Name: Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer de sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare alpha-synucleïne uit post-mortem hersenweefsel van Parkinsonpatiënten. Deze methode maakt analyse van eiwitaggregatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ik dank Dr. Adamantios Mamais voor het extraheren van α-synucleïne uit menselijk weefsel en het uitvoeren van blots. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een MRC Grant (MR/L010933/1) en gedeeltelijk door de Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) aan het UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC) waarvan de leden afkomstig zijn van het UCL Institute of Neurology, de Universiteit van Sheffield en de MRC Protein Phosphorylation Unit aan de Universiteit van Dundee. RB ontving financiering van de MJFox Foundation voor dit werk en wordt ook gefinancierd door de Reta Lila Weston Trust.

Post-mortem hersenweefsel werd geschonken aan Queen Square Brain Bank voor neurologische aandoeningen, University College London, Instituut voor Neurologie gebruik ethisch goedgekeurde protocollen en opgeslagen voor onderzoek onder een vergunning van het menselijk weefsel autoriteit (HTA) Groot-Brittannië (nr. 12198). Zie de lijst van de gevallen gebruikt voor dit protocol (Tabel 1). 1. Bereiding van Buffers <ol><li> Bereid 1X TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) buffer: <ol><li> Bereid 10X TBS als voorraadoplossing met 500 mM Tris-HCl pH 7,4 en 1500 mM NaCl. <ol><li> Weeg 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 en 87,6 g NaCl in 800 ml zuiver water. Stel de pH met 1 M HCl en de uiteindelijke voorraad volume tot 1 L. </li></ol></li><li> Bereid de uiteindelijke concentratie van 1X TBS door verdunning van de stock 10 keer in gedestilleerd water. </li><li> Voeg proteaseremmers (PI), (1 tablet per 50 ml buffer) en Phos-stop fosfataseremmer tabletten (1 tablet per 10 ml buffer) aantrekt hij de effecten van niet-specifieke enzymatische werking van proteasen en fosfatasen. Opmerking: Hier hebben we het enzym remmer tabletten uit Roche maar ook andere commercieel verkrijgbare remmers kunnen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant gebruikt. </li></ol></li><li> Bereid TBS-SDS-buffer door het toevoegen van 5% g / v natrium dodecyl sulfaat (SDS) aan 1X TBS (pH 7,4) buffer. Verwarm de oplossing tot 60 ° C onder constant roeren met een magnetische roerder te solubiliseren SDS. </li><li> Bereid TBS-SDS-ureum buffer door ureum toe te voegen tot een eindconcentratie van 8 M w / v tot 1X TBS-SDS-buffer (pH 7,4). Verwarm de oplossing tot 60 ° C onder constant roeren op een magnetische roerder ureum lossen. </li></ol> 2. Steekproef homogenisering en Differential Ultracentrifugatie Opmerking: De volgende deel van het werk omvat de behandeling van het menselijk hersenweefsel volgens de regels van de HTA UK. Lokale standaard operationele procedures worden gevolgd op alle times. Brain monsters worden ontleed uit bevroren hersenen blokkeert en weefsel materiaal gehomogeniseerd in een microcabinet gehandhaafd op negatieve druk. Wegwerp jassen handschoenen, face-maskers, over-schoen beschermers en een veiligheidsbril worden gedragen tijdens de gehele procedure. Menselijk weefsel afval wordt na autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten voor een veilige verwijdering weggegooid. Sharps (scalpelmesjes) worden aangebracht in een daarvoor bestemde container voor insluiting en veilige verwijdering. <ol><li> Neem een stuk van bevroren menselijk weefsel (ongeveer 0,5 g gewicht van de basale ganglia regio) en snel gehakt in kleine fragmenten (ongeveer 1 mm 2) op het ijs met een kleine petrischaal en een steriel scalpel. Gebruik een afzonderlijke petrischaal en scalpel voor elk monster. Verzamel de gemalen weefsel in een 15 ml buis en voeg 10 volumina ijskoude 1XTBS buffer aan de buis. </li><li> Homogeniseer de monsters onder toepassing van een mechanische homogenisator bij 20000 rpm gedurende 10 sec. Koelen op ijs gedurende 2 minuten. Herhaal deze stap drie keers. Opmerking: Dit wordt gedaan zodat de monsters niet worden opgewarmd onder homogeniseren. </li><li> Verhelderen door centrifugering bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gooi pellet van niet-gehomogeniseerde materiaal. </li><li> Neem supernatant (ruw homogenaat), toe te voegen aan centrifugebuizen (grootte van de buis hangt af van de grootte van de rotor) polycarbonaat en het evenwicht zorgvuldig. Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Bewaar bovenstaande vloeistof aangezien dit de TBS-oplosbare fractie. </li><li> Was de pellet twee keer in vijf volumes 1X TBS buffer en centrifugeer telkens bij 100.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi de supernatanten. <ol><li> Resuspendeer de uiteindelijke pellet door sonicatie de pellet gedurende 10 sec bij 20 KHz ongeveer 5 volumes 1X TBS-SDS bij kamertemperatuur. Opmerking: Voor toevoeging van de SDS bevattende buffer monsters bij 10 ° C worden gebracht VIB neerslaan te voorkomen. </li><li> Ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 30 min bij 25 ° C. </li></ol></li><li> Bewaar bovenstaande vloeistof aangezien dit the SDS oplosbare fractie. <ol><li> Was pellet tweemaal in 5 volumes 1X TBS-SDS-buffer bij kamertemperatuur. Centrifugeer telkens bij 100.000 xg gedurende 15 min bij 25 ° C. </li><li> Oplosbaar de uiteindelijke pellet in 50 pl 1X TBS-SDS-buffer UREUM met een sonicator ingesteld op 20 kHz gedurende 10 seconden om volledige solubilisatie bereiken; Dit wordt genoemd het ureum oplosbare fractie. </li></ol></li><li> Testen elke fractie voor totale eiwitgehalte onder toepassing van een commercieel eiwit assay kit volgens protocol van de fabrikant. Verdun TBS-SDS-ureum monsters 1: 1 met 1X TBS buffer verenigbaarheid met proteïne assay reagens mogelijk maken. Freeze monsters in kleine porties (20 pl) bij -80 ° C aan vries-dooi cycli verminderen. Opmerking: Het toevoegen van 10% glycerol monsters wordt aanbevolen voor langdurige opslag bij -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting van monsters en het analyseren van resultaten <ol><li> Lopen monsters van TBS, TBS-SDS en TBS-SDS-Urea extracten op 10-put 4-12% Bis-Tris polyacrylamidegelmet MOPS als loopbuffer met standaardtechnieken. Zie Gallagher en Chakravarti (2008) 29 voor een gedetailleerde western blot protocol. </li><li> Belasting 10 ug eiwit uit elk monster in elke rij met een molecuulgewicht marker voor TBS en SDS en ureum fracties. </li><li> Run gel bij 200 V gedurende 1 uur of totdat de blauwe kleurstof uit laadbuffer heeft de bodem van de gel bereikte. </li><li> Transfer van eiwitten gels elektroforetisch naar nylon membranen 28, eerst in 100% methanol en daarna vooraf bevochtigd in overdrachtbuffer bevattende 20% methanol. Geef een identificatiemerkteken op de blot om het eiwit kant en de oriëntatie van het molecuulgewicht size markers. <ol><li> Sandwich de gel met het membraan langs natte papieren filter. Correcte plaatsing van het membraan essentieel met het membraan tussen de gel en de anode. Voer de transfer voor 2 uur bij 40 V. </li><li> Make up 1X PBS-tween (1X PBS-T) buffer: Los 1 tablet van PBS in 200 mlwater 0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride en 0,137 M natriumchloride, pH 7,4 verkregen. </li><li> Blokkeer het membraan in 5% BSA-oplossing in 1 x PBS-T gedurende 30 min met schudden bij 70 rpm. Dit voorkomt niet-specifieke binding van primair antilichaam aan het membraan. </li></ol></li><li> Probe het eiwit blot met 6 ml α-syn primair antilichaam Syn-1 (BD Biosciences, muis monoklonaal antilichaam) bij 1: 750 verdunning (O / N bij 4 ° C), gevolgd door een reeks wassingen met 1 x PBS-T ( 3 x 5 min per keer) 28. </li><li> Incubeer de vlek met de geschikte HRP geconjugeerd secundair antilichaam bij 1: 2000 verdunning gedurende 30 min. Voer een reeks wassingen (3 x 5 min per keer) met 1 x PBS-T. <ol><li> Dompel blots in versterkte chemiluminescentie oplossing 15 seconden in een donkere kamer. Cover vlekken met een plastic folie en plaats autoradiografie films tegen de vlek met eiwit kant naar boven in een lichtdichte cassette naar de juiste signalen (juiste grootte bands) vast te leggen. </li><li> Ontwikkelen autoradiografie films in een geautomatiseerd ontwikkelaar. Opmerking: Vlekken kunnen ook handmatig worden ontwikkeld met behulp van ontwikkelaar en fixeer van een commerciële bron in het geval van een automatische ontwikkelaar machine is niet beschikbaar. </li></ol></li><li> Incubeer de western blot met 6 ml van western blot strippen buffer gedurende 10 min met een constante schudden om de vlek van α-syn antilichaam signaal strippen. Volg de stappen 3.43 tot en met 3.6.2 met behulp van beta-actine primaire antilichaam (muis monoklonaal) op 1: 8000 verdunning. </li><li> Scannen en converteren van de laatste afbeelding in een Tiff beeld en de maatregel dichtheden met behulp van NIH ImageJ voor kwantificering doeleinden (een gratis te downloaden software). Opmerking: De software maakt het lezen van dichtheden van relatieve interessegebied (de juiste grootte groepen) en de gegevens worden uitgedrukt als een verhouding van α-syn density / β-actine (a-huishoudgen gen) als willekeurige eenheden of zijn recht wanneer een huishoudpersoneel gen niet geldig (zoals in het geval van ureum oplosbare samples). </li&gt; </ol>

<ol><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+a+decade+od+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A-synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388, 839-840 (1997).</li>
<li>Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+filamentous+inclusions+of+Lewy+bodies+from+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).</li>
<li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).</li>
<li>Ahmed, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology%2C+pathophysiology+and+genetics+of+multiple+system+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroptahol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy.</a> Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).</li>
<li>Ploymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276, 2045-2047 (1997).</li>
<li>Kruger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ala30Pro+mutation+in+the+gene+encoding+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease.</a> Nat Genet. 18, 106-108 (1998).</li>
<li>Zarranz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+mutation%2C+E46K%2C+of+alpha-synuclein+causes+Parkinson+and+Lewy+Body+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia.</a> Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).</li>
<li>Proukakis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+alpha-synuclein+missense+mutation+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease.</a> Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).</li>
<li>Kiely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synucleinopathy+associated+with+G51D+SNCA+mutation%3A+a+link+between+Parkinson%27s+disease+and+Multiple+System+atrophy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy?</a> Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G51D+alpha-synuclein+mutation+causes+a+novel+Parkinson-pyramidal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome.</a> Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302, 841(2003).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364, 1167-1169 (2004).</li>
<li>Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+neuropathology+of+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetic neuropathology of PD.</a> Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).</li>
<li>Fauvet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+in+central+nervous+system+and+from+erythrocytes%2C+mammalian+cells%2C+and.+Escherichia+coli+exists+predominantly+as+disordered+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer.</a> J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).</li>
<li>Bartels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+occurs+physiologically+as+a+helically+folded+tetramer+that+resists+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation.</a> Nature. 477, 107-110 (2011).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+insoluble+alpha-synuclein+in+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+of+Dis%22%5BJournal%5D)">Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies.</a> Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+alpha-synuclein+in+multiple+system+atrophy+differs+from+that+of+dementia+with+Lewy+bodies+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 76, 87-96 (2001).</li>
<li>Miller, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+blood+and+brain+from+familial+Parkinson%27s+disease+with+SNCA+locus+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication.</a> Neurology. 62, 1835-1838 (2004).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+solubility+and+phosphorylation+of+alpha-synuclein+over+the+course+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).</li>
<li>Mamais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+solubility+and+aggregation+properties+in+G2019S+LRRK2+Parkinson%27s+disease+brains+with+Lewy+Body+pathology+compared+to+idiopathic+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+of+Dis%22%5BJournal%5D)">Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases.</a> Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).</li>
<li>Lashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+clinical%2C+pathological%2C+biochemical+and+genetic+study+of+fused+in+sarcoma+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies.</a> Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).</li>
<li>Brelstaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transportin-1%3A+a+marker+of+FTLD-FUS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Transportin-1: a marker of FTLD-FUS.</a> Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Nuber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+progressive+dopaminergic+phenotype+associated+with+neurotoxic+conversion+of+%CE%B1-synuclein+in+BAC-transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats.</a> Brain. 136, 412-432 (2013).</li>
<li>Tofaris, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+dopaminergic+nerve+cells+odf+the+substantia+nigra+and+olfactory+bulb+in+mice+transgenic+for+truncated+human+a-synuclein+%281-120%29%3A+implications+for+Lewy+Body+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders.</a> J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li>
<li>Gallagher, S., Chakravarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis+%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis .</a> J Vis. Exp. (16), e759(2008).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+alpha-synuclein+accumulation+in+multiple+system+atrophy%2C+Parkinson%27s+disease+and+progressive+supranuclear+palsy%3A+a+comparative+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation.</a> Brain. 133, 172-188 (2010).</li>
<li>Paleologou, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+elevated+levels+of+soluble+%CE%B1-synuclein+oligomers+in+post-mortem+brain+extracts+from+patients+with+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies.</a> Brain. 132, 1093-1101 (2009).</li>
<li>Culvenor, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-A%CE%B2+component+of+Alzheimer+s+disease+Amyloid+%28NAC%29+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited.</a> American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).</li>
<li>McKeith, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+dementia+with+Lewy+bodies%3A+third+report+of+the+DLB+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium.</a> Neurology. 65, 1863-1872 (2005).</li>
<li>Lee, B. R., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+immunodetection+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved immunodetection of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 6, e23939(2011).</li>
<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een biochemische protocol voor extractie en het onderzoek van de differentiële oplosbaarheid eigenschappen van de monomere, oligomere en geaggregeerd α-syn van zieke hersenen met behulp van denaturerende gel bedrijfsomstandigheden. Dit is een gevestigde techniek te bestuderen geaggregeerde α-syn 17, 18, ​​20, 21 een eiwit dat normaal oplosbaar is in zijn natieve vorm, maar krijgen amyloidogene of verhoogde aggregatie treffen met ziekteprogressie of genetische mutaties. Desondanks hebben sommige groepen kleine variaties in SDS-concentraties in hun buffers (8% of 10% in plaats van 5%) 21,22, 30. De SDS is een anionisch detergens en oplosbaar maakt α-syn oligomeren die kunnen bestaan ​​membraangebonden vormen van α-syn, terwijl ureum, een chaotroop reagens denatureert de onoplosbare geaggregeerde en fibrillair of amyloïdogene vormen van α-syn 20. In dit verband een systematische studie van Paleologou ea 31 onderzochten de stabiliteitvan α-syn oligomeren en fibrillen met verschillende concentraties ureum (6,5 - 8 M) of SDS (0,25-2%) en meldde dat oligomeren stabiel in SDS concentraties, maar niet bij hoge concentraties van ureum. Hun FILA-1-antilichaam, specifiek voor α-syn oligomeren en fibrillen waargenomen hogere concentraties van fibrillen in 6,5 M ureum concentratie onder niet-denaturerende omstandigheden. De buffer concentraties die in dit protocol getrouwe afspiegeling hetgeen beschreven in Culvenor et al. (1999) 32. De anatomische gebieden van de hersenen voor biochemische extractie van onoplosbare α-syn moet zorgvuldig worden geselecteerd en dit moet α-syn LB en LN belasting reflecteren afhankelijk van progressie van de ziekte 33,34. De gevallen die hier gebruikt zijn basale ganglia monsters uit de neocorticale en limbische subtypes van PD reflecterende laat en tussenstadia van PD progressie volgens McKeith ctriteria 34. Op de Queen Square Brain Bank, de ene helft van de hersenenroutinematig gefixeerd in formaline voor histochemische analyse en de andere helft wordt zorgvuldig ontleed in verschillende anatomische gebieden en flash bevroren en opgeslagen bij -80 ° C vriezer voor verdere biochemische en DNA / RNA-analyse studies. Volgende formaline fixatie van de hersenen en de dissectie door neuropathologists, wordt immunohistochemie uitgevoerd met behulp van α-syn antilichaam en resultaten gearchiveerd. Ook als routine procedure, de pH van het hersenweefsel wordt gemeten bij aankomst als maat agonale toestand van het hersenweefsel. Dit vormt een stevige basis voor de kwaliteit van weefsel bewaren van biochemische analyse. Onze gegevens Hier blijkt dat er meer oplosbaar SDS α-syn monomeer in PD gevallen in vergelijking met controles; met name de neocortical PD gevallen een hogere α-syn load opzichte van de limbische PD ras. De neocorticale gevallen vertegenwoordigen meer progressie van de PD α-syn pathologie in de neocorticale regio&#39;s zoals de frontale en pariëtale corTices 33,34. De limbische PD gevallen hoger LB scores in de basale voorhersenen / limbische gebieden gebieden zoals de amygdala, transentorhinal en cingulate regio. Voor zinvolle gegevens en statistische analyse, moet men minstens 4 gevallen van elk cohort draaien. Eveneens hebben we geen statistische analyse van de vlek hier gepresenteerde gegevens geprobeerd. Er moet worden opgemerkt dat verschillende antilichamen verschillende vormen / samenstelling van hogere orde α-syn oligomeren herkent en ieder kan zijn eigen relatieve gevoeligheid en de voorkeur hebben. Dit blijkt uit de resultaten van Tong et al. 29 wanneer zij aantonen dat 4 verschillende α-syn-antilichamen (Syn-1, SS, Onco en LB509) werd verkregen resultaten veranderlijk althans α-syn oligomeren / aggregaten. De α-syn monomeren in vergelijkbare mate herkend door alle 4 antilichamen hoewel deze variatie kunnen hebben naargelang de α-syn antilichaamepitoop bevindt zich ofwel in het N-eindstandige of Cterminale 29. Evenzo specifieke antilichamen voor fosfo-alfa- synucleine bepalen afzonderlijke hoogmoleculaire α-synucleïne species 20,21. In de hier beschreven protocol, heeft de sterk gekenmerkt antilichaam Syn-1 toegepast 19-21. Het is echter belangrijk om te overwegen nieuwe antilichaam op Western blots validatie door middel van antilichaam pre-absorptie experimenten en ook overexpressie en knockdown van het eiwit in cellen. Het is belangrijk om andere variaties die door onderzoekers hebben toegepast overwegen om kleinere fragmenten van α-syn en tetramere of instabiele α-syn vormen te bepalen. Dit kan onder milde fixatie van membranen met 0,4% PFA in PBS met afgeknotte vormen van α-syn 35 of behandeling van het monster homogenaten met cross linkers behouden om tetrameren 36 stabiliseren. Nauwkeurige biochemische evaluatie van de eiwitten met behulp van post-mortem tissue vereist minimalisering van enzymatische eiwitafbraak en modificatie. Het is daarom raadzaam om weefsel te gebruiken met de kortste postmortale vertragingen en / of selecteer geëvenaard monsters binnen het geval cohorten. Immunohistochemie met standaard antilichamen α-syn immunohistochemie dient voorafgaand aan het isoleren protocol worden uitgevoerd. De omvang van α-syn pathologie is zeer variabel en kan per geselecteerde gebieden. Het is raadzaam om de regio&#39;s met een overvloed aan pathologie te selecteren als een positieve controle voor een optimale opbrengst bij elke run. Het gebruik van proteaseremmers en eventueel fosfatase remmers voor ongewenste enzymatische afbraak te voorkomen na de vrijgave van intracellulaire proteasen of fosfatasen die tijdens cellysis en handhaven van de monsters bij 4 ° C cruciaal. Het is belangrijk dat alle monsters in de batch experimenten gelijkmatig en consistent worden behandeld met intra-user variaties voorkomen; meerdere freeze-dooi cycli moet worden vermeden omdat dit kan mogelijk intrekken posttranslationele modificaties zoals fosforylering. Een kritisch punt in gedachten te houden bij het onderzoek van een groot aantal monsters is dat de gegevens van immunoblots genormaliseerd zou moeten zijn om één monster, dat moet parallel lopen aan alle andere monsters op de gels, en alle gegevens gerefereerd aan dat monster. Dit wordt gedaan om normalisatie van immunoblot gegevens te garanderen tussen verschillende vlekken. Dit is het in onze recente studie 22 gevolgde methode. Opgemerkt zij dat voor de achtergrond ECL laag te houden, de blots mag niet uitdrogen op elk moment tijdens de western blot protocol. Bovendien moet zeer lange blootstelling (&gt; 10 min) aan autoradiografie films worden vermeden omdat dit zal leiden tot verzadiging van ECL-signaal en zullen leiden tot onnauwkeurige kwantificering. Dit bovenstaande protocol is een relatief eenvoudige techniek met behulp van gemeenschappelijke laboratorium reagentia en inmenten en kunnen een waardevol instrument voor het onderzoeken van de pathofysiologie van α-syn eiwit PD onderzoek. Deze methode kan alleen worden uitgebreid met geschikte aanpassingen aan de studie van α-syn biologie α-syn transgene dieren, maar ook voor andere neurodegeneratieve aandoeningen die abnormale afzettingen van geaggregeerde eiwitten zoals AD, MSA, DLB, HD en frontotemporaldementias. Echter de Western blot data beschreven kunnen ook worden gevalideerd middels enzymgekoppelde immunosorbent assays met behulp van antilichamen voor specifieke vormen van α-syn 31.

Een van de belangrijkste pathologische kenmerken die bij verschillende neurodegeneratieve ziekten is de vorming van abnormale proteïneaggregaten die voorkomt in een eiwit / ziektespecifieke manier 1. Er zijn dus de karakteristieke extraneuronale amyloid-beta plaques en geaggregeerde hypergefosforyleerd tau afzettingen in neuronen bij de ziekte van Alzheimer (AD); de geaggregeerde α-syn afzettingen in Lewy Bodies (LBS), die intraneuronale insluitsels zijn, en ook binnen dystrofische neuronale processen genaamd Lewy neurieten (LNS) in PD, PD dementie en dementie met Lewy bodies (DLBs) 2-4. Abnormale α-syn deposito&#39;s zijn ook te zien in het keurmerk laesies van gliale cytoplasmatische inclusies in MSA 5. Bij de ziekte van Huntington, zijn er de karakteristieke Poly-Q deposito&#39;s, en abnormale Tar DNA-bindend eiwit-43 en gesmolten in sarcoom eiwitten (FUS) worden gedeponeerd in frontotemporale dementie. Belangrijk voor PD, hebben α-syn genmutaties gevonden om cause autosomaal dominant PD 11/06. Bovendien, α-syn gen verdrievoudigen 12 en dubbel 13 veroorzaakt ook familiale PD aldus verhoogde α-syn expressie die linken naar de pathomechanismen van PD. Met name, zowel sporadische en familiale PD gevallen haven abnormale afzettingen van α-syn pathologie 14. De huidige beschikbare behandelingen voor PD zijn alleen palliatief en hebben geen effect op het stoppen of vertragen van de onverbiddelijke progressie van de ziekte. α-syn wordt overvloedig tot expressie gebracht in de menselijke hersenen en maakt ongeveer 1% van het totale eiwit hersenen. Het is aanwezig in het bijzonder binnen de neuronen, maar kunnen zij het in geringere hoeveelheden binnen gliacellen bestaan. Een omstreden punt is de natieve structuur van α-syn dat kan voorkomen als willekeurig monomeer 15 of 16 gevouwen tetrameer. Tijdens ziekte, α-syn verandert de conformatie die het mogelijk maakt om misfolded krijgen en dit proces wordt aangenomen dat de oorzaak van de ziekte te pathogeNesis. Ondanks een aantal jaren van onderzoek naar de pathofysiologische aspecten van α-syn en ziekte, hebben de precieze oorzaken van de ziekte mechanismen ongrijpbaar 14 gebleven. Studies met behulp post-mortem analyse van Parkinson hersenen tot dusver ontvangen belangrijke aanwijzingen betreffende de normale en abnormale biologie van α-syn zowel sporadische PD en ook Pd geassocieerd met mutaties in de LRRK2 gen 17-22. Hier is een biochemische extractie protocol (zie schema in figuur 1) naar steeds onoplosbaar α-syn afzettingen uit menselijke post-mortem hersenweefsel PD α-syn aggregaten herbergen verschillende mate beschreven. Deze techniek kan ook worden aangepast met modificaties in buffer samenstellingen geaggregeerde eiwitten van andere neurodegeneratieve ziekten 23,24 bestuderen en ook van de hersenen transgeen dier weefsel 25-27. De belangrijkste overweging voor de aanpassingen zijn de verschillen in solubiteit en de totale hoeveelheden van de respectieve eiwitten waarvan sommige voornamelijk nucleaire en kunnen hoog-zout buffers nodig voor optimale extractie getoond FUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor tablets&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE transfer buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrane&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM filter paper</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris gels 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC protein assay kit&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Thickwall Beckman Polycarbonate tubes</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Western blot stripping buffer</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>beta-actin primary antibody (mouse monoclonal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ model no&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Ultracentrifuge Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogeniser</td><td>Jenke and Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare alpha-synuclein van parkinson brains

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alfa-synucleïne (α-syn) eiwit wordt overvloedig tot expressie hoofdzakelijk in neuronen, en bestaat in verschillende vormen - monomeren, tetrameren, oligomeren en fibrillen. Tijdens ziekte, α-syn conformationele veranderingen ondergaat oligomeren en hoogmoleculaire aggregaten molecuulgewicht die de neiging hebben het eiwit meer onoplosbaar te vormen. Abnormaal geaggregeerde α-syn is een neuropathologisch kenmerk van de ziekte van Parkinson (PD), dementie met Lewy bodies (DLB) en meerdere systeem atrofie (MSA). Biochemische karakterisering en analyse van onoplosbare α-syn gebruiken buffers met toenemende detergent sterkte en high-speed ultracentrifugatie een krachtig instrument voor de ontwikkeling van α-syn pathologie geassocieerd met de progressie van de ziekte te bepalen. Dit protocol beschrijft de isolatie van steeds onoplosbaar / geaggregeerde α-syn uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Deze methode kan worden aangepast met modificaties studies van normale en abnormale α-syn biologie in transgene diermodellen herbergen verschillende α-syn mutaties en andere neurodegeneratieve ziekten die afwijkende fibrillaire afzettingen van eiwitten in verband met hun functie pathologieën.

TBS, SDS en ureum oplosbare eiwitten geëxtraheerd uit basale ganglia overeenkomstig de in figuur 1 protocol werden op gels en immunoblotting met de Syn-1 monoklonaal α-syn primair antilichaam. De TBS oplosbare fracties toonde de aanwezigheid van monomere α-syn (~ 14 kDa) in de PD en controle onderzochte gevallen (figuur 2A). De SDS oplosbare fracties toonden ook overvloedig monomere α-syn in alle drie subtypen gevallen bestudeerd als weergegeven in de lage belichting blot (figuur 2C). De PD gevallen bleek ook hoger molecuulgewicht (MW) α-syn soorten gezien op de hoge blootstelling blot, die waarschijnlijk oligomeren (figuur 2C) te zijn. De ureum oplosbare fracties uit PD gevallen vertoonden verhoogde hoeveelheden van α-syn monomeren, oligomeren en geaggregeerde species vergeleken met gevallen beheersen. De neocorticale idiopathische PD gevallen demonstreren hogere hoeveelheden aggreg<html> ated α-syn soorten, terwijl het limbische gevallen tonen tussenliggende niveaus van onoplosbare α-syn. Zowel de SDS en ureum fracties uit idiopathische PD gevallen demonstreren variabele niveaus van afgeknotte α-syn producten bij 12 kDa en 6 kDa zoals beschreven 20. Daarentegen vertoonde de controlegevallen geen onoplosbare of geaggregeerde α-syn (figuur 2E) tonen. Semi-kwantitatieve maatregelen dichtheid weerspiegelen de hoeveelheid LB belasting als categoriesd met α-syn immunohistochemie aantonen van de onoplosbaarheid van geaggregeerde α-syn (Figuur 2B, 2D, 2F) in neocorticale en limbische PD gevallen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van onoplosbare α -syn extractieprocedure.rGebruik = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger immunoblots van α -syn niveaus van de PD en de controle van menselijk weefsel. TBS, SDS en ureum oplosbare fracties van de basale ganglia (een regio die α-syn pathologie havens in PD gevallen) van idiopathische PD gevallen en neurologisch normale (controle) hersenen werden geanalyseerd op de aanwezigheid van α-syn via Western immunoblot. 10 ug eiwit werd geladen op elke baan. In TBS fracties (A), voornamelijk α-syn monomeren zijn aanwezig in alle gevallen. In SDS fracties (C) worden enkele oligomeren van α-syn gezien met monomeren hoofdzakelijk in de PD weefsel. In ureum fracties (C) monomeren, oligomeren en geaggregeerde α-syn variabel worden uitgedrukt in de PD gevallen reflecting hun respectieve LB belasting. Het neurologisch normale controlemonsters tonen de aanwezigheid van slechts geringe hoeveelheden monomere α-syn. Let op eventuele afbraakproducten van α-syn gezien in sommige gevallen met hoge LB load. De vaste pijlpunt geeft de monomere vorm van α-syn. De * eventueel is een C-terminaal afgeknotte vorm van α-syn zoals eerder beschreven 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Geval </td><td> Seks </td><td> leeftijd bij overlijden yrs </td><td> post-mortem vertraging (uur) </td><td> pH weefsel </td></tr><tr><td> Neocorticale 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neocorticale 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Limbisch 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Limbisch 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Controle 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Control 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Beperkte demografie van de gevallen gebruikt

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Het algemene doel van deze methodologie is het extraheren van oplosbaar en onoplosbaar alpha-synucleïne uit post-mortem Parkinsoniaanse hersenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar de ziekte van Parkinson. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief eenvoudige techniek is waarbij gebruik wordt gemaakt van gangbare laboratoriumreagentia en instrumenten.Nadat de benodigde oplossingen en buffers zijn bereid, begint u met het plaatsen van een monster van 0,5 gram bevroren weefsel van de basale ganglia op een kleine Petrischaal. Gebruik een steriel scalpelblad om het weefsel snel fijn te hakken in fragmenten van één millimeter vierkant. Verzamel het fijngehakte weefsel in een buisje van 15 milliliter en voeg 10 volumes ijskoud, 1X TBS toe aan het buisje.Homogeniseer de monsters met een mechanische homogenisator bij 20.000 rpm gedurende 10 seconden. Koel ze vervolgens twee minuten op ijs. Herhaal de homogenisatie drie keer, waarbij elke keer wordt afgekoeld op ijs.Centrifugeer het homogenisaat bij 10,000 gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Overbreng het supernatant van het ruwe homogenisaat naar polycarbonaat centrifugebuizen en centrifugeer bij 100,000 gs gedurende één uur bij vier graden Celsius. Overbreng het supernatant naar gekoelde buizen op ijs en bewaar dit als de TBS-oplosbare fractie.Was in vijf volumes 1X TBS-buffer en centrifugeer 15 minuten bij 100.000 gs bij vier graden Celsius. Zuig het supernatant af en gooi dit weg. Herhaal vervolgens de wasstap.Grondig wassen van de pellets tussen de ultracentrifugatiestappen door is cruciaal voor het succes van deze procedure. Nadat de monsters een temperatuur van 10 °C hebben bereikt om SDS-precipitatie te voorkomen, voegt u vijf volumes 1X TBS-SDS toe en resuspendeert u de uiteindelijke pellet door 10 seconden te soniceren bij 20 kHz bij kamertemperatuur. Ultracentrifugeer 30 minuten bij 100.000 g bij 25 °C.Breng na ultracentrifugatie het supernatant over naar gekoelde buisjes op ijs en bewaar dit als de SDS-oplosbare fractie. Voeg vijf volumes 1X TBS-SDS-buffer op kamertemperatuur toe aan het pellet en centrifugeer 15 minuten bij 100 000 gs bij 25 °C. Verwijder de wasbuffer en herhaal de wasstap.Nadat het supernatant is weggegooid, voegt u 50 µL 1X TBS-SDS-Urea toe en solubiliseert u dit met een sonicator ingesteld op 20 kHz gedurende 10 seconden. Label dit monster als de ureasolubiele fractie. Het is essentieel om er volledig op toe te zien dat alle onoplosbare eiwitten tijdens de procedure worden geëxtraheerd.Verdun TBS-SDS-Urea-monsters één-op-één met 1X TBS-buffer om compatibiliteit met eiwitassay-reagentia mogelijk te maken, en bepaal het totale eiwitgehalte van elke fractie met een commerciële eiwitassay-kit volgens het protocol van de fabrikant. Verdeel de monsters in aliquoten van 20 µL met 10% glycerol om toekomstige vries-dooi-cycli te verminderen, en bewaar deze bij -80 °C. Laad 10 µL van de TBS-, TBS-SDS- en TBS-SDS-Urea-extracten samen met een molecuulgewichtmarker op een 10-wells, 4 tot 12% Bis-Tris polyacrylamidegel met MOPS als loopbuffer met behulp van standaardtechnieken. laat de gel een uur lang lopen op 200 volt, of totdat de blauwe kleurstof uit de laadbuffer de onderkant van de gel heeft bereikt. Bevochtig een nylon membraan in 100% methanol en week dit vervolgens in transferbuffer met 20% methanol. Maak een identificatiekenmerk op de blot om de eiwitzijde en de oriëntatie van de molecuulgewichtmarkers te bepalen.Plaats de gel samen met het membraan tussen nat filterpapier. Voer de overdracht twee uur lang uit bij 40 volt. Blokkeer in een 5% BSA-oplossing in 1X PBS-T gedurende 30 minuten onder schudden bij 70 rpm om aspecifieke binding van het primaire antilichaam aan het membraan te voorkomen.Sondeer de protein blot door deze overnight bij vier graden Celsius te incuberen met zes milliliter van het primaire alpha-synucleïne antilichaam Syn-1, verdund 1:750 in PBS-T. Was het membraan de volgende dag drie keer gedurende vijf minuten per keer met 1X PBS-T. Incubeer de blot vervolgens gedurende 30 minuten met het geschikte HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam, verdund 1:2.000 in PBS-T.Was het membraan zoals voorheen met 1X PBS-T. Dompel de blots onder in een enhanced chemiluminescence-oplossing volgens de instructies van de fabrikant in een donkere kamer. Dek de blots af met vershoudfolie en leg het signaal vast met behulp van autoradiografie.Incubeer na het maken van de beelden de western blot gedurende 10 minuten met zes milliliters western blot stripping buffer onder constant schudden om het signaal van het alpha-synucleïne-antilichaam van de blot te verwijderen. Herhaal de western blot-procedure om het membraan te sonderen met een primair beta-actine-antilichaam in een verdunning van 1:8.000. Scan het uiteindelijke beeld, converteer dit naar een Tiff-afbeelding en meet de densiteiten met NIH ImageJ voor kwantitatieve doeleinden.De volgende afbeeldingen zijn representatieve immunoblots van de alpha-synucleïnespiegels in menselijk weefsel van de basale ganglia van PD-patiënten en controles. De TBS-, SDS- en ureumoplosbare fracties werden geanalyseerd op de aanwezigheid van alpha-synucleïne met behulp van western immunoblotting. In elke lane werd 10 milligram proteïne geladen.In de TBS-fractie zijn in alle gevallen alpha-synucleïne-monomeren aanwezig. Het asterisk staat mogelijk voor een C-terminaal getrunceerde vorm van alpha-synucleïne. In de SDS-fractie zijn, naast monomeren, enkele oligomeren van alpha-synucleïne zichtbaar, aangegeven door de massieve pijlpunten in het PD-weefsel.In de ureumfractie komen monomeren, oligomeren en geaggregeerd alfa-synucleïne in variabele mate voor in de PD-gevallen, wat hun respectievelijke Lewy-body-belasting weerspiegelt. De neurologisch normale controlemonsters vertonen slechts kleine hoeveelheden monomeer alfa-synucleïne. Eenmaal onder de knie, kan deze eiwitextractietechniek binnen één werkdag worden uitgevoerd, gevolgd door een western-immunoblot de volgende dag, mits correct uitgevoerd.Na de ontwikkeling van deze techniek kregen onderzoekers op het gebied van Lewy-body-biologie de mogelijkheid om onoplosbare en geaggregeerde alpha-synucleïne-soorten te onderzoeken in pathologisch menselijk weefsel en in in-vivo diermodellen. Houd er rekening mee dat het werken met niet-gefixeerd menselijk weefsel voorzorgsmaatregelen vereist; handschoenen en laboratoriumjassen moeten gedurende alle handelingen worden gedragen.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates an immunofluorescence assay to detect neurodegenerative disease-specific alpha-synuclein aggregates on skin biopsy sections. Free-floating immunostaining is employed to fluorescently label the carboxyl-terminal hydrolase and the alpha-synuclein aggregates in the dermal neurons. Under a confocal microscope, cells with fluorescence from both antibodies indicate the presence of alpha-synuclein aggregates in the dermal neurons.

An Immunofluorescence Assay to Detect Alpha-Synuclein Aggregates in a Skin Biopsy Section

This video demonstrates the process of quantifying alpha-synuclein accumulation in embryonic mouse dopamine neurons pre-treated with alpha-synuclein pre-formed fibrils. It outlines the steps for fixing, staining, and quantifying the dopamine neurons containing alpha-synuclein aggregates using immunofluorescence.

Studying Alpha-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons

Source: Bétemps, D., et al.,  Detection of Disease-associated α-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated α-synuclein. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the procedure to detect neurodegenerative disease-associated protein α-synuclein in brain tissue from transgenic mice using ELISA. The steps include tissue homogenization, centrifugation, and ELISA detection of α-synuclein protein to quantify its disease-associated forms.

Detecting Neurodegenerative Disease-Associated Protein α-Synuclein Using ELISA

Met behulp van atoomkrachtmicroscopie in combinatie met biopanning-technologie hebben we een negatief en positief biopanning-systeem gemaakt om antilichamen te verkrijgen tegen ziektespecifieke eiwitvarianten die aanwezig zijn in elk biologisch materiaal, zelfs bij lage concentraties. We zijn erin geslaagd om antilichamen te verkrijgen voor TDP-43-eiwitvarianten die betrokken zijn bij Amyotrofe Laterale Sclerose.

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Hier presenteren we een protocol voor een vrij zwevende indirecte immunofluorescentie assay op de huid biopsie secties die het mogelijk maakt voor de identificatie van de ziekte specifieke conformatie varianten van Alfa synuclein betrokken bij de ziekte van Parkinson en meerdere eiwitten van de perifere zenuwstelsel.

Targeting Alfa Synuclein aggregaten in cutane perifere zenuwvezels door Free-floating immunofluorescentie assay

Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.

Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Dit werk analyseert de vectordosis en blootstellingstijd die nodig is om neuro-inflammatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren in dit preklinische model van de ziekte van Parkinson. Deze vectoren die coderen voor de menselijke α-synucleïne worden afgeleverd in de substantia nigra om de synucleïnepathologie geassocieerd met de ziekte van Parkinson samen te vatten.

Analyse van het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor menselijk α-synucleïne

Dit protocol beschrijft een methode voor intranasale toediening van α-synucleïneaggregaten. Deze methode geeft inzicht in de voortplanting van α-synucleïne van het reukslijmvlies naar de bulbus olfactorius bij de ziekte van Parkinson.

Techniek voor intranasale toediening van α-synucleïne-aggregaten

Leer de sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare alpha-synucleïne uit post-mortem hersenweefsel van Parkinsonpatiënten. Deze methode maakt analyse van eiwitaggregatie mogelijk.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Meer video's verkennen