Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een strikt beheer van eiwitexpressie is niet alleen van belang voor elk organisme leven, maar ook een belangrijke strategie om proteïnefuncties onderzoeken in cellulaire modellen. Daarom recente onderzoek bedacht verschillende instrumenten om eiwitexpressie in zoogdierlijke cellijnen of diermodellen, waaronder RNA en interferentie antilichaam targeten. Terwijl de eerste strategie veel aandacht heeft verzameld gedurende de laatste twee decennia peptiden mediëren een translocatie antilichaam ladingen in celmembranen en in cellen, verkregen veel minder belang. In deze publicatie geven we een gedetailleerd protocol hoe een peptidedrager genoemd Chariot in humane embryonale niercellen en primaire hippocampale neuronen gebruiken antilichaam interferentie experimenten en de toepassing van driedimensionale reconstructies illustreren het analyseren eiwitfunctie. Onze resultaten suggereren dat Chariot is, waarschijnlijk door zijn nucleaire lokalisatiesignaal, particularly goed geschikt voor eiwitten die in de soma en de kern te richten. Opvallend bij de toepassing Chariot primaire hippocampale kweken, het reagens bleek te zijn verrassend goed door gedissocieerde neuronen aanvaard.

Introduction

Een strakke controle van eiwitexpressie is essentieel voor elk levend organisme om haar ontwikkeling commando en te reageren op omgevingssignalen. Derhalve is een veelheid van mechanismen uitgevonden tijdens evolutie naar het expressieniveau van elk eiwit wordt gecodeerd door de applicatie nauwkeurig regelen. 20.000 genen bestaan ​​in eukaryotische cellen op elk moment van zijn leven. Die op verschillende stadia van eiwitproductie, regulerende mechanismen variëren van het beheer van chromatinestructuur, transcriptie en RNA hanteren richting posttranslationele eiwit modificaties, transport en degradatie.

Het is dan ook niet verwonderlijk dat storingen in de onderliggende moleculaire machines en veranderde eiwit expressie niveaus zijn in verband gebracht met diverse ziekten zoals kanker of een verstandelijke beperking. Inderdaad, kijkend naar de uitstaande complexiteit van neuronale ontwikkeling en zoogdier hersenfunctie, de Sensiteit van deze geavanceerde systemen om veranderingen in eiwitexpressie manifesteert zich in een aantal bekende intellectuele tekorten, waaronder de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson (AD en PD) evenals autisme spectrum stoornissen (ASS), zoals het fragiele X syndroom (FXS). Laatstgenoemde ziekte wordt gekenmerkt door een uitgebreide misexpression van een verscheidenheid van eiwitten, die door het verlies van een enkele translatie regelende proteïne, FMRP (fragile X mental retardation proteine) 1-4. Bovendien chromosomale herschikkingen die de variabele kosten X-gebonden eiwit A (VCXA), een eiwit dat mRNA stabiliteit en de vertaling door het modificeren van mRNA aftopping 5 beheert, zijn onlangs in verband gebracht met een mentale achterstand, terwijl puntmutaties niet bij patiënten die werden geïdentificeerd met cognitieve beperkingen vanaf nu 6, 7, wat erop wijst dat de waargenomen mentale stoornissen afkomstig VCXA veranderde expressie en ontregelde expressie van het doelwit proteins. In lijn met deze bevindingen van een onderzoek naar de vraag of de novo copy number variations genen geassocieerd zijn met ASS vastgesteld dat nieuw gen duplicaties en deleties zijn een belangrijke risicofactor voor ASD 8, dus het idee dat verhoogde of verminderde eiwit expressie niveaus kan leiden tot het ondersteunen van intellectuele tekorten.

Opmerkelijk is verder recent onderzoek aangetoond dat het expressieniveau van een bepaald eiwit nauwkeurig aangepast zijn aggregatie als gevolg van grote hoeveelheden eiwit voorkomen vrijwel zonder veiligheidsmarges 9. Daarom is voorgesteld dat zelfs kleine stappen volstaan ​​om ziekten zoals AD en PD 9 induceren. Hoewel de verscheidenheid van de moleculaire machines die bijdragen aan eiwit expressie controle suggereert een complexe regelgeving systeem in het licht van deze bevindingen, een onderzoek naar de expressie van meer dan 5.000 zoogdiergenen 10 aangetoond datde natuur de voorkeur aan een meer spaarzame regeling: De cellulaire overvloed aan eiwitten werd aangetoond dat voornamelijk worden geregeld op het niveau van de vertaling 10, dus illustreren dat het beheer van RNA beschikbaarheid dient voornamelijk te fine-tunen eiwitexpressie.

Het bestuderen van de dosis van proteïnen (POI's) is dus niet alleen belangrijk voor het begrip van de endogene functie van een eiwit, maar ook om het onderzoek van vele ziekten en de ontwikkeling van therapieën. Zo hebben de laatste decennia is de opmars van verschillende strategieën door middel van RNA interferentie om POI dosering te manipuleren gezien. Hoewel RNA interferentie veel gebruikt om eiwitfunctie te bestuderen en zelfs in klinische proeven worden toegepast voor de behandeling van kanker of oculaire ziekten en antivirale therapie bij patiënten 11-13 oefenen, kan een aantal problemen voordoen die de strategie onmogelijk zouden maken. Bijvoorbeeld, het zaad sequentie die de knockdown aandrijft door homologie vergelijkbaarheidble kort, dus het bevorderen van off-target effecten. Aangezien zeer efficiënt sequenties zijn zeldzaam en moeten worden gevonden tussen duizenden opties (besproken in 14), het identificeren van de juiste volgorde kan tijdrovend en kostbaar, maar de resultaten kunnen nog steeds teleurstellend.

Een andere mogelijkheid is direct gericht op de NP op antilichamen. Hier illustreren we het gebruik van de eiwitdrager Chariot (geproduceerd door Active Motif) om cellulaire beschikbaarheid eiwit te verminderen, en de tewerkstelling van driedimensionale reconstructies eiwit functie na knock-down te bestuderen.

De actieve motief van Chariot, zelf een 2,8 kDa peptide wordt gebruikt shuttle peptiden, eiwitten en antilichamen in membranen van zoogdiercellen 15. Het peptide associeert met POI's door het vormen van niet-covalente wijze gekoppeld macromoleculaire complexen met behulp van hydrofobe interacties, waarna Chariot-POI complexen worden geïnternaliseerd in cellen in een endosoom-independent manier. Belangrijker Chariot werd aangegeven geen invloed op de intracellulaire lokalisatie van shuttled eiwitten, noch cytotoxische effecten uitoefenen of de biologische activiteit van de lading 15 beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorraadoplossingen

  1. Resuspendeer de gevriesdroogde actieve motief poeder in steriel H 2 O tot een eindconcentratie van 2 ug / ul. Tik zorgvuldig te mengen.
  2. Bereid kleine hoeveelheden (bijvoorbeeld 12 pi elk 2 pl vereist per reactie) en bewaar ze bij -20 ° C.

2. Bereiding van Cellen

  1. Seed zoogdiercellen zoals HEK293 cellen of primaire neuronen op een plaat met 24 putjes in 500 ul groeimedium waaronder antibiotica.
    LET OP: Bij het gebruik van neuronen, het zaad van de cellen bij lage dichtheid en alleen gebruik maken van de twee middelste rijen van de 24 wells plaat. Elk goed zal dus een lege tegenhanger van het medium haven tijdens incubatie (stap 4.2). Bij het hanteren van neuronen, er altijd voor zorgen dat de cellen niet buiten de incubator worden gehouden voor meer dan een paar minuten.
  2. Kweken van de cellen bij geschikte omstandigheden (bevochtigd, 5% CO2 en 37 ° C) tot de cellen app. 50%confluent.
    NB: Bij gebruik van neuronen, de cultuur van de cellen tot het gewenste ontwikkelingsstadium wordt bereikt en app te wijzigen. 25-50% van het medium tweemaal per week. Medium: Neurobasal medium (bestaande uit 1x B27, 5 mM L-glutamine en 1x penicilline en streptomycine; vergelijken met ref 16).

3. Chariot Complex Formation

  1. Per reactie verdund 0,1-2 ug van de POI of de overeenkomstige antilichaam en het controle-eiwit of controle antilichaam, respectievelijk in 50 pl PBS.
    LET OP: De techniek werkt ook met macromoleculaire complexen, bestaande uit pre-gebonden primaire en secundaire antilichamen (cp 'Representatieve resultaten ", figuur 1.). Mix en spin.
  2. Voor elk monster, verdund 2 pi Chariot voorraadoplossing in 50 pl PBS gebruik van afzonderlijke buizen om zelfassociatie van Chariot voorkomen. Mix en spin.
  3. Breng de verdunde POI of antilichaam (stap 3.1) naar de Chariot verwatering door pipetTing. Mix en spin.
  4. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (Chariot POI-complexen zullen vormen).

4. Transfectie van cellen

  1. Verdun de Chariot complexen (stap 3,4) in 100 ul voorverwarmde groeimedium (37 ° C, zonder toevoegingen). Verwijder het medium en de cellen eenmaal te wassen met behulp voorverwarmd 1x PBS.
    OPMERKING: Bij het gebruik van neuronen, hoeft het medium niet weg, zal het worden hergebruikt. Houd het bij 37 ° C. Voor het wassen Gebruik PBS bevattende 0,5 mM MgCl2 en CaCl2.
    Suggestie: houd het medium in lege putten, terwijl incubatie van de plaat (stap 4.5).
  2. Breng de Chariot complexoplossing (stap 4,1) aan de cellen en rock de cellen zachtjes te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de oplossing. Kweek de cellen onder standaardomstandigheden (stap 2,2) gedurende 1 uur. serum aan een eindconcentratie van 10%. Bij gebruik neuronen, voeg het medium van stap 4,1. Groeien de cellen gedurende 1 tot 2 uur.
    Merk opoptimale incubatietijd afhankelijk van de grootte en de eigenschappen van de lading en moet deze empirisch worden aangepast. De volgende suggesties kunnen als leidraad dienen: Voor peptiden, 1 uur is meestal voldoende, voor eiwitten 1-2 uur worden aanbevolen, op antilichamen 2 uur, en voor de transfectie van neuronen met antilichamen 4 uur.
  3. Werkwijze cellen voor analyse zoals gebruikelijk. Let op: de techniek is compatibel met experimenten met fixatie-protocollen en live imaging.

5. Imaging

  1. Met behulp van een laser scanning microscoop neemt z-stapels van cellen en / of celcompartimenten plaats via circa 0,25-0,5 urn afstand. De precieze afstandslaag afhankelijk van de grootte van de structuur te reconstrueren en moet individueel bepaald.

6. Wederopbouw

  1. In de volgende stappen, gebruik maken van de Esc bodem om te schakelen tussen Select en Navigeren, Cntr om meerdere objecten te selecteren door te klikken on hen en Shift-toets ingedrukt te snijden objecten (cp. stap 6.10).
  2. Open het LSM-bestand in Imaris.
  3. Met behulp van de aanpassing van de weergave voor elk kanaal, het contrast van de foto tot de helderste structuren te bereiken verzadiging. Houd er rekening mee dat deze aanpassing heeft geen invloed op het oppervlak bouw, het alleen dient om de onderzoeker te helpen bij drempelvorming het beeld.
  4. Klik op het icoon toevoegen Surfaces. Een wizard wordt geopend.
  5. Selecteer: Segment slechts een Region of Interest. Ga door naar de volgende stap.
  6. Stel de marge van de selectie box om uw object van belang past. Gelieve er rekening mee dat het beeld heeft 3 dimensies en dat de selectie moet worden aangepast aan de z vliegtuig ook. Als de rechthoekige vorm van de selectie box het voorwerp van belang niet goed zou overeenkomen, zet het object en / of vergroten van de doos totdat alle vereiste structuren zijn ingebed. Ongewenste voorwerpen kunnen later worden verwijderd (cp. Stap 6.10). Doorgaan.
  7. Selecteer de juiste chAnnel. De oppervlakte Detailniveau of bol diameter moet worden ingesteld op overeenkomen met de structuren wordt gereconstrueerd. Afhankelijk van het signaal kenmerken, kan zowel Absolute Intensity of Local Contrast worden gebruikt. In het algemeen, Local Contrast werkt beter voor diffuse signalen. In elk geval moeten de instellingen worden afzonderlijk voor elk signaal of de structuur van belang respectievelijk aangepast.
  8. Met behulp van de Thresholding gereedschap, reconstrueren de structuur van belang.
  9. Voltooi de reconstructie door te klikken op de groene pijl onderaan.
  10. Pas het object verder met behulp van het potlood te snijden en oppervlakken te verwijderen indien nodig. Het is alleen mogelijk om de afbeelding in noord-zuid richting gesneden, dus kantelen om het gewenste object te snijden.
  11. Het verkrijgen van metingen van volume, oppervlakte en intensiteiten voor elk oppervlak door het selecteren van Statistiek, gedetailleerde statistieken en gemiddelde waarden.
  12. (Optionele stap) Om kleurcode statistieken observeren (cp. Figuur 2E F), selecteert u het tabblad kleur van het betreffende oppervlak en markeer 'Statistiek Coded' in plaats van 'Base'. Verschillende opties worden weergegeven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de volgende paragrafen, voorbeeldige resultaten ter illustratie van een functionele knock-down van een POI (Simiate, voor meer informatie zie 16, 17) met behulp van Chariot reagens en interferentie antilichaam worden gepresenteerd. De resultaten tonen aan dat verminderde expressie van Simiate schaadt transcriptionele activiteit en, in een dosering afhankelijke wijze induceert apoptose, culminerend sterftecijfer van meer dan 99% of hoger antilichaam hoeveelheden (> 1 ug antilichaam) aangebracht (deze ontdekkingen was voorheen gepubliceerd 16). Hier presenteren we nu de technieken en protocollen toegepast gedetailleerd en verder zien hoe Chariot reagens kan worden gebruikt om gedissocieerd hippocampale neuronen in primaire kweken transfecteren.

Om te onderzoeken of Chariot peptiden zodat een efficiënt pendelen van antilichamen en met name indien deze antilichamen tijdens de procedure blijven functioneren, hebben wij op FLAG-Simiate Gedurende 24 uur in HEK293 cellen, en vervolgens de getransfecteerde cellen met gebruikmaking Chariot gekoppeld rbαSimiate-gtαrbAlexa568 macromoleculen (figuur 1). De FLAG-Simiate construct wordt goed weergegeven door HEK293 cellen en lokaliseert de somata en de kernen van deze cellen (Figuur 1A). Hier, FLAG-Simiate clusters significant (figuur 1B), waardoor de distributie van endogeen gespikkeld Simiate in de kern spiegelen.

Het antilichaam complexen vervoerd over de celmembraan weergegeven in assemblages (figuur 1A, rood, rood pijlen), maar de vrijgekomen antilichamen FLAG-Simiate specifiek zoals blijkt uit een diepe colokalisatie van FLAG-Simiate en rbαSimiate-gtαrbAlexa568 macromoleculen (Figuur 1B in geel, geel pijl). Zoals van de nota, het experiment niet alleen toont aan dat de antilichamen blijven functioneren tijdens een Chariot-Mediatedmembraanpassage, maar dat ze ook in staat om de kern voeren. Aangezien de grootte sluit antilichamen uit beginnen de kern via diffusie, is het waarschijnlijk dat het nucleaire lokalisatiesignaal aanwezig Chariot zich vergemakkelijkt de translocatie van rbαSimiate-gtαrbAlexa568 macromoleculen in de kern. Inderdaad, antilichamen assemblages ook waargenomen op of in respectievelijk het kerncompartiment (Figuur 1B, rode pijlen).

Gebruik rbαSimiate-Chariot complexen functioneel afbreken endogene Simiate in HEK293-cellen (figuur 2), vonden we dat we in staat waren om te richten op 80% van de rbαSimiate bindingsplaatsen, via 2,0 ug antilichamen 16. Interessant, terwijl shuttling gtαrbAlexa568 antilichamen alleen in HEK 293-cellen geen duidelijk effect op het uiterlijk van nucleaire spikkels (Figuur 2A-C) had, verlies van functionele Simiate afgeronde nucleaire spikkels (Figuur 2D-F </ strong>, cp. 16), zoals geïllustreerd door driedimensionale reconstructies (Figuur 2B, C vs E, F) en, op een dosisafhankelijke wijze geïnduceerde apoptose (Figuur 3, cp. 16).

Aangezien neuronale cellen zeer gevoelig voor toxische effecten, pasten wij ook de techniek primaire hippocampale kweken (figuur 4). Met behulp van TUNEL test en MAP2 kleuring naar cel integriteit analyseren, vonden we geen effect op de levensvatbaarheid van neuronen bij het vergelijken van mock of onbehandeld en Chariot behandelde cellen (ong. 20-25% TUNEL positieve cellen na 1 + 4 uur van de behandeling, cp. 4.4 -4,6). Vandaar dat we getest Chariot bemiddelde antilichaam pendelen in neuronale culturen. Volgens dezelfde toepassingsschema werden gtαgpAlexa568 antilichaam assemblages gezien variërende zich in ongeveer 83% van de cellen, wanneer ze zich in somata en kernen (figuur 5A). Deze waarnemingen worden verder ondersteund bya driedimensionale analyse (Figuur 5B) en nauw monteer de foto bekeken in HEK293 cellen, dus samen illustreert dat de Chariot techniek met succes kan worden gebruikt voor het transfecteren gedissocieerd primaire hippocampale neuronen ook.

Figuur 1
Figuur 1. FLAG-Simiate wordt gedetecteerd door Simiate specifieke antilichamen geschuif in HEK293 cellen met behulp van Chariot reagens. Voor antilichaam interferentie experimenten, rbSimiate-gtrbAlexa568 antilichamen werden voorgemonteerd voorafgaand aan de Chariot-antilichaam complexvorming. A) HEK293 cellen die FLAG-tag Simiate. Simiate antilichaam assemblages voer de soma, evenals de kern na toepassing, waarbij zij specifiek colocalize met FLAG-Simiate. Ronde punten: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblages (rode pijlen). B) Een hoog vermogen vergroting van de boxed regioin (A) ter illustratie van de colocalization van FLAG-Simiate en Chariot gemedieerde Simiate signaal (gele pijlen). Let op de aanwezigheid van een Chariot antilichaam assemblage in de kern (rode pijl). Schaal bar: 10 pm.

Figuur 2
Figuur 2. Simiate antilichamen vervoerd in HEK293 cellen verstoren cellulaire functies van endogeen Simiate. A, B) HEK293 cellen behandeld met Chariot-gtrbAlexa568 (1 ug) dienen als controle. In rood, wordt endogene Simiate getoond in valse kleuren, terwijl de Chariot-gtrbAlexa568 assemblages niet worden weergegeven. Nucleaire spikkels werden gelabeld met behulp van de marker eiwit SC35 (in het groen), terwijl apoptotische cellen werden geïdentificeerd door TUNEL assay (in het blauw). B) Reconstructie van de nucleaire spikkels uit de boxed regio A. C) Reconstructie van dezelfde regio illustreren spikkel volumes en oppervlaktenin een kleurcode wijze. D, E) HEK293 cellen na Chariot-rbSimiate behandeling (0,5 ug). Endogene Simiate evenals Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblages worden weergegeven in het rood, terwijl de nucleaire spikkels en apoptotische cellen worden weergegeven op basis van A en B. E) Nuclear spikkels gereconstrueerd op basis van de boxed regio in D. F) Hetzelfde gebied wordt getoond als geschetst voor C. Let op de afgeronde uiterlijk en de aggregatie van spikkels (alle reconstructies: Imaris software). Schaal bar in C, F: 2 urn. Alle andere schaal bars: 10 pm. 1) Bij driedimensionale reconstructie alleen niet-apoptotische cellen gebruikt.

figuur 3
Figuur 3. Hoge doses Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 induceren massale celdood. HEK293 cellen werden behandeld met 2 ug Chariot-gtrbAlexa568 of Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568, respectievelijk (beide comping lexes getoond in groen en aangegeven met pijlen en vergrotingen). TUNEL labeling (blauw) werd aangebracht op apoptotische cellen te identificeren. Schaal bar: 10 pm.

figuur 4
Figuur 4. Chariot niet toxisch is voor primaire hippocampale neuronen. AB) DIV 7 neuronen werden ofwel mock behandeld (medium A) of onderworpen aan Chariot reagens (B) zoals beschreven in het protocol voor antilichaam shuttling (1 + 4 uur, cp. 4,4-4,6). Terwijl de SC-35, een marker eiwit voor nucleaire spikkels, diende om de transcriptie en splicing machines labelen, werd TUNEL kleuring toegepast op apoptotische cellen (groene pijlen) te identificeren. C) Onbehandeld en Chariot behandeld DIV 16/17 neuronen. MAP2 kleuring werd toegepast om de dendritische bomen visualiseren. Schaalbalken: 10 urn.

Pbelasting / 53049 / 53049fig5highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 5. Chariot gemedieerde transfectie is compatibel met neuronale culturen. A) Een vertegenwoordiger primaire hippocampus neuron uit div 5. De foto toont z-projecties van stapels genomen met behulp van een laser scanning microscoop (laser scanning microscoop 710, Zeiss). Schaal bar: 10 pm. Let op: het optreden van Chariot-gtgpAlexa568 complexen (rood) in de kern en de soma van de cel. B) Driedimensionale reconstructie (Imaris software) van de kern evenals gtgpAlexa568 assemblages getoond in A. Soma en dendrieten van het neuron zijn aangegeven met grijze stippen, die worden gedestilleerd uit de etikettering van endogene Simiate. Schaal bar: 10 pm. Antilichaam hoeveelheid getransfecteerd: 0,25 g.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een protocol om het belang van proteïne expressieniveaus bestuderen regelen cellulaire functies in een dosis aangedreven wijze. De beschreven protocol zorgt voor een verfijnde manipulatie van eiwitexpressie in zoogdierlijke verschillende celtypen, waaronder hippocampale neuronen, dus het vergemakkelijken van gedetailleerde studies eiwitfunctie op celniveau.

Hoewel RNA interferentie een bekende strategie om neerwaarts reguleren POI vertegenwoordigt, heeft zijn nadelen (cp. 14). Naast het identificeren van zeer specifieke en efficiënte sequentie kan kostbaar en tijdrovend, maar ook transcript biogenese in de cel kan onvoorspelbare resultaten sinds de accumulatie van toxische RNA constructen, overbelasting van de nucleaire export machines, alsmede een verzadiging veroorzaken van de endogene RNAi verwerkingssystemen kan leiden tot off-target effecten of inefficiëntie. Ook kunnen grote hoeveelheden exogene RNAi vectoren uns inducerenPECIFIEKE effecten ook, en verstoren cel homeostase.

Antilichamen, anderzijds, en die niet verder worden bewerkt door endogene machines eenmaal de cel zijn binnengekomen en is direct doorgevoerd, ondersteunt dus niet alleen tijdbesparende experimenten, maar ook onderzoeken onmiddellijke cellulaire processen. Hoewel ze niet-specifieke off-target effecten kunnen hebben, ook het toenemende aantal goed gekarakteriseerd en zeer specifieke antilichamen beschikbaar maakt dit alternatief de moeite waard een gedachte. Aangezien de afgifte van macromoleculaire complexen in cellen vormt een groot obstakel zijn verschillende transfectie technieken ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van de peptiden R8 en azoR8 18 en 19 microsfeer gemedieerde pendelen. Terwijl de R8 en azoR8 werden aangegeven op dezelfde wijze te gedragen naar Chariot 18, werden microbolletjes gevonden om 24 uur nodig hebben voor opname 19, die aanzienlijk langer is dan de Chariot-gemedieerde membraan passages en kunnen problemen bij het sneller en dosis-afhankelijke cellulaire reacties bestuderen veroorzaken.

Opmerkelijk is dat de Chariot techniek bleek toepassing primaire hippocampale kweken, die zeer gevoelig voor behandelingen en moeilijk te transfecteren zijn. Tot nu toe zijn Chariot dragers toegepast om eiwitfunctie in primaire osteoblastenculturen 20 analyseren en in het neuroblastoom-glioomcellijn NG108-15 21, kuiken dorsale wortel ganglia kweken 21 of in PC12-cellen 22, die afkomstig zijn van de neurale kam, maar geen meldingen van toepassing in celkweken zijn afgeleid van het centrale zenuwstelsel zijn nog niet beschikbaar. Omdat de traditionele transfectie reagentia zoals Lipofectamine inefficiënt in deze cellen en virale transfecties ingewikkelde kan Chariot een interessant alternatief vertegenwoordigen.

Met name Chariot zelf waargenomen lokaliseren naar de kern 15, waarschijnlijkvanwege zijn nucleaire lokalisatiesignaal PKKKRKV (cp. 23). In lijn met deze waarnemingen, vonden we dat Chariot bemiddelde transfectie van rbαSimiate-gtαrbAlexa568 macromoleculen resulteerde in een duidelijke etikettering van nucleaire compartimenten zoals nucleaire spikkels. Inderdaad, controle antilichamen werden zoals gtαgpAlexa568 ook gedetecteerd in de kern van beide, HEK293 en primaire hippocampale cellen. Aangezien antilichamen, met name in assemblages, zijn veel te groot om de kern beginnen door diffusie en sinds Simiate zelf veroorzaakt geen nucleair lokalisatiesignaal bevat, maar komt de kern via diffusie, is het waarschijnlijk dat de Chariot signaal betrokken is bij de nucleaire lokalisatie van antilichamen. Alternatief zou een transport in groter eiwit assemblages ook mogelijk, hoewel dit de aanwezigheid van gtαgpAlexa568 in de kern van gekweekte hippocampale neuronen van ratten zou verklaren, omdat er geen doelwit voor dit antilichaam in deze cellen. Verder sinvu Chariot bleek niet bemoeien met de natuurlijke lokalisatie van pendelde peptiden en eiwitten 15 zijn deze waarnemingen suggereren dat antilichamen zich anders gedragen.

Inderdaad, wanneer shuttling antilichaam complexen zoals Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (figuur 1) of Chariot-gtαgpAlexa568 (figuur 5) over cellulaire membranen, worden ze in clusters, die slechts los, indien nodig doeleiwitten zoals endogene Simiate of FLAG-Simiate aanwezig zijn (alleen in figuur 1). Met behulp van Chariot antilichaam complexen in osteoblasten, Selim en hogescholen waargenomen hetzelfde effect 20. Aangezien Chariot gedemonstreerd niet interfereren met de lokalisatie van peptiden en proteïnen 15 Deze waarnemingen geven aan dat Chariot geassembleerde antilichamen Demonteer indien er een moleculair mechanisme zoals een antilichaam-target interactie, dat de hydrofobe inter overwintacties tussen Chariot en het antilichaam lading en dus bevordert demontage. Omdat antilichamen zijn zwaarder dan peptiden of de meeste andere eiwitten en hebben, door hun vorm, een groot oppervlak, kunnen zij met hogere aantallen Chariot moleculen en / of interactie steviger met Chariot peptiden, daarna bij te promoten een Chariot-driven gedrag van antilichamen. Een gebrek aan een demontage mechanisme zou dus tot een geclusterde uiterlijk en een nucleair lokalisatie van het antilichaam lading (figuur 5).

Samengevat tonen de gegevens dat Chariot is bijzonder geschikt voor de functie van eiwitten die in de kern te pakken en dat het in verschillende zoogdier celtypen waaronder primaire hippocampale neuronen toepassing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

De gepresenteerde werk werd in delen ondersteund door de financiering van de Canadese Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation van Canada partnership programma om RD, Jerome Lejeune Stichting RD, de Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung van de Universiteit Erlangen-Neurenberg naar RD en van de Deutsche Forschungsgemeinschaft naar RD en RE. De auteurs willen Ingrid Zenger bedanken voor technische bijstand met celkweek onderhoud, alsmede Prof. M. Wegner voor het maken van een pCMV5-FLAG vector beschikbaar. De auteurs verder wil in het bijzonder bedanken Nadja Schroeder voor de behulpzame ondersteuning op de video-opnamen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics