuoto 500 ml (0,45 mm). </li><li> Equilibrare una colonna Nichel-IMAC con la Sua vincolante tampone A (10 volumi di colonna, CV) utilizzando un sistema FPLC adeguato. </li><li> Applicare il surnatante eliminato alla colonna equilibrata ad un flusso di 0,5 ml / min a 4 ° C. </li><li> Dopo che è stato applicato il surnatante, lavare colonna con la sua impegnativa buffer finché assorbimento UV linea di base viene raggiunto (di solito 10 CV). </li><li> Eluire Gzms con lineare 20 ml gradiente (Da 0 a 250 mM imidazolo) ad una portata di 0,5 ml / min, mentre la raccolta 2 ml-frazioni. Analizzare le frazioni di eluizione di SDS-PAGE e colorazione Coomassie. </li></ol></li><li> Enterokinase (EK)trattamento e pulizia finale mediante cromatografia a scambio cationico <ol><li> Pool GZM contenenti frazioni in un tubo dialisi con ≤10 MWCO. Conservare un piccolo campione a -20 ° C, come il controllo pre-EK. </li><li> Aggiungere EK a 0,02 unità / 50 ml di surnatante iniziale direttamente alla frazione pool nel tubo di dialisi e dializza O / N (almeno 16 ore) a temperatura ambiente in EK-buffer (4 L, cambiamento tampone volta). </li><li> Il giorno dopo, analizzare EK trattata Gzms rispetto al pre-EK controllo da SDS-PAGE e colorazione Coomassie. </li><li> Quando l&#39;elaborazione N-terminale è completo, cambiare tampone di dialisi a S tampone A (4 L) e dializza per altri 4 ore a RT. Dializzato filtro (0,45 micron). </li><li> Equilibrare un S-colonna con tampone A. S Caricare il campione nella colonna ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min a 4 ° C. </li><li> Dopo il caricamento del campione, lavare la colonna con tampone S A fino UV basale assorbanza viene raggiunta (circa 10 CV). Eluire le Gzms con un gradiente lineare di 30 ml (150 a 1,000 mM NaCl). GzmA eliuti a ~ 650 mM NaCl, GzmB a ~ NaCl 700 mm e GzmM a ~ NaCl 750 mm. </li><li> Analizzare le frazioni di eluizione di SDS-PAGE e test colorimetrici (vedi sotto). Pool frazioni contenenti Gzms e concentrato (circa 30 volte, ad una concentrazione di circa 100 mM) in filtri di spin (15 ml, 10 MWCO). Aliquota i preparativi GZM concentrate e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> Attività 3. Test GZM <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare colorimetrico tampone: 50 mm Tris-Base, pH 7. <ol><li> Per la misura di GzmA, aggiungere Na-CBZ-L-lisina thiobenzyl estere (S-Bzl) (BLT) al tampone ad una concentrazione finale di 0,2 mM e 5,5&#39;-ditio-bis (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) ad una concentrazione di 0,22 mM. Per GzmB, includere 0,2 mm DTNB mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (DAA) e 0,22. Per GzmM, includere 0,2 mm Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (PNA) (AAPL). Peptidi sintetici sono aggiunti da adeguate soluzioni madre (in DMSO, stored a -20 ° C) al buffer appena prima del dosaggio. </li></ol></li><li> Preparare tampone clivaggio: NaCl 100 mM, 50 mM Tris-Base, pH 7.5 </li></ol></li><li> Test colorimetrici <ol><li> Distribuire piccoli campioni GZM (&lt;5 ml) da frazioni di eluizione o stock concentrati nelle piastre a 96 pozzetti a fondo piatto. Includere un controllo positivo (preparati GZM testate o greggio lisati cellulari NK) e un controllo negativo (tampone solo). </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone a ciascun pozzetto (utilizzando una pipetta multicanale). Incubare per 10 minuti a 37 ° C. Misurare OD a 405 nm in un lettore per micropiastre. </li></ol></li><li> Test Decolleté <ol><li> Per i saggi scissione utilizzando substrati purificati, co-incubare un substrato proteico (nativa o ricombinante, 100-400 nM; alcuni esempi di substrati GZM efficienti sono presentati nella sezione risultato e nella nota alla fine di questa sezione) con diluizioni seriali di un GZM (a partire da 400 nM) in tampone per varie volte.Analizzare mediante SDS-PAGE e Coomassie o macchie d&#39;argento; o mediante Western blotting utilizzando anticorpi specifici. </li><li> Per i saggi scissione utilizzando lisati cellulari, sospendere 10 6 cellule HeLa (o qualsiasi linea cellulare tumorale disponibile) in 1 ml di tampone di saggio e lyse congelando in un / bagno di ghiaccio secco etanolo e scongelamento a 37 ° C per tre volte. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione (15.000 xg per 10 min a 4 ° C). </li><li> Co-incubare il lisato liquidati con Gzms a diverse concentrazioni e tempi di cui sopra. Cleavage viene rilevata mediante immunoblotting utilizzando anticorpi appropriati. NOTA: Alcuni esempi di substrati in buona fede per la quale gli anticorpi commerciali sono disponibili: Offerta (BH3-interagente agonisti morte di dominio) e caspasi 3 spaccati da GzmB 27,28; più ribonucleoproteins nucleari eterogenei (hnRNPA1, A2 e U) spaccati da GzmA 29; citomegalovirus phosphoprotein 71 da GzmM 30. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+a+thousand+cuts%3A+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li>
<li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin%3A+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li>
<li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li>
<li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+granzymes+find+a+home%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li>
<li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+A+activates+another+way+to+die%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li>
<li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+in+injury%2C+inflammation%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li>
<li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL%2FNK+protease+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li>
<li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li>
<li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li>
<li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li>
<li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+refolding%2C+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li>
<li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-H22%28scFv%29%2C+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li>
<li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li>
<li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis%3A+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li>
<li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose+6-phosphate%2Finsulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li>
<li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li>
<li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+peptidase+I%3A+importance+of+progranzyme+activation+sequences%2C+other+dipeptide+sequences%2C+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li>
<li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. </a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li>
<li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li>
<li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis%2C+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
<li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li>
<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il ruolo classico e ampiamente studiato di GzmA e GzmB è l&#39;induzione di apoptosi nelle cellule di mammifero dopo la loro consegna citosolico dal formano pori proteine ​​PFN 1. Recentemente, lo spettro citotossica delle Gzms stato ampliato significativamente da cellule di mammifero ai batteri 9,10, così come a certi parassiti 11. Inoltre, i non classici, funzioni extracellulari di GzmA e GzmB nonché il significato biologico dei vari Gzms orfani sono ancora oscuri. Pertanto, l&#39;espr...

I Gzms sono una famiglia di serina proteasi altamente omologhi localizzate nei lisosomi specializzati di CTL e cellule NK 1. I granuli citotossici di queste cellule killer contengono anche i-membrana interrompere proteine ​​PFN e GNLY che vengono rilasciati contemporaneamente alle Gzms accreditato in una cella di destinazione destinata per l&#39;eliminazione 2,3. Ci sono cinque Gzms nell&#39;uomo (GzmA, B, H, K e M), e 10 Gzms nei topi (GzmA - G, K, M e N). GzmA e GzmB sono i più abbondanti e ampiamente studiati sugli esseri umani e nei topi 1. Tuttavia, studi più recenti hanno cominciato a studiare le vie di morte cellulare e gli effetti biologici supplementari mediati dalle altre, cosiddette Gzms orfani in materia di salute e di malattia 4. La funzione più nota delle Gzms, in particolare di GzmA e GzmB, è l&#39;induzione della morte cellulare programmata in cellule di mammifero quando espresso nelle cellule bersaglio da parte PFN 5,6. Tuttavia, Studi più recenti hanno anche dimostrato effetti extracellulari dei Gzms con profondo impatto sulla regolazione immunitaria e infiammazione, indipendentemente dalla consegna citosolica da PFN 7,8. Lo spettro di cellule che vengono uccisi in modo efficace dopo l&#39;entrata citosolico dei Gzms è stato recentemente ampliato da cellule di mammifero a batteri 9,10 e anche alcuni parassiti 11. Queste scoperte recenti aperto un campo completamente nuovo per i ricercatori GZM. Pertanto, un alto rendimento del sistema di espressione mammifero economicamente efficiente faciliterà notevolmente la strada a tali studi futuri. Umani, topi e ratti Gzms nativi sono stati purificati con successo dalla frazione granello di CTL e NK cellule linee 12-14. Tuttavia, nelle nostre mani il rendimento di tali tecniche di purificazione è nella gamma di cultura inferiore a 0,1 mg / L cella (osservazioni non pubblicate e 12). Inoltre, la risoluzione cromatografica di un singolo GZM senza contaminazione da other Gzms e / o proteine ​​che sono presenti anche nei granuli è impegnativo (dati inediti e 12,14). Gzms ricombinanti sono state prodotte in batteri, lieviti 15 16, cellule di insetto 17 e in anche in cellule di mammifero, come HEK 293 18,19. Solo i sistemi di espressione di mammifero portano il potenziale di produrre enzimi ricombinanti con modificazioni post-identico alla proteina citotossica nativo. Modificazioni post-traduzionali sono stati implicati con l&#39;assorbimento specifico per endocitosi e la localizzazione intracellulare della proteasi all&#39;interno delle cellule bersaglio 20-22. Pertanto, utilizzando pHLsec 23 (un gentile dono di Radu Aricescu e Yvonne Jones, dell&#39;Università di Oxford, Regno Unito) come spina dorsale plasmide per l&#39;espressione GZM, abbiamo istituito un sistema semplice, tempo e conveniente per alto rendimento produzione di proteine ​​in HEK293T cellule. pHLsec combina un esaltatore di CMV con un pollo Β-actina promotore; insieme, questi elementi dimoted il più forte promotore attività in varie linee cellulari 24. Inoltre, il plasmide contiene un coniglio Β-globina introne, segnali Kozak e secrezione ottimizzati, a-6xHis-tag Lys e un poli-A segnale. Gli inserti possono essere clonate convenientemente tra il segnale di secrezione e Lys-6xHis-tag (Figura 1) assicurando espressione ottimale e efficienza secrezione di proteine ​​prive appropriate domini N-terminali. Per l&#39;espressione delle Gzms, abbiamo sostituito la sequenza segnale di secrezione endogena con il segnale di secrezione fornito dal vettore seguito da un enterokinase (EK) sito (DDDDK) in modo che il trattamento EK attivato il Gzms secrete (Gzms attivi iniziare con N-terminale sequenza aminoacidica IIGG 25). Inoltre, a favore di questo metodo, le cellule HEK293T crescono rapidamente in basso prezzo medio, come Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), e sono adatti per il calcio-fosfato metodo trasfezione conveniente.

<table><tbody><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Kit di isolamento dell'RNA totale</td></tr><tr><td>SuperScript II Trascrittasi inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Maxi kit di plasmidi EndoFree</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 Terreno senza siero per cellule HEK 293</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin tubo per dialisi, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enterokinasi da intestino bovino</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>ricombinante, &ge; 20&nbsp; unità/mg di proteina</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml colonna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Nichel IMAC</td></tr><tr><td>Colonna HiTrap SP HP da 5 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>Colonna S</td></tr><tr><td>N-&alfa;-Cbz-L-lisina tiobenzilestere (BLT)</td><td>Substrato Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>substrato GzmB</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td><td>Substrato di Bachem</td><td></td><td>GzmM</td></tr><tr><td>5,5&prime;-ditio-bis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB)</td><td>Reagente di Ellman Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr></tbody></table>

a high yield e cost-efficient sistema espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Quando i linfociti T citotossici (CTL) o le cellule natural killer (NK) riconoscono le cellule tumorali o le cellule infettate da patogeni intracellulari, rilasciano il loro contenuto di granuli citotossici per eliminare le cellule bersaglio e il patogeno intracellulare. La morte delle cellule ospiti e dei patogeni intracellulari è innescata dalle granuli di serina proteasi, granzimi (Gzms), trasportate nel citosol della cellula ospite dalla proteina che forma i pori perforina (PFN) e nei patogeni batterici dalla proteina procariotica che distrugge la membrana procariotica granulisina (GNLY). Per studiare i meccanismi molecolari di morte cellulare bersaglio mediata dai Gzms in contesti sperimentali in vitro, sono necessari sistemi di espressione e purificazione proteica che producono elevate quantità di enzimi attivi. I sistemi di espressione proteica secreta nei mammiferi implicano il potenziale per produrre proteine correttamente ripiegate e completamente funzionali che subiscono modifiche post-traduzionali, come la glicosilazione. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo di precipitazione del calcio efficiente in termini di costi per la trasfezione transitoria di cellule HEK293T con Gzm umani clonati nel plasmide di espressione pHLsec. La purificazione del Gzm dal surnatante di coltura è stata ottenuta mediante cromatografia di affinità con nichel immobilizzato utilizzando il tag di poliistidina C-terminale fornito dal vettore. L'inserimento di un sito enterokinasi all'N-terminale della proteina ha permesso la generazione di proteasi attiva che è stata infine purificata mediante cromatografia a scambio cationico. Il sistema è stato testato producendo alti livelli di Gzm umano citotossico A, B e M e dovrebbe essere in grado di produrre praticamente ogni enzima nel corpo umano ad alte rese.

Nella seguente sezione presenteremo una documentazione completa di un preparato GzmA per illuminare il metodo. Abbiamo anche con successo purificati GzmB e GzmM, producendo risultati simili in materia di efficienza e l&#39;attività di depurazione. Tuttavia, da tali preparati più tardi mostreremo solo pochi pezzi selezionati di dati. Preparazioni GzmB dalle cellule 293T seguenti l&#39;attuale protocollo sono stati utilizzati in diversi studi pubblicati, mettendo in evidenza la loro attività in diversi sistemi di dosaggio...

Descriviamo qui un sistema di espressione granzima efficiente in termini di costi utilizzando cellule HEK293T che produce alte rese di proteasi pura, completamente glicosilata ed enzimaticamente attiva.

A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere alte rese di granzimi glicosilati con folicina e attivi dal punto di vista enzimatico nelle cellule renali embrionali umane 293T. Questo risultato si ottiene innanzitutto espandendo le cellule HEK 293T in apposite piastre per colture cellulari. La dimensione tipica della preparazione dopo l'espansione comprende da 20 a 25 piastre colturali.Il secondo passaggio consiste nel trasfettare transitoriamente le cellule espanse con un plasmide di espressione della granzima utilizzando il metodo efficiente del fosfato di calcio. Successivamente, si raccolgono i soprannatanti cellulari e le granzime secrete vengono purificate mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati. I passaggi finali prevedono l'attivazione delle granzime mediante trattamento con enterochinasi e un'ulteriore purificazione delle proteasi tramite cromatografia a scambio cationico.Infine, l'attività enzimatica viene testata utilizzando un saggio colometrico rapido e affidabile. Poiché la disponibilità di proteasi attiva in quantità sufficienti rappresenta un fattore limitante nella ricerca sui granzimi, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo, come la caratterizzazione di nuove vie di morte cellulare in diversi organismi o l'identificazione di nuovi substrati proteasici in approcci su proteoma intero per esprimere enzimi granzima. Per prima cosa, coltivare cellule HEC 293T in 20 millilitri di mezzo di coltura, utilizzando piastre da coltura tissutale di dimensioni 150 per 25 millimetri, dividendo le cellule al 80% di confluenza. Le cellule aderiscono in modo lasso, ma possono essere staccate meccanicamente senza tripsina, pipettando ripetutamente su e giù.Le cellule la notte precedente la trasfezione in modo da ottenere una confluenza del 60-70% il giorno della trasfezione. Una preparazione tipica comprende da 20 a 25 piastre di coltura. Un'ora prima della trasfezione, sostituire il mezzo di coltura standard con 20 millilitri di mezzo per la trasfezione; poco prima della fine del passaggio di incubazione di un'ora, mescolare 400 microgrammi di DNA plasmidico con 10,95 millilitri di acqua bidistillata e 1,55 millilitri di cloruro di calcio 2 molare in provette da 50 millilitri uno o due minuti prima della trasfezione.Aggiungere 12,5 millilitri di soluzione salina tampone due volte a 12,5 millilitri della soluzione di calcio-DNA, mescolando i tubi per inversione prima di incubare per 30 secondi. A temperatura ambiente, aggiungere questa miscela, goccia a goccia, direttamente sulle cellule, a una quantità di cinque millilitri per piastra, distribuendola uniformemente su tutta la superficie, fino a far assumere al mezzo un colore leggermente arancione. Incubare le piastre di coltura per sette-undici ore in un incubatore per colture cellulari.Dopo l'incubazione, è visibile un precipitato fine. Rimuovere il mezzo di trasfezione. Lavare delicatamente con PBS preriscaldato e aggiungere 20 millilitri di mezzo di coltura privo di siero, quindi incubare per 72 ore in un incubatore per colture cellulari. Analizzare l'efficienza di trasfezione ed espressione eseguendo un campione del sopranatante cellulare su gel SDS-PAGE e colorando con Coomassie.Blu brillante. Per visualizzare una banda di granzima. Dopo l'incubazione, versare i soprannatanti della coltura cellulare in provette da 250 millilitri e chiarificarli mediante centrifugazione.Eseguire una prima centrifugazione per eliminare il mezzo dalle cellule staccate. Trasferire il soprannatante in nuovi tubi da 250 millilitri e centrifugare a 4.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali residui cellulari rimanenti. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di cloruro di sodio, 6,25 millilitri di tris base e un millilitro di solfato di nichel, insieme a 250 millilitri di soprannatante chiarificato.Filtrare il soprannatante utilizzando un'unità di filtrazione a vuoto da 500 millilitri. Equilibrare una colonna di cromatografia per affinità con ioni metallici immobilizzati al nichel con il buffer di legame per istidina. A utilizzando un sistema FPLC adeguato.Quindi applicare il sopranatante chiarificato sulla colonna equilibrata a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto a quattro gradi Celsius. Dopo l'applicazione del sopranatante, lavare la colonna con il suo buffer di legame fino al raggiungimento della linea di base dell'assorbanza ultravioletta o UV. Eluire le granzimi con un gradiente lineare di ILE di 20 millilitri a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto, raccogliendo frazioni da due millilitri.Analizzare le frazioni eluciane mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione con Coomassie. Raccogliere le frazioni contenenti il grande enzima in un tubo da centrifuga. Conservare un piccolo campione a meno 20 gradi Celsius come controllo pre-enterochinasi.Aggiungere l'enterochinasi a 0,02 unità per 50 millilitri di sopranatante iniziale direttamente alla frazione raccolta nel tubo da dialisi e dializzare tutta la notte a temperatura ambiente nel buffer per enterochinasi. Il giorno successivo, analizzare la frazione trattata con la chinasi in confronto al controllo pre-enterochinasi mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione con blu di Comassie. Quando l'elaborazione del terminale N è completa.Cambiare il tampone di dialisi con tampone S A e dializzare per altre quattro ore a temperatura ambiente prima di filtrare l'ottavo DIALATE. Successivamente, equilibrare una colonna S con tampone S A. Caricare il campione sulla colonna a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto a quattro gradi Celsius dopo il caricamento del campione.Lavare la colonna con tampone S A fino al raggiungimento della linea di base dell'assorbanza UV. Eluire le granzimi con un gradiente lineare di cloruro di sodio di 30 millilitri: la granzima A eluisce a circa 650 millimolari di cloruro di sodio, la granzima B a circa 700 millimolari di cloruro di sodio e la granzima M a circa 750 millimolari di cloruro di sodio. Raccogliere le frazioni contenenti le granzimi e concentrarle fino a circa 100 micromolari utilizzando filtri centrifughi, aliquotare le preparazioni concentrate di granzima e conservarle a meno 80 gradi Celsius.Successivamente, analizzare le frazioni elluciane mediante elettroforesi SDS-PAGE e saggi colorimetrici; per eseguire i saggi colorimetrici, distribuire piccoli campioni di granzima provenienti da frazioni elluciane o da soluzioni concentrate in piastre a 96 pozzetti con fondo piatto, includendo un controllo positivo e un controllo negativo. Aggiungere 100 microlitri di buffer per il saggio a ciascun pozzetto.Incubare bene la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Infine, misurare la densità ottica a 405 nanometri mediante un lettore di micropiastre. Questo protocollo produrrà rese elevate di granzimi puri, come dimostrato da questo gel rappresentativo di elettroforesi SDS-PAGE colorato con kumasi, che mostra il granzima BE dalla colonna S.I granzimi ricombinanti mostrano un'attività simile a quella dei preparati nativi di proteasi, come mostrato in questo saggio colorimetrico che confronta l'attività del granzima B ricombinante e nativo. In modo importante, il trattamento con endo H indica che i granzimi prodotti nelle cellule HEC 2 93 T sono completamente glicosilati. I granzimi ricombinanti sono in grado di scindere substrati proteici macromolecolari, come dimostrato in questo saggio rappresentativo di scissione del granzima A che utilizza il substrato proteico batterico e UOCD.Qui, la banda corrispondente a N-O-U-C-D clivato scompare gradualmente all'aumentare della concentrazione della granzima. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre enzimi granzima completamente glicosilati e nella forma proattiva con rese elevate nelle cellule HK 2 93 T.

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nel periodo post-genomica umana, la disponibilità di proteine ​​ricombinanti in conformazione nativa è cruciale per la ricerca strutturali, funzionali e terapeutico e lo sviluppo. Qui viene descritto un test e larga scala sistema di espressione proteica in cellule renali embrionali umane 293T che possono essere utilizzati per produrre una varietà di proteine ​​ricombinanti.

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

L'espressione di proteine ricombinanti da parte dei sistemi dei mammiferi sta diventando un metodo attraente per la produzione di complessi proteici per la biologia strutturale. Qui presentiamo un sistema di espressione semplice ma altamente efficiente che utilizza cellule di mammifero cresciute in sospensione per purificare complessi proteici per studi strutturali.

Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

Descriviamo un semplice test colorimetrico quantitativo che misura specificamente l'attività proteolitica del Granzima B (GzmB) umano, di topo o di ratto. Questo protocollo può essere facilmente adattato per determinare l'attività proteasica di altre serina proteasi in granuli mediante l'idrolisi di altri substrati peptidici sintetici con un'appropriata sequenza di riconoscimento.

Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Espressione di proteine ​​della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l'espressione di proteine ​​della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine ​​rhoptry.

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Questo è un protocollo rapido ed economico per la produzione di proteine di mammifero glicosilate secrete e la successiva purificazione in un solo passaggio con rese sufficienti di proteine omogenee per la cristallografia a raggi X e altri studi biofisici.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

La purificazione dei canali ionici è spesso provocatorio, ma una volta raggiunto, potenzialmente può permettere le indagini in vitro delle funzioni e delle strutture dei canali. Qui, descriviamo le procedure graduale per l'espressione e purificazione delle proteine di mammiferi bestrophin, una famiglia di Ca2 +-attivato canali Cl– .

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

Forniamo protocolli scalabili che coprono la progettazione di costrutti, la trasfezione transitoria, l'espressione e la purificazione di varianti proteiche di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293.

Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria

La purificazione, la dialisi e l'attivazione di His-tag sono impiegate per aumentare le rese di espressione proteica del dominio catalitico solubile e a matrice attiva metalloproteinasi-3 nei batteri. Le frazioni proteiche vengono analizzate tramite gel SDS-PAGE.

Espressione batterica e purificazione della metalloproteinasi-3 della matrice umana mediante cromatografia di affinità

Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Scopri un sistema di espressione efficiente e a basso costo per produrre granzime umane glicosilate e attive in cellule HEK293T. Questo metodo ottimizza la resa per studi di biologia cellulare e applicazioni terapeutiche.

A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

Esplora altri video