Lettvinte og effektiv Utarbeidelse av Tri-komponent Fluorescent Glycopolymers via RAFT-kontrollerte Polymerisering

1Department of Biochemistry, University of Missouri, 2Department of Biological Sciences, University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri, 4Department of Child Health, University of Missouri
Chemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Syntetiske glycopolymers er instrumentale og allsidige verktøy som brukes i ulike biokjemiske og biomedisinske forskningsfelt. Et eksempel på en lettvint og effektiv syntese av velkontrollerte fluorescerende statistiske glycopolymers ved hjelp av reversible tilsetning-fragmentering kjedeoverførings (RAFT) -basert polymerisasjonen demonstrert. Syntesen begynner med fremstillingen av β-galaktose-holdige glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrylamid oppnådd ved omsetning av lactobionolactone og N - (2-aminoetyl) metakrylamid (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metakrylamid (GAEMA) benyttes som en strukturell analog mangler en terminal β-galaktosid. Den følgende RAFT-mediert kopolymerisasjonsreaksjonen omfatter tre forskjellige monomere: N - (2-hydroksyetyl) akrylamid som spacer, AEMA som target for videre merking fluorescens, og glycomonomers. Tolerant for vandige systemer, flåten middel som anvendes i reaksjonen er (4-cyanopentansyre) -4-dithiobenzoate.Lave dispersities (≤1.32), forutsigbare kopolymermaterialer, og høy reproduserbarhet polymerisasjonene ble observert blant produktene. Fluorescent polymerer oppnås ved å endre glycopolymers med karboksyfluorescein succinimidylester rettet mot de primære amin funksjonelle grupper på AEMA. Lectin-binding som særpreger de resulterende glycopolymers er verifisert ved å teste med tilhørende agaroseperler belagt med spesifikke glycoepitope erkjenner lektiner. På grunn av den enkle syntese, tett kontroll av produktsammensetninger og god reproduserbarhet av reaksjonen, denne protokollen kan oversettes til fremstilling av andre flåten baserte glycopolymers med spesifikke strukturer og sammensetninger, som ønsket.

Introduction

I de siste to tiårene, har undersøkelser med syntetiske glycopolymers gått sakte men kontinuerlig utvikling, noe som viser et betydelig potensial i å undersøke smittemekanismer som inkluderer forskning som fokuserer på lektin anerkjennelse behandler 1-3. Siden syntetiske glycopolymers innehar multivalente sukkerdeler utviser mye høyere lectin-binding efficacies, sammenlignet med monovalente karbohydrater, er de av stor etterspørsel i Glycobiology felt 3. Av særlig interesse i klinisk forskning er bruken av fluorescerende glycopolymers å karakterisere lektin-mediert bakteriell binding med karbohydrater som er tilgjengelige på humane luftcelleoverflater og slim-glykoprotein. Tidlig i vitro studier anvendes kommersielt tilgjengelige polyakrylamidprodukter basert glycopolymers i bakterie bindende tester. Flere av disse probene viste lovende resultater, men reist bekymringer om, obtainability, og lot-til-lot variasjoner i både polYmer molekylvekt og glycoepitope innhold. En økonomisk in-laboratoriet protokollen ble utviklet som ville sørge for en tilfredsstillende kontroll av struktur innhold, størrelse og renhet av syntetiske glycopolymers rettet mot bakterielle lektiner.

På leting etter et egnet syntetisk tilnærming til glycopolymers ble en relativt ny polymerisasjonsteknikk testet ved hjelp av en type kontrollert radikalpolymerisering at ansatt reversible tillegg-fragmentering kjedeoverføring (flåte) agenter fire. Slike Raft reagenser har nylig blitt brukt i et par glycopolymer forberedelser 5-7. Sammenlignet med andre glycopolymer fremstillings protokoller, flåte-mediert polymerisasjoner viser flere fordeler, blant annet toleranse for en rekke monomere strukturer og reaksjonsbetingelser, mulige kompatibilitet med vandige oppløsninger, og lav dispersitet størrelsen av de ønskede polymere produkt 8,9. Av bemerkelsesverdige interesse er protokoller for utarbeidelse av RAFT-baaliserte tri-komponent glycopolymers, slik at kontroll av sammensetninger av forskjellige monomerer, som hver kan ha forskjellige funksjoner 10-13. Men de fleste av de tidligere forsknings bestrebelser enten manglet anomere anheng 10 karbohydrater, eller anvendes trappet polymerisasjoner som resulterer i tri-blokk-kopolymerer, som består av kovalent koblede homopolymerer, som ofte tjener forskjellige formål enn statistiske polymerer som er kopolymerer hvori sekvensen av monomeren rester følge en statistisk regel 9-13.

Nylig har anvendelse av den thiocarbonylthio RAFT forbindelse (4-cyanopentansyre) -4-dithiobenzoate i et vandig miljø, ved fremstilling av en gruppe av RAFT-baserte lineære tri-komponent statistiske glycopolymers inneholder bestemte anheng sukkere og deres anvendelse i bakterielle lectin-mediert binding tester ble rapportert 14. Det overordnede målet med denne metoden, presentert på en visuell måte, er å forberede tri-komponentstatistiske fluorescerende glycopolymers via RAFT-kontrollerte kopolymeriseringen. På grunn av den enkle av den ett-trinns polymerisering protokollen, den god kontroll over polymeren lengde og sammensetninger, og høy reproduserbarhet av reaksjonen, denne protokollen kan lett anvendes på andre flåte-baserte synteser av glycopolymers med ønskede strukturer.

Protocol

1. Syntese av Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl metakrylamid

  1. Løs opp 2 g laktobionsyre i 3,0 ml vannfri metanol og sakte legge absolutt etanol i en dråpe klok måte til løsningen bare slår skyet, deretter fjerne løsemidler via rotoevaporation.
  2. Løs opp rester, fra trinn 1.1, i 3,0 ml vannfri metanol og, igjen, sakte legge absolutt etanol før like skyet, da fordamper løsemidlene via rotoevaporation. Gjenta dette trinnet tre ganger for å få lactobiono-1,5-lakton (1,94 g, 98% utbytte). Dette produkt er av tilstrekkelig renhet til å brukes i de følgende reaksjoner.
  3. Tilsett 1,0 g av lactobionolactone i 3,0 ml metanol til N - (2-aminoetyl) metakrylamid (AEMA, 0,58 g) og hydrokinonmonometyleter (MEHQ, 1,0 mg), en inhibitor av selv-polymerisasjon, i 2,0 ml metanol etterfulgt av 1,0 ml trietylamin. Omrør ved RT i 48 timer.
  4. Tilsett 20 ml avionisert H 2 O (dH 2
  5. For å fjerne eventuelle gjenværende laktobionsyre, tilsett 20 ml dH 2 O, deretter passerer den vandige løsningen gjennom en anionbytterkolonne (OH - form, 10 mm x 20 mm) til et mottakende begerglass inneholdende 1,0 mg av MEHQ.
  6. Fjerne trietylamin, fremstilt i trinn 1.5, ved fordampning til tørrhet via rotoevaporation.
  7. Tilsett 20 ml dH 2 O og fjerne uomsatt AEMA ved langsom tilsetning av 1 mg alikvoter av kationbytteharpiks (H + form) inntil intet ninhydrin reaktive materialer kan påvises. Overvåke fjerningen ved å ta 1 pl delmengder av oppløsningen etter hvert resin tillegg påføre den til et tynnsjiktkromatografi plate, og deretter sprøyting plate med en 2% ninhydrin i etanol-løsning. Når ingen dyp blå farge er observert å utvikle seg når platen oppvarmes til 90 ° C i 1 min, og sluttpunktet er nådd.
  8. Fjern MEHQ fra prøven ved å oppløse det frysetørkede materiale i en minimal mengde av metanol (~ 0,5 ml), og deretter legge kald vannfri aceton (-20 ° C, 15 ml) for å utfelle produktet. Oppsamle bunnfallet ved filtrering under anvendelse av en frittet glasstrakt, tørk deretter utfellingen i en eksikator under vakuum for å oppnå 2-lactobionamidoethyl metakrylamid (LAEMA) som et off-white pulver (0,94 g, 68% utbytte). Dette produkt er av tilstrekkelig renhet til å brukes i de følgende reaksjoner.

2. Syntese av Monomer 2-Gluconamidoethyl metakrylamid

Merk: Utarbeidelse av 2-gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA), som ikke er i besittelse et anheng sukker, ble tilpasset fra en publisert metode 15.

  1. Tilsett 2,0 g AEMA oppløst i 10 ml metanol til en oppløsningD-glukonolakton (1,6 g) i 30 ml metanol og under omrøring, tilsett langsomt 1,6 ml trietylamin.
  2. Omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 24 timer.
  3. Filtrer det utfelte produkt ved hjelp av et frittet glasstrakt og skyll bunnfallet tre ganger med 10 ml hver av isopropanol, vaskes deretter med 10 ml tørr aceton. Tørk det utfelte produkt i en eksikator under vakuum.

3. RAFT Glycopolymer Synthesis

  1. For å fjerne inhibitoren MEHQ tilstede i kommersielle N - (2-hydroksyetyl) akrylamid (HEAA), tilsett 1 ml HEAA til et 2 ml mikrosentrifugerør, etterfulgt av tilsetning av 0,5 g av aluminiumoksid nanopartikler. Sentrifuger røret ved 300 xg i 30 sek, og bruke det øverste laget HEAA i den følgende reaksjon.
  2. Legge nøye 32,8 mg LAEMA (70,0 umol), 1,7 mg of AEMA (10,5 umol) og 27,5 ul av HEAA (270 umol), alle oppløst i 0,4 ml dH 2 O, til en godt rengjort 1 ml Schlenk-rør, og dermed ha en monomer molforhold fra 20: 3: 77.
  3. I en parallell reaksjon, for å produsere kontroll polymerer som ikke har noen anheng sukker, i stedet for å bruke LAEMA i trinn 3.2, substituere 21,4 mg GAEMA (70,0 umol) i reaksjonen.
  4. Til den respektive Schlenk-rør (dvs. 3,2 eller 3,3), sekvensielt tilsett 50 ul av DMF inneholdende 0,53 mg av (4-cyanopentansyre) -4-dithiobenzoate (1,9 umol, flåte middel), og 50 ul av DMF inneholdende 250 ug 4,4'-azobis- (4-cyanvaleriansyre) (0,9 mikromol, initiator). Bland forsiktig med finger tapping.
  5. Fryse innholdet som finnes i Schlenkrøret ansette en tørris: etanol bath (75 g tørris i 100 ml etanol), bruke en støvsuger til innen 10-50 mTorr, lukk deretter Schlenk ventilen og tillate løsningen å sakte tine til RT . Gjenta dette fryse evakuere-tine syklus to ganger mer. Sørg for at alle reagenser blir oppløst etter den siste tine.
  6. Plasser Schlenkrøret inn i en lukkbar bag, evakuere posen luft, og deretter forsegle det. Overfør posen med Schlenk-rør i et forvarmet vannbad på 70 ° C og inkuberes i 24 timer.
  7. Overføre forsiktig oppløsningen i Schlenk-rør til en forberedt dialysepose (MWCO = 3500) og dialyser mot dH 2 O (10 x 2 liter) i 24 timer, endring av dH 2 O hver time i de første 8 timer. Etter dialyse overføre prøven fra dialyserøret til et prøverør, fryse prøven ved -80 ° C, og deretter lyofilisere den.

Merk: Det resulterende statistisk poly-akrylamid / akrylamid (PMA) kopolymerer inneholdende pendante 4- O -β-D-galaktopyranosyl-D-gluconamide (lactobionamide) (fra trinn 3.2) eller D-gluconamide (fra trinn 3.3), respektivt, er innhentet. For å lette diskusjonen, er disse to glycopolymers forkortet til PMA-LAEMA og PMA-GAEMA, respektivt.

4. Post-modifisering av Glycopolymers med fluorophores

  • Oppløs 5,0 mg glycopolymer PMA-LAEMA eller PMA-GAEMA ~ inneholdende 0,9 pmol av primære amin-funksjonelle grupper i 0,9 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS, 0,1 M natriumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,5), henholdsvis.
  • Tilsett langsomt 0,6 mg karboksyfluorescein succinimidylester i 100 pl DMF til de løsninger med hurtig omrøring. Rør forsiktig reaksjonene i 16 timer i mørke ved RT.
  • Under beskyttelse mot lys, laste prøven inn i et forberedt dialyserør (MWCO = 3500) og dialyser mot dH 2 O (2 L) i 16 timer, endring av dialyseoppløsning hver time for de første 8 timer. Etter dialyse overføre prøven fra dialyserøret til et prøverør, fryse prøven ved -80 ° C, og deretter lyofilisere den.
  • Merk: Etter lyofilisering, fluorescerende glycopolymers PMA-LAEMA-fluorescein og PMA-GAEMA-fluorescein, henholdsvis blir oppnådd.

    5. Karakterisering av det Glykopolymerer

    1. Bestem den antallsmidlere molekylvekt (M n), den vektmidlere molekylvekt (Mw) og dispersitet (Mw / Mn) av glycopolymers på et kommersielt HPLC-system utstyrt med gelpermeasjonskromatografi (GPC) programvare, en GPC kolonne egnet for molekylvekten av interesse, og en brytningsindeks-detektor, ved hjelp av 0,1 M tris / 0,1 M natriumklorid (pH 7) som elueringsmiddel ved en strømningshastighet på 0,6 ml / min 14. Bruk polyetylenglykol-standarder som molekylvektstandarder (MW: 200-1,200,000 g / mol).
    2. Kvantifisere faktiske konsentrasjoner av primær amin-funksjonelle grupper innenfor glycopolymers 16. Analyser totale karbohydratinnholdet i de syntetiserte glycopolymers i henhold til en publisert fremgangsmåte 17.
    3. Utføre tester av strukturelle sammensetning og renhet av glycomonomers LAEMA, GAEMA og glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA i D 2 O ved NMR-spektroskopi 14.

    6. Binde Tester av de syntetiske Glycopolymers med Lektin belagt agaroseperler

    1. Tilsett 1,5 ml PBS til 50 mL av suspensjon av Erythrina Crista-galli lectin (ECL) -belagte agaroseperler, sentrifuger ved 300 xg i 1 min, og fjern forsiktig og kast supernatanten. Gjenta denne fremgangsmåten to ganger, og deretter resuspender kulene i 0,5 ml PBS.
    2. Tilsett 3 ug av PMA-LAEMA-Fluorescein eller PMA-GAEMA-Fluorescein (negativ kontroll) i 6 mL PBS til kulene suspensjonen, og inkuber blandingene, i mørket, ved RT i 1 time.
    3. Vask blandingen med 1,5 ml PBS tre ganger, og resuspender kuler i 0,2 ml PBS. Legge en delmengde (4 pl) i en brønn på en immunfluorescens objektglass (teflonbelagt), dekk med et dekkglass, og observere ved fluorescens mikroskopi ved hjelp av en FITC filter (eksitasjonsbølgelengde: 467-498 nm, emisjon bølgelengde: 513- 566 nm) og et 10X objektiv for å undersøke bindingen av than fluorescerende glycopolymers med perler 14.

    Representative Results

    Syntese av glycomonomer

    Laktobionsyre ble benyttet heri som et eksempel for fremstilling av glycomonomers. Ved bruk av metoder i det første rapporten på syntesen av LAEMA 11, ble variert utbytter ved fremstillingen med utilfredsstillende renhet observert. Den modifiserte rensemetode ved hjelp av kation- og anion-bytterharpikser for å fjerne uomsatt utgangsmateriale tilbudt stabilt produkt utbytte og med høy renhet, noe som er bekreftet ved 1H og 13C NMR-spektroskopi (figur 1).

    RAFT glycopolymer syntese og post-modifisering av glycopolymers med fluorophores

    I motsetning til den blokk glycopolymers fremstilt gjennom avtrappede flåten polymerisasjoner, gir denne en-trinns kopolymerisering protokollen en ensartet glycomonomer fordeling gjennom polymer-ryggraden. De glycopolymers vist her inneholder 20 mol% av glycomonomer, 77 mol% av HEAA som et avstandsstykke, og 3 mol% av AEMA som et mål for post-modifikasjoner (se figur 2). 1H- og 13C-NMR-spektroskopi bekreftet strukturene til PMA-LAEMA og PMA-GAEMA (figur 3 og 4). Som vist i figur 5, når plottet mot GPC elueringsprofiler av glycopolymer syntetisert uten flåte, både PMA-LAEMA og PMA-GAEMA har lave dispersities, noe som viser effekten av flåten tilnærming. Som ventet, har PMA-GAEMA en Mn mindre enn for PMA-LAEMA grunn av PMA-GAEMA mangel på en pendant sukker. Analyse av karbohydrater og primære amin-funksjonelle grupper innhold av flåten glycopolymers avslørte at forholdet mellom monomerene i produkt glycopolymers er konsistent med det støkiometriske forhold av utgangs monomerer som anvendes i flåten-mediert polymerisasjonsreaksjonen (tabell 1). Dette innebærer en streng kontroll av monomeren compositions i syntetiserte glycopolymers, som utformet.

    Omsetning av primære amin-funksjonelle grupper med aktiverte fluoroforer er et utbredt teknikk i protein merking. Denne teknikken ble ansatt her å merke rensede glycopolymers med karboksyfluorescein. Etter post-modifikasjon, ble fluorescerende polymerer oppnådd (figur 6). Ingen degradering av fluorescein-merkede polymerer i reaksjonen ble påvist ved GPC-analyse (data ikke vist).

    Bindende tester av de syntetiske glycopolymers med lektin-belagt agaroseperler

    For å vurdere lektin-bindende spesifisitet av de syntetiserte glycopolymers, ble lectin-belagte agaroseperler med kjent bindingsspesifisitet karbohydrat anvendes. Erythrina crista-galli lectin (ECL), som anvendes i forsøkene, er en bindende spesifisitet mot β-D-galaktosid. Figur 7A viser klart at PMA-LAEMA-Fluorescein, som inneholder β-D-galaktosid som en pendant karbohydrat, oppviste sterk binding med ECL lektin. I motsetning til dette, den negative binding til ECL av glycopolymer PMA-GAEMA-Fluorescein, som ikke har en pendant sukker, er vist i figur 7B. Dette resultatet eksemplifiserer bindingen effektivitet og affinitet av den syntetiserte fluorescerende glycopolymer.

    Figur 1
    Figur 1. Tildelte en H- (a) og 13C-NMR (b) spektra (D 2 O) for LAEMA. (Dette tallet har blitt forandret fra Wang et al. 14) Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

    <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "always"> Figur 2
    Figur 2. Skjematisk illustrasjon av syntesen av fluorescerende glycopolymer PMA-LAEMA inneholder β-galaktosid som anheng sukker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3. Tilordnet 1 H- (A) og 13C-NMR (B) spektra (D2O) for PMA-LAEMA glycopolymer. (Dette tallet er blitt modifisert fra Wang et al. 14) PåstandSE Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4. Assigned en H- (A) og 13C-NMR (B) spektra (D 2 O) for PMA-GAEMA. (Dette tallet har blitt forandret fra Wang et al. 14) Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

    Figur 5
    Figur 5. gelpermeasjonskromatografi spor av RAFT-baserte PMA-GAEMA og PMA-LAEMA fremstilt med og uten anvendelse av RAFT middel. I motsetning til PMA-LAEMA fremstilt uten RAFT middel (blå), RAFT- baserte PMA-LAEMA (grønn) har en mye lavere dispersitet (Mw / Mn). RAFT-baserte PMA-GAEMA (rød) og PMA-LAEMA har lignende GPC profiler, men den tidligere har en mindre M n på grunn av fravær av noen anheng sukker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6. PMA-LAEMA før og etter post-modifisering med fluorophore. (A) Sammenlignet med hvit non-merket glycopolymer (venstre tube), viser fluorescein-merket PMA-LAEMA en sterk gul farge (høyre tube). (B) Under UV, ikke-merkede PMA-LAEMA (venstre rør, 1 mg / ml i PBS) er mørke og presenterer med ingen fluorescens, mens fluorescein-merket PMA-LAEMA (høyre rør, 1 mg / ml i PBS), viser sterk grønn fluorescens.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 7
    Figur 7. Erythrina crista-galli lectin (ECL) -belagte agarosekuler binde β-D-galaktosid holdige glycopolymers, og ikke de som ikke besitter en pendant sukker. (A) PMA-LAEMA-Fluorescein (3 pg) viste en sterk binding med ECL , mens i (B) PMA-GAEMA-Fluorescein, som besitter ingen anheng β-D-galaktosid rest, viste ingen binding med lectin-belagte kuler. Scale bar = 100 mikrometer.

    Tabell 1. målrettingsverdiene en av syntetiske parametre og faktiske sammensetninger av glycopolymers. A) Targeting verdier, verdier somer ønsket av produktene; b) DP, grad av polymerisasjon; c) NA, ikke tilgjengelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    DP b Dispersitet Selve innholdet i glycomonomers
    mol%
    Faktiske innholdet av primært amin
    mol%
    Målretting verdier 100 <1.3 20 3
    PMA-LAEMA 99 1,26 19 3.2
    PMA-GAEMA 89 1,32 NA c 2.7

    Discussion

    En lettvint og effektiv protokoll for RAFT-baserte tri-komponent fluorescerende glycopolymers, med og uten et anheng karbohydrat, og deres anvendelse i et lektin-bindingstest, er vist i denne rapporten. Protokollen starter med utarbeidelse av glycomonomers LAEMA og GAEMA. Gjennom en ett-trinns RAFT-kontrollerte kopolymeriseringen, glycopolymers med reproduserbar yield, forutsigbar monomersammensetningen og lav dispersitet, oppnås. Etter post-modifikasjon av glycopolymers med karboksyfluorescein succinimidylester, binding av det resulterende respektive fluorescensmerkede glycopolymer er lett kan testes for sin lektin-bindende spesifisitet.

    I de innledende trinnene av preparative glycomonomers som skal anvendes i de etterfølgende synteser glycopolymer, var lett tilgjengelig laktobionsyre og glukonolakton utnyttet. I teorien, noen karbohydrater av interesse, fra monosakkarider til komplekse oligosakkarider, kan være converted til glycomonomers ved å konjugere målet sukker på den primære hydroksylgruppe på C6 av glukose. Etter oksydasjon av den reduserende glukoserest, og påfølgende dehydrering til et lakton, kan produktet da være lett omsettes med det primære amin på AEMA for å danne den tilsvarende glycomonomer. Ytterligere eksempler på denne ruten kan sees i en fersk rapport 14. Det skal bemerkes at før oppstart av en hvilken som helst polymerisasjonstrinn, MEHQ, en potent polymerisasjonsinhibitor, må fjernes fra alle monomer og glycomonomer preparater like før bruk. Dette oppnås lett ved hjelp av den minimale mengde metanol for å oppløse glycomonomer som besitter MEHQ deretter umiddelbart behandle det med aceton ved -20 ° C for å felle ut inhibitor-frie produkt i høyt utbytte.

    Essensielt i enhver radikalpolymerisering ordningen, er fokus på detaljer og monomere renhet vektlagt. Som er typisk for en flåte polymerisasjonssystem, det består avet radikal kilde, en flåte reagens, en monomer og løsningsmiddel. I denne visualisert presentasjonen, er en enkelt-trinns polymerisasjon RAFT system er beskrevet som fokuserer på fremstilling av statistiske kopolymerer som er generert fra en reaksjonsblanding som innehar tre forskjellige monomere i en vandig oppløsning. To separate flåte-medierte reaksjoner er presentert i hvilken man anvender en glycomonomer som besitter en pendel, ikke-reduserende karbohydrat-terminus (dvs. β-D-galaktose), og den andre, som har en polyol med ingen bundne karbohydratrester. Felles for begge flåte-medierte reaksjoner var monomerer som har et flertall hydroksylgruppe som fungerer som et avstandsmolekyl, og en annen besitter en fri amin for post-modifikasjon med en amino-reaktiv fluoroforen.

    Siden tilstedeværelsen av oksygen i reaksjonsblandingen og miljø er skadelig å flåte-mediert polymerisasjon, er dens fjerning til spornivåer kan lett oppnås via flere fryse-evaCuate-tine-sykluser under opprettholdelse av Schlenk-rør reaksjonsbeholderen under høyvakuum.

    Det bør bemerkes at det molare forhold av forskjellige monomerer i reaksjonsblandingen kan justeres etter behov. Også, ved å variere mengden av RAFT middel, lengden av de resulterende polymerer kan kontrolleres 18. Imidlertid bør det molare forhold av flåten middel initiator alltid være større enn to for å sikre den lave dispersitet av produktet. Under disse betingelser er utviklingen av kopolymerisasjonen jevn, og reproduserbarheten av reaksjonen er svært høy. Når det er sagt, er det lite sannsynlig at man får en helt jevn fordeling av alle monomerer som deltar i en statistisk kopolymer, på grunn av deres forskjellige polymerisasjonsprosesser hastigheter. Karakteriserer fordelingen av forskjellige monomerer i polymeren fremdeles er meget krevende.

    Den post-modifikasjon metoden, som presenteres her, er både enklere og mer amenable til bruk av et bredere utvalg av fluorescerende markører, sammenlignet med andre protokoller påføres etiketten glycopolymers 2,11. Disse vil inneholde mange av de vannløselige amin-reaktive fluoroforer, kvanteprikker, biotins, og andre. De bindingsspesifisiteter av de syntetiserte, merket glycopolymers er lett kontrollerbar bruker lektiner med kjente bindingsaffiniteter. PMA-GAEMA innehar ingen anheng sukker er en egnet negativ kontroll. Glycopolymers med ulike fluorescerende etiketter fremstilt via denne ruten har blitt brukt i undersøkelser av lektin-mediert bakteriell binding 14. Som presentert, bør dette lettvint og effektiv fremstilling av statistiske fluorescerende glycopolymers gir et stort potensiale for et bredt spekter av glycobiological forskning.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9, (8), 757-764 (1999).
    2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33, (28), 6889-6897 (2012).
    3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. Wang, B., Boons, G. .-J. John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).
    4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49, (5), 1079-1131 (2007).
    5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45, (11), 2059-2072 (2007).
    6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7, (1), 232-238 (2006).
    7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
    8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
    9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
    10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20, (5), 994-1001 (2009).
    11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42, (17), 6393-6405 (2009).
    12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1503-1512 (2011).
    13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213, (17), 1768-1782 (2012).
    14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31, (2), 133-143 (2014).
    15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47, (2), 614-627 (2009).
    16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1690-1699 (2011).
    17. Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. CRC Press. 87-170 (1989).
    18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37, (24), 8941-8950 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics