Un modèle de course thrombotique Basé sur cérébrale transitoire hypoxie-ischémie

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Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

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Abstract

la recherche de l'AVC a subi de nombreux revers dans la traduction de thérapies neuroprotectrices dans la pratique clinique. En revanche, la thérapie du monde réel (tPA thrombolyse) produit rarement des avantages dans des modèles expérimentaux basés mécaniques occlusion, qui dominent la recherche préclinique de course. Cette scission entre le banc et chevet suggère la nécessité d'employer des modèles tPA-sensibles dans la recherche préclinique de course. À cette fin, un modèle d'accident thrombotique simple et tPA-réactive est inventé et décrit ici. Ce modèle consiste en une occlusion transitoire de l'artère carotide commune unilatérale et la livraison de 7,5% d'oxygène à travers un masque de visage chez la souris adulte pour 30 min, tout en maintenant la température rectale des animaux à 37,5 ± 0,5 ° C. Bien que la ligature réversible de l'artère carotide ou une hypoxie unilatéral supprimée chaque débit sanguin cérébral seulement de manière transitoire, la combinaison des deux injurieux provoqué une durée déficits de reperfusion, de la fibrine et le dépôt de plaquettes et une grande Infarct sur le territoire de l'artère cérébrale moyenne fournie. Surtout, la queue veineuse injection de tPA recombinant à 0,5, 1 ou 4 heures post-Thi (10 mg / kg) a fourni la réduction du temps-dépendante du taux de mortalité et la taille de l'infarctus. Ce nouveau modèle de course est simple et peut être normalisée dans les laboratoires de comparer les résultats expérimentaux. De plus, il induit la thrombose ou sans introduction d'emboles craniectomy préformés. Compte tenu de ces avantages uniques, le modèle Thi est un complément utile au répertoire de recherche sur l'AVC préclinique.

Introduction

Thrombolyse et recanalisation est la thérapie la plus efficace de l'AVC ischémique aigu dans la pratique clinique 1. Cependant, la majorité des recherches de neuroprotection préclinique a été effectuée dans un modèle transitoire mécanique d'obstruction (intraluminal suture d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne) qui produit une récupération rapide de la circulation sanguine cérébrale après le retrait de l'occlusion vasculaire et montre peu ou pas d'avantages par tPA thrombolyse. Il a été suggéré que le choix douteux de modèles d'AVC a contribué, au moins en partie, à la difficulté de traduire la thérapie neuroprotectrice aux patients 2,3. Par conséquent, il est une demande croissante pour l'emploi de modèles d'AVC thromboembolique tPA-sensibles dans la recherche préclinique, mais ces modèles ont aussi des problèmes techniques (voir Discussion) 4-7. Nous décrivons ici un nouveau modèle d'accident thrombotique fondée sur hypoxique-ischémique (THI) insulte transitoire unilatérale et ses réponses à la thérapie intraveineuse tPA 8.

Le modèle de course Thi a été développé sur la base de la procédure Levine (de ligature permanente de l'artère carotide commune unilatérale suivie d'une exposition à l'hypoxie transitoire dans une chambre) qui a été inventé pour des expériences avec des rats adultes en 1960 9. La procédure Levine originale tombe dans l'oubli parce il ne produit des dommages au cerveau variables, mais la même insulte causée neuropathologie cohérente chez les petits rongeurs quand il a été ré-introduit par Robert Vannucci et ses collègues comme un modèle de néonatale encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE) en 1981 10. Au cours des dernières années, certains enquêteurs ré-adapter le modèle Levine-Vannucci à des souris adultes en ajustant la température dans la chambre 11 hypoxique. Il est plausible que les lésions cérébrales incompatibles dans la procédure Levine origine peuvent résulter de fluctuations de température du corps des rongeurs adultes dans la chambre hypoxique. Pour tester cette hypothèse, nous avons modifié la procédure Levine en administrant gaz hypoxiqueà travers un masque, tout en maintenant la température à coeur de rongeur à 37 ° C sur la table chirurgicale 12. Comme on s'y attendait, le contrôle de la température du corps rigoureux considérablement augmenté la reproductibilité de la pathologie induite par HI-cérébrale. L'insulte HI déclenche également la coagulation, l'autophagie et de gris et de blessures 13 matière blanche. D'autres chercheurs ont également utilisé le modèle de HI pour enquêter post-AVC réponses inflammatoires 14.

Une caractéristique unique du modèle de course de HI est qu'il suit de près la triade de l'Virchow de la formation de thrombus, y compris la stase du flux sanguin, lésions endothéliales (par exemple à cause du stress oxydatif HI-induite), et hypercoagulabilité (activation plaquettaire HI-induite) ( Figure 1A) 15. En tant que tel, le modèle de HI peut capturer des mécanismes physiopathologiques pertinents pour AVC ischémique dans le monde réel. Avec cette idée en tête, nous avons affiné le modèle HI avec ligature réversible de l'ONUilateral artère carotide commune (donc de créer une insulte HI transitoire), et testé ses réponses aux tPA thrombolyse avec ou sans edaravone. Edaravone est un piégeur de radicaux libres déjà approuvé au Japon pour traiter l'AVC ischémique dans les 24 heures de l'apparition 9. Nos expériences ont montré que aussi brève que 30 minutes transitoire HI déclenche myocarde thrombotique, et que le traitement combiné tPA-edaravone confère des avantages synergiques 8. Nous décrivons ici les procédures chirurgicales détaillés et des considérations méthodologiques du modèle Thi, qui peuvent être utilisés pour optimiser les traitements de reperfusion de l'AVC ischémique aigu.

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Protocol

Ce protocole est approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université Emory et suit les Instituts nationaux de la directrice de Santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Configuration

  1. Préparer le lit chirurgicale sur coussin chauffant relié avec pompe à chaleur à 37 ° C pendant au moins 15 min avant la chirurgie. Placez un rouleau de cou à l'aide du canon de seringue de 3 ml sur le lit chirurgical. Préparer le gaz d'anesthésie avec 2% d'isoflurane dans l'air médical.
  2. Préparer pince autoclaves, des ciseaux, porte-aiguilles, micro hémostatique, des cotons-tiges et des sutures. Préparer colle tissulaire et pommade ophtalmique.
  3. Mettre en place le système de l'hypoxie et régulateurs de température avec une lampe de chauffage et sonde rectale. Préparer gaz de l'hypoxie avec 2% d'isoflurane dans 7,5% O 2 pondérées par 92,5% de N 2.
  4. Une heure avant la chirurgie, les souris sont analgesized par injection sous-cutanée d'une libération lente Meloxicam (4,0 mg / kg).
<p class = "jove_title"> 2. Cérébrale transitoire hypoxie ischémie (figure 1B)

  1. Anesthésier vieille 10-13 semaines C57BL mâle / 6 souris pesant 22 à 30 g dans la chambre de l'induction de l'anesthésie avec 3% d'isoflurane avant que l'animal ne répond pas aux pieds squeeze, puis enlever les poils sur le cou droite en utilisant un rasoir électronique.
  2. Placez la souris sur le lit chirurgicale reliée à 2% d'isoflurane dans l'air médical au taux de 2 L / min. Forelimbs sécurisés tendus le long rouleau de cou à l'aide de ruban adhésif médical côtés.
  3. Nettoyez le site chirurgical pour incision avec de la bétadine suivie par l'alcool et puis des cotons-tiges.
  4. Sous microscope à dissection, faire une incision de 0,5 cm à droite du col à l'aide d'une pince droite et un micro ciseaux environ 0,2 cm latérales de la peau de la ligne médiane.
  5. Utilisez une paire de pince fine dentelées à séparer le fascia et le tissu pour exposer le droit artère carotide commune (CRAC). Soigneusement séparer le CRAC du nerf vagal en utilisant une paire de pince fine lisses.
  6. Direct knot deux prédécoupé 5-0 suture de soie (amovible) sur le CRAC, puis recoudre la peau en utilisant 4-0 Nylon suture monofilament (figure 1C).
  7. Appliquer une pommade oculaire des deux yeux pour prévenir la sécheresse.
  8. Transférer rapidement les souris au système de l'hypoxie et de mettre le nez et la bouche en face-masque avec 2% d'isoflurane dans 7,5% d'O 2 au taux de 0,5-1 L / min pendant 30 min.
    1. Au cours de l'hypoxie, utiliser des régulateurs de température avec des lampes de chauffage pour contrôler la température rectale à 37,5 ± 0,5 ° C. Surveiller la fréquence respiratoire à 80-120 respirations / min. Le maintien de la température du corps au-dessus de 37 ° C au cours de l'hypoxie est important de créer cohérent infarctus cérébral. Fréquence respiratoire basse arrive généralement après 20 min hypoxie. Retirez le masque de protection et de permettre l'alimentation en air normal si la fréquence respiratoire chute en dessous de 40. Cela prend 1-2 min et ne compte pas dans la durée de l'hypoxie 30 min.
  9. Après l'hypoxie, transférersouris à un lit chirurgical et libérer les deux sutures du CRAC. Fermer la plaie avec de la colle de tissu, puis retourner la souris à la cage. Exclure les animaux si les deux des deux noeuds en direct sont de façon inattendue libérés après l'hypoxie.
  10. Surveiller les souris pour 5-10 minutes pour se remettre de l'hypoxie et l'anesthésie. Placez les aliments mouillés dans la cage et le retourner au centre de soins aux animaux.
    Remarque: Les animaux présentant légère à sévère comportement d'approche indirecte à 24 h après Thi sont corrélés avec le cerveau infraction. La plupart des animaux présentant des symptômes épileptiques meurent avant l'timepoint 24 heures après Thi.

3. laser speckle imagerie de contraste

Note: Bien que ce soit pas une procédure essentielle du modèle Thi, une granularité laser système d'imagerie de contraste en deux dimensions 16 peut être utilisé pour caractériser les changements de débit sanguin cérébral (CBF) pendant ou après l'hypoxie-ischémie transitoire. Pour documenter les modifications de CBF sous Thi, fiche immédiatement après la stEP 2.6. Alternativement, comparer le rétablissement CBF après Thi insulte, ces procédures peuvent être effectuées après l'étape 2.10.

  1. Passer une souris anesthésiée en position couchée et effectuer un 1 cm de long incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne impressionnés, mais non ouvert.
  2. Surveiller CBF dans les deux hémisphères cérébraux sous un imageur d'écoulement du sang selon le protocole du fabricant et commencer l'enregistrement du débit sanguin cérébral immédiatement après la chirurgie de la CCAO (étape 2.6). Continuer pendant 50 min.
  3. Voir l'image CBF avec des unités arbitraires dans une palette de 16 couleurs et d'analyser en temps réel les régions sélectionnées en utilisant le logiciel MoorFLPI suivant les instructions du fabricant (figure 2).
  4. Après l'enregistrement de l'image CBF, fermer le cuir chevelu avec de la colle tissulaire et le réexpédier vers la cage.

4. administration du tPA

  1. Injecter animaux à la veine de la queue avec le solvant ou 10 mg / kg tPA recombinant (220-300 &# 956; l de 1 mg / m tPA) à raison de 0,5, 1 ou 4 heures après, plus tCCAo hypoxie (Figure 4).

5. Brain Damage détection avec plusieurs options

Remarque: Pour recueillir des échantillons de cerveau, euthanasier les souris à 1, 4 ou 24 heures après Thi.

  1. Effectuer méthode de quantification du volume de l'infarctus par in vivo chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) à 24 heures après Thi insulte comme décrit précédente. 17
    1. Intrapéritonéale injecter animaux avec une solution 1,4 M de mannitol (~ 0,1 ml / g de poids corporel) 30 minutes avant la perfusion transcardial. Souris perfuser Transcardial avec PBS suivis par 10 ml de 2% TTC.
    2. Retirer le cerveau des animaux avec des instruments chirurgicaux après 10 min et la placer dans du paraformaldéhyde 4% pour la fixation pendant la nuit et dans la section 1 mm d'épaisseur avec un vibratome.
    3. Prenez une série de quatre lames de cerveau est segmenté par microscope numérique et quantitatififier le volume de l'infarctus par le rapport de la zone infarcie (zone blanche sur le côté droit) de la surface de la, hémisphère controlatéral intact à l'aide du logiciel ImageJ.
  2. Sinon, effectuer la formation de thrombose par immunofluorescence à 1 h après Thi insulte.
    1. Congeler le cerveau fixe dans le composé PTOM et les cerveaux à l'article 12 um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat.
    2. Incuber la lame de cerveau de lapin anti-anticorps de fibrinogène (1: 100) à la suite de chèvre anti-lapin Alexa 488 fluo colorant (1: 200) pour observer la fluorescence sur un microscope fluorescent.
  3. Sinon, effectuez une obstruction des vaisseaux par injection dans la veine de la queue de 100 pi 2% colorant bleu Evans à 4 h après Thi insulte.
    1. Euthanasier les souris et rapidement couper la tête pour enlever le cerveau dans du paraformaldéhyde 4% après Evans injection bleu. Remarque: Il faut 5-10 min pour Evans circulation bleu avec la couleur bleue à la fois antérieurs et hind membres.
    2. Sectile cerveau fixé à 100 um d'épaisseur en utilisant un microtome à glissière et d'observer la fluorescence en utilisant un filtre d'émission de 680 nm sur un microscope fluorescent.

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Representative Results

Deux dimensions contraste de granularité laser imagerie (LSCI) 16 a été utilisé pour comparer les altérations du débit sanguin cérébral (CBF) de 30 min occlusion transitoire carotide unilatérale (tCCAO), exposition de 30 min à l'hypoxie (7,5% d'oxygène), et 30 min unilatérale ligature de la carotide sous hypoxie (THI). Cette expérience a révélé que tCCAO sous la normoxie supprimée CBF sur la carotide hémisphère ligaturé à ~ 50% de la valeur de référence, qui récupère rapidement à plus de 85% après la libération de l'occlusion de la carotide (R sur la figure 2A). L'exposition à l'hypoxie systémique seul a réduit la CBF à environ 75% de la valeur de référence, qui rebondit de manière transitoire à ~ 130% après le retour à l'atmosphère normoxiques (figure 2B). En revanche carotide ligature sous hypoxie (THI) a rapidement réduit CBF dans l'hémisphère ipsilatéral à moins de 20% de la valeur de base d'environ 10 min, ce qui rarement récupéré au-dessus de 30% à 20 min après la libération de l'ligatio carotiden et le retour à la normoxie. CBF sur l'hémisphère controlatéral (L), cependant, a fluctué entre 20 et 50% au cours de l'hypoxie, et rapidement retourné à plus de 80% après l'insulte Thi (figure 2C).

À 24 h après tCCAo (30 min) ou tCCAO plus 30 min hypoxie (THI), in vivo TTC tache a été utilisé pour détecter du myocarde 17. Cette analyse a montré aucune lésion évidente par l'insulte tCCAO, mais myocarde importante sur le territoire de l'artère cérébrale moyenne fourni suivante Thi insulte (figure 3A). Anti-fibrine (fibrinogène) immunocoloration a été utilisé pour comparer les cerveaux tCCAO- et Thi-blessés à récupération de 1 heure et a montré dépôt généralisée de la fibrine (fibrinogène), un indicateur de la thrombose, dans la Thi-blessés, mais pas la souris tCCAO-contesté cerveau (Figure 3B, C). Injection queue veine de colorant bleu Evans a également été utilisé pour comparer la perfusion vasculaire de cerveaux tCCAO- et Thi-blessés à 4 récupération de h. Cette analyse a montré diminuented perfusion cérébrale et extravasation intense du colorant bleu Evans dans Thi-blessés, mais pas les cerveaux de souris tCCAO-contestées (Figure 3D, E).

Enfin, les résultats de Thi insulte chez les souris recevant une injection de queue veineuse de véhicule (à 0,5 h de récupération) ou humaine recombinante tPA (Activase, 10 mg / kg, 0,5, 1, ou 4 heures post-THI) ont été comparées à l'aide de vivo tache TTC à la récupération de 24 h (figure 4A). Chez les souris traitées avec le véhicule, le taux de mortalité à 24 h post-Thi était de 23,8% et une seule souris dans 21 Thi blessé était au-delà de la moyenne et 2 SD (les valeurs aberrantes). Le taux de mortalité de 24 heures chez des souris recevant un traitement tPA à la récupération de 0,5 heures a chuté à 8,3%, mais cet effet a été perdue lorsque tPA a été administré à 1 ou 4 heures après l'insulte Thi (figure 4B). Figure 4C tracée la taille de l'infarctus du tout souris ont survécu dans les quatre groupes de traitement. Il convient de noter, à la fois 0,5 et 1 h tPA-administration significantly réduit la taille de l'infarctus, par rapport au traitement du véhicule. Le groupe de traitement tPA-0,5 heure a également montré une taille d'infarctus réduite de manière significative par rapport au groupe de traitement tPA-quatre heures. La figure 4D montre les résultats représentatifs TTC-tache après chaque traitement.

Figure 1
Figure 1:. Procédure d'hypoxie cérébrale transitoire ischémie (THI) insulte chez les souris adultes (A) la triade de Virchow qui propulse La thrombose comprend la stase du flux sanguin, lésions endothéliales, et hypercoagulabilité sanguine. (B) Un schéma de la procédure de course Thi. Deux nœuds libérables ont été attachés sur la bonne artère carotide commune (CCA), et suivies par la livraison de 7,5% d'oxygène via un cône de nez pendant 30 min, tandis que la température rectale de la souris a été maintenue à 37-38 ° C. Après la transhypoxie systémique ient, la ligature CCA a été libéré en tirant sur une extrémité des noeuds de suture libérables. MCA, l'artère cérébrale moyenne; ICA, l'artère carotide interne; CEA, artère carotide externe; CCA, l'artère carotide commune. (C) Les procédures chirurgicales pour le droit transitoire CCA occlusion. 1. Deux prédécoupé suture (# 1 et # 2) ont été placés sous un CAA droite isolée. 2. Deux noeuds libérables ont été faites. 3. La ligne d'incision a été fermée par suture # 3. Assurez-vous que les extrémités de suture # 1 et # 2 sont accessibles en dehors de la ligne d'incision. 4. Retirez délicatement suture n ° 1 et n ° 2 de l'extérieur pour libérer le CCA. Quand elle est réalisée en douceur, cette procédure ne sera pas causer une lacération de la CCA.

Figure 2
Figure 2:. Analyse des altérations cérébrales d'écoulement de sang pendant et après Thi insulte A deux dimensions laser contraste de speckle imagerie (LSSystème CI) a été utilisé pour évaluer la circulation sanguine cérébrale (CBF). R (droite) indique l'hémisphère carotide-ligaturé; L (gauche) est l'hémisphère controlatéral. (A) tCCAO sous normoxie supprimée CBF à ~ 50% de la valeur de référence sur l'hémisphère carotide-ligaturé (R) pendant au moins 30 minutes, qui a récupéré au-dessus de 85% à moins de 3 min lors de la libération de la ligature de la carotide. (B) Dans l'hypoxie (7,5% d'oxygène, 30 min) sans ligature de l'artère carotide, CBF chuté pour atteindre 76% de la valeur de référence et transitoire rebondi à environ 130% après son retour à la normoxie. (C) Dans transitoire carotide ligature sous hypoxie (THI, 30 min), CBF sur la (R) hémisphère carotide-ligaturé rapidement chuté à moins de 20% de la valeur de référence, et il a rarement récupéré au-dessus de 30% lors de la libération de la ligature de la carotide et le retour à la normoxie. En revanche, sur le CBF controlatéral (L) hémisphère fluctué entre 20-50% au cours de l'hypoxie, et revint rapidement à> 80% de la ligne de basevaleur après la libération de la carotide ligature et le retour à la normoxie. Présentés sont tracés CBF représentatifs pour n> 4 dans chaque groupe. Les points de temps pour les photos LSCI représentatifs ont été marquées par des lignes grises dans le tracé représentatif.

Figure 3
Figure 3: l'infarctus cérébral, thrombose spontanée et navire obstruction après l'insulte Thi (A) In vivo TTC tache n'a montré aucune myocarde visible à 24 h après 30 min ligature transitoire de l'artère carotide droite commune (tCCAO), mais l'ajout de. 30 min hypoxie (7,5% d'oxygène) à tCCAO produit du myocarde non négligeable dans l'hémisphère ipsilatéral (astérisque), principalement dans la région de l'artère cérébrale moyenne de fourniture. (B, C) ​​Anti-fibrine (fibrinogène) immunocoloration à 1 h après l'insulte Thi a montré de vastes dépôts dans lehémisphère ipsilatéral. En revanche, il n'y avait pas de dépôts de fibrine (fibrinogène) à 1 h après la tCCAo (30 min) insulte (n> 4 pour chaque). (D, E) perfusion cérébrale a été évaluée par injection de queue veineuse de colorant bleu Evans à 4 h après tCCAO (30 min) ou Thi (30 min) insulte. En post-tCCAO cerveau, colorant bleu Evans rempli la plupart des vaisseaux sanguins dans l'hémisphère ipsilatéral. En revanche, dans l'après-Thi cerveau, Evan colorant bleu rempli moins de vaisseaux sanguins et a été divulgué dans le parenchyme (n> 3). Barre d'échelle: 250 um.

Figure 4
Figure 4: Effets de tPA thrombolyse dans le modèle de course Thi (A) Aperçu des expériences pour comparer les effets de l'administration intraveineuse tPA (10 mg / kg) à 0,5, 1 ou 4 heures après l'insulte Thi.. (B) Résumé du nombre d'animaux exploités, mortality en 24 heures après les insultes, les valeurs aberrantes (la taille de l'infarctus en dehors de la moyenne +/- 2 SD), et le nombre d'animaux pour la comparaison de la taille de l'infarctus. (C) La quantification a montré un volume en moyenne de 32% de l'infarctus dans le groupe de véhicule et une réduction significative de l'infarctus dans le 0,5 h (à 16%) et 1 h (à 20%) des groupes (présentés sont la moyenne et la SEM pour chaque groupe). Les valeurs p sont déterminés par un test t. Cerveau (D) représentant TTC-taché par des animaux qui ont été contestées par l'insulte Thi et ont reçu un traitement tPA au point de temps après une blessure indiquée. En coloration TTC, tissu vivant montré la couleur rouge; le tissu de l'infarctus était pâle.

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Discussion

L'AVC est un problème majeur de santé d'une importance croissante pour toute société avec un vieillissement de la population. Globalement, l'AVC est la deuxième principale cause de décès avec un taux d'environ 5,9 millions d'événements mortels en 2010, ce qui équivaut à 11,1% de tous les décès 18. L'AVC est également la troisième cause d'années de vie ajustées sur l'incapacité (DALY) perdues dans le monde en 2010, passant de la cinquième position en 1990 19. Ces données épidémiologiques mettent en évidence la nécessité de thérapies plus efficaces de aiguë de l'AVC (ischémique). Cependant, malgré d'intenses recherches dans le traitement neuroprotecteur préclinique, le tPA-thrombolyse reste le seul traitement spécifique de l'AVC ischémique aigu qui est approuvé par la Food and Drug Administration aux États-Unis, tandis que de nombreux agents neuroprotecteurs fois prometteurs dans les études animales ont échoué dans les essais cliniques. La difficulté à traduire thérapies neuroprotectrices dans des patients a de nombreux facteurs, et l'accent est actuellement mis sur la bonne prati laboratoireCE, la méta-analyse de plusieurs ensembles de données, et la coopération internationale pour améliorer la recherche préclinique de course 20,21. Cependant, il ya une opinion minoritaire qui suggère que la difficulté de la traduction est due à un mauvais choix de modèles d'occlusion vasculaire mécaniques (par exemple intraluminal suture occlusion de la MCA) dans la majorité de la recherche préclinique de course à ce jour 2,3. Parce que les modèles d'occlusion vasculaire mécanique induisent rarement la thrombose et la reperfusion cérébrale survient trop vite lors de la libération de l'obstruction mécanique, ces modèles ne répondent à la vraie thérapie mot (tPA fibrinolyse), ni fournir une fenêtre thérapeutique étroite que ceux chez les patients victimes d'AVC. Par conséquent, le remède proposé est de souligner, au moins inclure, modèles d'AVC thromboembolique dans la recherche préclinique de la course 3.

Cette recommandation, cependant, a ses contraintes parce que les modèles d'AVC thromboembolique évolutive (de la livraison d'emboles exogène, MCA-injection de thrombin et photothrombosis) ont tous certains inconvénients techniques 4. Pour le modèle d'emboles exogène, perfusion intravasculaire de résultats d'embolie dans la variabilité significative de la taille de l'infarctus et de l'emplacement, ainsi que les réponses imprévisibles à tPA thrombolyse en raison de différences dans la préparation caillot 4,5. L'injection directe de la thrombine dans la branche MCA nécessite craniectomie, et son utilité pour optimiser la thérapie thrombolytique est encore à prouver 4,6. Initiée par voie chimique sur la base de la thrombo-embolie systémique injection d'un colorant photosensible (par exemple, le rose Bengale ou l'érythrosine B) et l'irradiation à travers le crâne exposé produit souvent des agrégats de plaquettes seule qui ne répondent pas à la thrombolyse 4,7. Pris dans leur ensemble, il ya un besoin de modèles plus simples et thromboemboliques tPA-sensibles pour la recherche préclinique de course.

Le paradigme Thi a quatre avantages uniques comme un modèle de course thromboembolique. Tout d'abord, l'insulte Thi maniaitcomposants endogènes pour former des thrombus in situ sans l'aide de produits chimiques exogènes ou des emboles préformés. Ainsi, la formation de thrombus dans le modèle Thi est plus pertinente à des conditions physiologiques. Deuxièmement, le modèle Thi répond favorable à tPA traitement rapide (à 0,5 et 1 heure après la lésion) mais pas à un traitement différé (à 4 h). Cette fenêtre thérapeutique est similaire à ceux observés chez les patients victimes d'AVC. Ainsi, le modèle Thi peut être utilisé pour la recherche visant à améliorer la thérapie de reperfusion dans l'AVC ischémique aigu. Troisièmement, les procédures chirurgicales dans le modèle Thi sont simples et directes, par rapport au modèle d'occlusion intraluminale suture MCA. La durée de l'hypoxie dans le modèle Thi est également contrôlable. Ces attributs font le modèle Thi moins sensibles aux variations de procédure entre les différents laboratoires. Enfin, le modèle peut Thi versé comprendre les mécanismes de reperfusion incomplète malgré recanalisation des grosses artères après une thrombolyse, qui estun défi unique dans la thérapie de la course par rapport à l'ischémie cardiaque 1,22. Ainsi, le modèle Thi offre un système unique d'étudier les mécanismes de la dysrégulation vasculaire cérébrale spécifique lit de l'hémostase 23.

Tous les modèles de lésions cérébrales expérimentales ont des limites, et le modèle Thi ne fait pas exception. Trois grandes contraintes techniques du modèle de course Thi ont été identifiés dans l'expérience. Tout d'abord, contrairement à d'autres modèles de course où l'insulte est limitée au cerveau, la combinaison de l'hypoxie et occlusion de la carotide conduit à une vasodilatation périphérique et une plus grande demande pour le débit cardiaque 12. Ainsi, lorsque l'on compare les effets des mutations de la souris ou d'agents neuroprotecteurs contre l'insulte Thi, leurs impacts sur les fonctions cardio-vasculaires doivent également être soigneusement comparés. Deuxièmement, nous avons constaté que les souches de souris consanguines différents ont des réponses variables au modèle Thi, qui peut être dû à la perméabilité inégale du commun postérieurintoxicantes artère 24, les fonctions cardiaques dissemblables, ou une combinaison des deux. Par conséquent, il est recommandé que le sexe, l'âge, le poids corporel et de la souris entre les deux souches groupes expérimentaux soient comparables dans les études de neuroprotection. Enfin, la course Thi repose sur des animaux de respirer dans le gaz hypoxique dans une condition légèrement anesthésié. Les effets de l'anesthésie sur les résultats d'un AVC doivent être minimisés rester cohérente entre les animaux. Néanmoins, aussi longtemps que les chercheurs sont vigilants de ces détails techniques et de réduire les variables de l'animal à des animaux, le modèle de course Thi peut être rapidement mis en place pour donner consistance élevée d'infarctus cérébral.

En résumé, Thi est un modèle de course simple et standardisé qui répond favorablement à la thérapie du monde réel (tPA thrombolyse) dans une fenêtre temporelle cliniquement pertinente. Ce nouveau modèle est un ajout précieux à la recherche préclinique de la course, et peut aider à améliorer la thérapie de thrombolyse dans ischémique aiguaccident vasculaire cérébral.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

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References

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