דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

המרה ישירה של fibroblasts לב (CFS) לשריר לב מושרה (iCMS) מחזיקה פוטנציאל גדול לרפואת רגנרטיבית ידי מתן אסטרטגיות חלופיות לטיפול במחל לב. המרה זו הושגה על ידי ביטוי בכפייה של גורמים מוגדרים כגון Gata4 (G), Mef2c (M) וTbx5 (T). באופן מסורתי, iCMS מופקים על ידי קוקטייל של וירוסים להביע גורמים בודדים אלה. עם זאת, תכנות מחדש יעילות נמוכה יחסית ורוב במבחנה G, M, T-transduced fibroblasts לא הפך לתכנות מחדש באופן מלא, ולכן קשה ללמוד את מנגנוני תכנות מחדש. לאחרונה הראו כי ההרכב של G, M, T הוא חיוני לתכנות מחדש ICM יעיל. Stoichiometry אופטימלי של G, M, T עם רמה גבוהה היחסית של M והרמות נמוכות של G ו- T המושגת באמצעות וקטורנו polycistronic MGT (להלן כMGT) יעילות תכנות מחדש גדלה באופן משמעותי ואיכות ICM השתפרה במבחנה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת לייצור iCMS עם מבנה MGT מfibroblasts לב. בידוד של fibroblasts לב, דור של וירוס לתכנות מחדש והערכה של תהליך תכנות מחדש כלולים גם לתת במה לדור יעיל ושחזור של ICMS.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בעכברים בילוד. טיפול בבעלי חיים וניסויים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי בעלי החיים רפואת החטיבה של המעבדה (DLAM) באוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל.

1. הכנת חוצצים ומדיה

  1. הכן פיברובלסטים בינוניים (FB): תוספת 500 מיליליטר תקשורת IMDM עם 100 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) ו -6 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין.
  2. הכן בינוני ICM: תוספת 400 מיליליטר DMEM תקשורת עם 100 מיליליטר תקשורת M199 ו- 50 מיליליטר FBS.
  3. הכן בינוני B27: 490 מיליליטר מוסף RPMI1640 תקשורת עם תקשורת B27 10 מיליליטר.
  4. להכין מדיום תרבות פלאט-E: תוספת 500 מיליליטר DMEM תקשורת עם FBS 50 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין ו -5 מיליליטר חומצות אמינו לא חיוניות.
  5. הכן בינוני transfection פלאט-E: תוספת 500 מיליליטר DMEM תקשורת עם FBS 50 מיליליטר ו 5 מיליליטר חומצות אמינו לא חיוניות.
  6. Prepare מצופה ג'לטין 24 צלחת גם: הוסף 0.5 מיליליטר 0.1% פתרון ג'לטין ולשל 24 צלחת גם, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 10 דקות ולשאוב ממש לפני השימוש.
  7. הכן חיץ תיוג FACS: תוספת 500 מיליליטר DPBS עם 10 מיליליטר FBS ו -2 מיליליטר EDTA (0.5 מ ') כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מ"מ. עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. הכן MACS מיון חיץ: תוספת 500 DPBS מיליליטר עם 2.5 BSA ז ו -2 מיליליטר EDTA (0.5 מ ') כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מ"מ. עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. הכן חיץ HBS 2x לtransfection: להשלים 500 מיליליטר חיץ HEPES (50 מ"מ) עם 280 מ"מ NaCl (8.1816 גר '), 10 מ"מ KCl (.37275 ז), 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4 (ז .10647), 12 מ"מ גלוקוז (1.08096 גרם ). להוסיף כ -650 μl 10 N NaOH להתאים pH ל7.05-7.12. סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הכן 2.5 פתרון M CaCl 2 לtransfection: הוסף 18.376 גרם CaDDH 2 50 מיליליטר Cl 2 O. סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. הכן ICC חיץ (immunocytochemistry) קיבעון: הוסף 5 מיליליטר paraformaldehyde (PFA, 32%) ל -35 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 4%.
  12. הכן חיץ permeabilization ICC: הוסף 0.1 מיליליטר טריטון 100 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 0.1%.
  13. הכן חיץ חסימת ICC: הוסף 5 אלבומין בסרום שור ז (BSA) 100 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 5%.
  14. הכן חיץ מכתים ICC: הוסף BSA 1 גרם ל -100 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 1%.

2. דור של ילודים פיברובלסטים לב עכבר

  1. צור fibroblasts לב משיטת תרבות explant
    1. עכבר נקי בילוד αMHC-GFP מהונדס (P1 לP2) עם 75% אתנול. חותך את הראש עם מספריים סטרילי. אז לעשות חתך אופקי מתחת לבית השחי אחת לשנייה. השתמש סטרילימלקחיים בוטים וכפופים ללנתח את הלב ולמקם אותו ובאחד של צלחת 24 היטב המכילה מאגר PBS קר כקרח.
      1. לחלופין, לסחוט את הלב לאחר החתך האופקי.
    2. בדוק ביטוי של GFP בלב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מאז הביטוי של GFP הוא מונע על ידי אמרגן αMHC שהוא אמרגן ספציפי לב, הלב מעכבר מהונדס צריך להיות ב -15 ירוקים, בעוד הלב השלילי הוא עמום בכל הקרינה.
    3. קח 3-4 לב חיובי GFP לתוך צלחת תרבות גם מרכז 60 מ"מ ובררת אותם לחתיכות קטנות של פחות מ 1 מ"מ 3 בגודל על ידי מספריים ומלקחיים סטריליות.
    4. מניחים 3-4 לבבות טחונים לתוך צלחת 10 סנטימטר אחד עם 2 מיליליטר תקשורת FB. בואו הרקמות להתיישב למשך 3 שעות.
    5. לאט לאט להוסיף 8 מיליליטר תקשורת FB מחומם מראש למאכלים המכילים רקמות לב. נא לא להפריע הרקמות במשך שלושה ימים.
    6. החלף את התקשורת בכל שלושה ימים.
    7. ביום 7, aspirאכלתי מדיום התרבות ולשטוף תאים עם DPBS. להוסיף 3 מיליליטר טריפסין 0.05% לכל צלחת ולעכל על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    8. הוסף 5 מיליליטר תקשורת FB כדי להרוות את טריפסין. בעדינות לנתק את התאים עם מגרד תא. פיפטה התקשורת מעלה ומטה כדי נוסף מכאני לנתק את הרקמה.
    9. איסוף תאים ולסנן דרך 40 מיקרומטר מסננות תא, כדי למנוע זיהום של שברי רקמת לב, ולאחר מכן גלולה תאים על ידי ספינינג ב XG 200 במשך 5 דקות.
    10. לשטוף את תאי פעם אחת עם MACS חיץ ותאים מוכנים למיון.
  2. צור fibroblasts לב משיטת עיכול אנזים
    1. הקציר GFP לב חיובי כ2.1.1. העבר את כל הלבבות לתוך צלחת 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר DPBS קר כקרח.
    2. לסחוט חדרי הלב עם מלקחיים סטרילית כדי להסיר דם ולשטוף פעם אחת עם DPBS קר כקרח.
    3. חתוך את הלבבות להיות חופשי של רקמות ושומן אחרים.
    4. חותך כל לב לבערך 4 חתיכות שעדיין מחוברות באופן רופף.
    5. אם פחות מ 20 לבבות, להעביר את לבם לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 8 מיליליטר 0.05% טריפסין-EDTA החם, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      1. אם יש 20-30 לבבות, להעביר את לבם לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של 0.05% טריפסין- EDTA חם, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    6. מחק את טריפסין ולהוסיף 5 מיליליטר (פחות מ 20 לבבות) collagenase מהסוג II החם או 10 מיליליטר (20-30 לבבות) (0.5 מ"ג / מיליליטר) בHBSS.
    7. מערבולת הצינור על vortexer דקות 1 ברמת מהירות סביב 4 עד 6 (אם הנוזל לא קם למכסה, אז המהירות היא בסדר).
    8. דגירה הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
    9. מערבולת הצינור 1 דקות.
    10. משקעי דקות 1 על ידי כוח הכבידה עד פיסות הרקמה להתיישב, לאסוף את הנוזל לתוך צינור חדש המכיל 5 מיליליטר בינוני FB הקר.
    11. חזור על שלבים 2.2.6-2.2.10 3-5 פעמים.
    12. מערבבים את כל האוספים ידי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטרכדי להפוך את ההשעיה תא בודדת.
    13. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    14. תאי Resuspend במאגר MACS 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    15. אופציונאלי: אם יש הרבה של תאי דם, תאים גלולים עם 1 מיליליטר חיץ RBC תמוגה (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, ו -0.1 מ"מ EDTA), לשמור על קרח 1 דקות, ואז לדלל עם 10 מיליליטר MACS חיץ צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. לשטוף עוד פעם אחת עם חיץ MACS.
  3. בידוד של Thy1.2 + fibroblasts ידי MACS (מיון תא מופעל מגנטי)
    1. לקבוע מספר תאי קיימא באמצעות הכתמת trypan הכחולה.
      1. קח 10 תאי μl מ- ההשעיה תא 10 מיליליטר בשלב 2.2.14. לערבב אותו עם פתרון trypan כחול 10 μl 0.4%.
      2. מוסיף את התערובת לhemocytometer. לאפשר לו לעמוד במשך 3-5 דקות ולאחר מכן לבדוק מייד תחת מיקרוסקופ. התאים המתים מוכתמים בתאים כחולים ובת-קיימא הם בלא כתם.
      3. 4 (נפח כולל של השעיה תא).
    2. עבור פחות מ 1 x 10 7 תאים, תאים גלולים עם microbeads Thy1.2 10 μl 90 μl מקורר חיץ MACS. הוסף עוד חרוזים יחסי אם יש יותר מ 1 x 10 7 תאים. מערבבים היטב דגירה במקרר (2-8 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
    3. הוסף 10 מיליליטר MACS חיץ ודגימות ספין ב XG 200 במשך 5 דקות; לשטוף פעם עם חיץ MACS 10 מיליליטר ו צנטריפוגות שוב.
    4. תביא נפח 2 מיליליטר במאגר MACS.
    5. הגדרה מפריד MACS במכסת מנוע. הכנס טור LS למפריד. החל 3 מיליליטר MACS חיץ לעמודה לאזן אותו.
    6. להעביר את ההשעיה התא דרך עמודת LS equilibrated.
    7. לשטוף 3 פעמים עם MACS 2 מיליליטר חיץ בכל פעם.
    8. קח את טור LS את tהוא מפריד וelute 3 פעמים עם 2 מיליליטר MACS חיץ לתוך צינור 50 מיליליטר חדש.
    9. ספין ב XG 200 במשך 5 דקות.
    10. תאים גלולים בתקשורת FB 10 מיליליטר, לספור את תאי זרע ולתוך צלחות בצפיפות נכונה. לפיברובלסטים שנוצרו משיטת תרבות explant, צפיפות תאי זריעה יכולה להיות סביב 2-3 x 10 4 תאים / טוב של 24 צלחת גם. לפיברובלסטים שנוצרו משיטת עיכול אנזים, צפיפות התאים יכולות להיות סביב 4-5 x 10 4 תאים / טוב של 24 צלחת גם.

3. דור של רטרו וירוס לתכנות מחדש ICM

הערה: בצע את השלבים הבאים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט בתנאים סטריליים. הסילוק נאות של תאי transfected, טיפים פיפטה וצינורות מומלץ להימנע מסיכון של מפגעים סביבתיים ובריאותיים.

  1. שמור על תאי פלאט-E בתקשורת פלאט-E בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin ו -10 מיקרוגרם b / מיליליטרlasticidin על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  2. ביום 2, להחליף את המדיום על ידי מדיום תרבות פלאט-E חסרת puromycin וblasticidin.
  3. ביום 0, לפצל תאי פלאט-E ל -10 מנות סנטימטר היום לפני transfection בכ 4-5 x 10 6 תאים לכל צלחת. תאים צריכים להיות ~ ומחוברות 80-90% ביום transfection.
  4. ביום 1, תקשורת שינוי התרבות לתקשורת transfection על תאים בתוך שעה 1 לפני transfection. הליך transfection הוא כדלקמן:
    1. Transfection באמצעות ערכות מסחריות
      1. מערבבים 20 מגיב μl transfection (למשל Lipofectamine) ו -500 μl תקשורת סרום המופחת (למשל, Opti-ממ). הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד retroviral 500 μl אחר מופחת תקשורת בסרום. דגירה כל תערובת בטמפרטורת חדר (RT) במשך 5 דקות.
      2. לאט לאט מוסיף את תערובת פלסמיד לתערובת transfection. שלב זה עשוי להימשך 15-30 שניות. דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT (פתרון עשוי להופיע מעונן). הוסף טיפת תערובת חכמה לתאים.
      3. דגירה הלילה בחממה 37 ° C.
    2. Transfection באמצעות סידן זרח.
      1. מערבבים 40 μl 2.5 M CaCl 2 וμL 440 DDH 2 O, ולאחר מכן להוסיף 20 מיקרוגרם של פלסמיד retroviral (להתאים את כמות DDH 2 O, כך שנפח כולל הוא 500 μl).
      2. הוסף 500 μl 2x HBS לצינור חרוטי 15 מיליליטר.
      3. מערבולת HBS ובינתיים להוסיף את תערובת סידן-דנ"א לHBS טיפה חכמה. צעד זה לוקח בערך 30 שניות לכל דגימה. אז מקסימאלי לעשות 3-4 דגימות בו זמנית.
      4. לדגור על RT לדגירת 3 דקות לזמן ארוך יותר מוביל למשקע ופחות תאים גדולים יותר ייקח את המשקע.
      5. מוסיף את תערובת טיפה חכמה לתאים ולהתבונן תחת מיקרוסקופ 20X. משקעים פיין (הרבה קטן הם טובים, אבל כמה גדול שבם הם לא טובים) יש לראות.
      6. דגירה הלילה בשעת 37 ° C חממה.
    3. ביום 2, לשנות תקשורת בתאים עם 8 מיליליטר prewarmed תקשורת והתרבות. דגירה של 24 שעות.
    4. ביום 3 ויום 4, לאסוף supernatant התרבות מהמנות באמצעות מזרק חד פעמי של 10 מיליליטר סטרילי, סינונו דרך מסנן אצטט תאית גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית, והעברה לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת הממטרים רטרו-וירוס לכל supernatant המכיל וירוס 8 מיליליטר. לערבב בעדינותו ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
    5. ביום 5, לסובב את התערובת הנגיפית ב 1500 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. החלקיקים הנגיפיים אמורים להופיע בגלולה לבנה בחלק התחתון של הצינור.
    6. בטל supernatant. ספין למטה פתרון שיורית על ידי צנטריפוגה ב 1500 × גרם במשך 5 דקות. הסר את כל העקבות של נוזל על ידי שאיפה, נזהר מאוד שלא להפריע את חלקיקי retroviral זירז בגלולה.
    7. Resuspend כדורי retroviral עם חיץ DPBS 100 μl לכל 8 מיליליטר supernatant ויראלי. Aliquotהווירוס על קרח. להשתמש מייד או לאחסן ב -80 ° C.

    4. תכנות מחדש של Fibroblasts הלב

    1. הוסף 4 μl של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון polybrene לתוך מדיום ICM 10 מיליליטר, ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. הריכוז הסופי של polybrene הוא 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
    2. להוסיף polybrene המכיל 500 תקשורת ICM μl היטב בכל 24 צלחת גם נזרע עם fibroblasts.
    3. להוסיף רטרו-וירוס 10 μl לכל אחד 2-3 x 10 4 תאים המכילים גם מתרבות explant או 4-5 x 10 4 תאים משיטת עיכול אנזים. כמות הנגיף צריכה להיות מוגברת באופן יחסי עם מספר תאים גדל בתרבות צלחות שונות או מנות. שים את הצלחת בחממה 37 ° C 24-48 שעות כדי לאפשר לזיהום הנגיפי. קו הזמן לתכנות מחדש של הלב מוצג באיור 1.
    4. לאחר התמרה ויראלית, להחליף מדיה המכילה וירוס עם 500 תקשורת ICM μl רגילה.
    5. לשנות תקשורת כל 2-3 ימים. לבחירה חיובית של תאי transduced נגיפיים, להוסיף מדיה ICM בתוספת puromycin ב2 מיקרוגרם / מיליליטר למקד תאים. שמור את זה במשך שלושה ימים. אחרי זה, לשמור על puromycin במדיום ICM בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטר.
    6. שלושה ימים לאחר זיהום ויראלי, לקחת את הצלחת החוצה מהחממה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (20X) להתבונן ביטוי של GFP.
      הערה: עשרה ימים לאחר זיהום ויראלי, תאים יכולים להיות שנקטפו לניתוח FACS וניתוח ICC כדי לקבוע את יעילות תכנות מחדש (בשלב 5 ו -6).
    7. ארבע עשרה ימים לאחר זיהום ויראלי, להחליף תקשורת ICM עם תקשורת B27. שינוי תקשורת בכל שלושה ימים. לוקוסי תא מכות ספונטניים עשויים להופיע משלושה (תאים משיטת עיכול אנזים) או ארבעה (תאים משיטת תרבות explant) שבועות לאחר התמרה ויראלית.

    5. ניתוח Immunocytochemical של יעילות תכנות מחדש

    1. תאי שטיפהעם קרח קר PBS שלוש פעמים; להסיר פתרון עודף.
    2. הוסף חוצץ קיבעון 0.5 מיליליטר ICC היטב בכל 24 צלחות גם. תקן את התאים ב RT במשך 15-20 דקות.
    3. יש לשטוף את תאים עם PBS פעמים שלוש.
    4. הוסף חוצץ permeabilization 0.5 מיליליטר ICC היטב בכל 24 הצלחות גם. Permeabilize התאים ב RT במשך 15 דקות.
    5. יש לשטוף את תאים עם PBS פעמים שלוש.
    6. הוסף 0.5 מיליליטר ICC חסימת חיץ היטב בכל צלחת גם 24, לדגור על RT עבור שעה 1.
    7. נוגדנים עיקריים בדילול מלא עם חיץ מכתים ICC. הוסף 200 μl פתרונות נוגדן לכל היטב דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. גורמי דילול הנוגדן מופיעים בחומרים.
    8. ביום שלמחרת, לשטוף תאים עם PBS פעמים שלוש.
    9. הוסף 200 פתרונות נוגדנים משני μl לתאי דגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך.
    10. לשטוף את התאים עם PBS לשלוש פעמים.
    11. להוסיף 150 μl הרכבה תמיסה המכילה DAPI היטב כל אחד. לאפשר להכתים גרעיני 1 דקות. אזלכסות היטב עם כל להחליק את מכסה זכוכית עגולה ולחץ בעדינות להחליק על המשטח התחתון עם מלקחיים כדי להסיר בועות אוויר.
    12. לשאוב את הפתרון העודף והדגימות מוכנות להדמיה. תמונות הנציג מראים את התאים לתכנות מחדש המבטאים סמן לב cTnT וαActinin בD14 מוצגות באיור 2.

    6. ניתוח FACS של יעילות תכנות מחדש

    1. ביסודיות לשטוף תאים פעם אחת עם DPBS. להוסיף 0.3 מיליליטר טריפסין (0.05%) לכל היטב דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. לטפוח בעדינות את הצלחת כדי להקל על הרמת התאים. בדוק את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ היטב כל אחד, כאשר רוב התאים הם ניתקו. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק נוסף מכאני את התאים.
    3. העבר את התאים בצלחת גם 24 לצלחת גם כן עמוקה 96 גם לטוב. ספין ב XG 200 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את התאים.
    4. לשטוף את תאי פעם אחת עםחיץ FACS.
    5. הוספת 100 פתרונות הקיבעון / permeabilization μl לresuspend תאים במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. שטוף תאי פעמיים עם פתרון לשטוף 1x, גלולה, ולהסיר supernatant.
    7. הכן פתרון נוגדן ראשוני נגד GFP וcTnT בחיץ לשטוף 1x. ביסודיות resuspend כל מדגם עם פתרון נוגדן 50 μl ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    8. לשטוף את תאי פעם אחת בפתרון לשטוף 1x, גלולה, ולהסיר supernatant.
    9. הוסף 50 פתרון נוגדנים משני μl מכיל IgG אלקסה פלואוריד 488 חמור מצומדות נגד הארנב ואלקסה פלואוריד 647 חמור מצומדות אנטי עכבר IgG לכל דגימה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
    10. לשטוף את תאי פעם אחת בפתרון לשטוף 1x, גלולה, ולהסיר supernatant.
    11. תאים גלולים ב400 חיץ קיבעון μl (DPBS עם 1% PFA). תא העברה לצינור FACS עם כובע מסננת תא. דגימות מוכנות לגילוי FACS. ניתוח FACS נציג efficienc תכנות מחדשy באמצעות pMxs-puromycin-MGT לבנות עם או בלי בחירת puromycin מוצג באיור 2 א.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צעדי תכנות מחדש מסוכמים על ידי סכמטי באיור 1. לאחר התמרה MGT, הביטוי של GFP בתכנות מחדש של תאים ניתן היה לזהות כבר ביום 3. בחירת puromycin של תאי transduced מתחילה מיום 3 ונשמרה בשבועות הראשונים אם PMX-פור משמש מבנה -MGT. ביום 10 ליום 14, ביטוי של סמנים לבביים כמו cTnT וαActinin יכול להיות מזוהה על ידי שני ICC (איור 2, שלב 5) וFACS (איור 2 א, שלב 6), מצביע על כך שfibroblasts מתחיל עובר תכנות מחדש לתאי לב גוֹרָל.

איור 1
איור 1:. ייצוג סכמטי של תהליך תכנות מחדש לב הישיר נהלים בכל נקודת זמן מתואר בקופסות שחורות. תקשורת ותרבות לכל שלב מוצגת בתיבות צבעוניות מתחת לזמןקַו.

איור 2
יעילות תכנות מחדש הוערכה על ידי FACS ובית הדין הפלילי הבינלאומי () FACS ניתוח בiCMS שנוצר מfibroblasts מבודד טרי ביום 10 אחרי התמרה MGT: איור 2.. (ב) הכתמה של ICMS בשבועות 2 עם αMHC-GFP, cTnT לב, וαActinin עם DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole). בר סולם: 200 מיקרומטר

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבור דור ICM מוצלח בעת שימוש בפרוטוקול זה, יש כמה גורמים חשובים שיש להם השפעה על היעילות הכוללת. במיוחד בתנאים של fibroblasts מתחיל והאיכות של MGT קידוד רטרו-וירוס יכולים להשפיע על יעילות תכנות מחדש באופן משמעותי.

חשוב ליצור fibroblasts רענן ובריאים ככל האפשר. לשיטת תרבות explant, ניתן להשתמש fibroblasts לפני שבעה ימים לאחר explants היו מצופים על מנות. לשיטת עיכול אנזים, ניתן להשתמש fibroblasts כבר ביום הבא של בידוד. הקפאה או passaging fibroblasts לתכנות מחדש אינו מומלץ. טיפולים אלה נוספים של fibroblasts משמעותי יקטינו את יעילות תכנות מחדש. צפיפות הזריעה היא גורם חשוב נוסף המשפיע על יעילות תכנות מחדש. אם תאי זרע בדלילות, הם נוטים להיות לא בריאים עם מורפולוגיה תא לא סדירה ובגודל גדול. רק לעתים רחוקות במשותףלהיות uld להמיר תאים אלה לiCMS. אם תאים הם זורעים מדי צפופים, משרד הפנים (ריבוי של זיהום) לזיהום נגיפי הוא ירד. צמיחת יתר של fibroblasts נגוע מדללת באופן משמעותי את אירועי תכנות מחדש וכך וכתוצאה מכך אחוז נמוך של ICMS. כמו כן, אנו מבחינים בהופעה של תאים קטנים יותר במורפולוגיה כמו מרוצפת-אם יותר תאי זרע לתכנות מחדש. הם כמעט ולא ניתן לתכנות מחדש וכך לגרום ליעילות תכנות מחדש מופחתת. כאשר שינוי הפרוטוקול לגודל של מנות בתרבית הרקמה שונה, מומלצת שזריעת מספרים סלולריים להיות מותאם באופן יחסי לאזור פני השטח של המנה התרבות.

טוהר של fibroblasts הוא קריטי לתכנות מחדש. טוהר הגבוה של fibroblasts ניתן להשיג גם על ידי FACS מיון 15 או העשרת MACS כפי שתארנו כאן. בהשוואה למיון FACS, מיון MACS הוא קל יותר, עדין יותר, ונוח יותר. תא טוהר לאחר MACS יכול להגיע מעל 90% wתרנגולת הבאה אך ורק לפרוטוקול. טוהר נמוך של fibroblasts עלול להפחית את יעילות תכנות מחדש מאז התאים הנגועים קשים יותר מאשר לתכנות מחדש fibroblasts וכי הם מתרבים הרבה יותר מהר מאשר תאי תכנות מחדש. כמו כן, מומלץ מאוד לזרע התאים תקין לאחר MACS ולבצע זיהום ויראלי הלילה לאחר הזריעה. Fibroblasts מסודרים עלול להפוך מזדקן באופן חלקי לאחר הגידול בצלחת במשך זמן רב, אשר מקטין את ספיגת של רטרו-הווירוס שמדביק רק תאים מתרבים. fibroblasts זנב-קצה (TTFs) ופיברובלסטים עובריים (MEFs) דווחו להמרה לiCMS עם כמה שעתוק אחר גורמי 10,12,19,26. הפרוטוקול שלנו מתמקד כאן רק על fibroblasts לב. היישום של פרוטוקול זה לסוגים אחרים פיברובלסטים עשוי להיות מותאם יותר בשל הווריאציות הטבועות של חתימות פיברובלסטים כגון מצב ההתפשטות, גנטי וציוני דרך אפיגנטיים.

האיכות דואר של רטרו-וירוס לתמרה היא בעל חשיבות עליונה. וירוסי כייל נמוכים להיכשל להמיר fibroblasts לiCMS. בעוד וירוסים בכמות מוגזמת יגרמו רעילים באופן ישיר גורם למוות של תאי פיברובלסטים. זה הכרחי כדי לקבוע את כייל הנגיף ולייעל את המינון הנגיפי לתכנות מחדש על בסיס הגדרת מעבדה ותנאי ניסוי. השיטה לטיטרציה נגיפית תוארה ביסודיות לפני 23. למעשה מצאנו כי מצב הצמיחה של תאי פלאט-E נוגע ישירות לאיכות ויראלי. מומלץ להפשיר תאי פלאט-E במעבר נמוך (<30) בכל פעם. תאים המתקבלים במעבר שלושה הם הטובים ביותר עבור וירוס אריזה בצפיפות סביב 4-5 x 10 6 תאים לכל צלחת תרבות 10 סנטימטרים. בנוסף, הווירוסים טריים שנקטפו להניב יעילות תכנות מחדש גבוהה מוירוסים קפוא. שים לב ששיתוף זיהום של וירוס MGT עם עוד רטרו-וירוס וקטור מבוסס pMxs יקטן possib יעילות תכנות מחדשly בשל התחרות בין שני הווירוסים מאותו הסוג. שתי שיטות transfection שונות הניתנות כאן. שני השיטות לייצר רטרו-וירוס דומה. בעוד Lipofectamine המסחרי הוא יקר אך יציב, transfection עם פוספט סידן הוא זול יותר. הכנת חיץ HBS צריכה לקחת בזהירות רבה, כי את ה- pH של חיץ HBS משפיע על יעילות transfection באופן משמעותי.

ישנן מספר מגבלות של פרוטוקול זה שצריך לטפל. אחת המגבלות טמון בשימוש ברטרו-וירוס, שבהכרח הופך לנושאי בטיחות ביולוגית. ההטרוגניות של פיברובלסטים וחוסר סמן פיברובלסטים לב ספציפי לבידוד גם להשפיע על טוהר של תאים שאפשר לתכנת. וריאציה של יעילות תכנות מחדש אפשר לראות בשל השתנות אצווה טבועות מצב פיברובלסטים וייצור וירוס. בנוסף, למרות שהתאים לתכנות מחדש לבטא חלבוני מבנה sarcomere כגון טרופונין הלבבי TוαActinin, הם עדיין לא cardiomyocytes הבוגר מאופיינים בתכונות פונקציונליות כגון התכווצות והתפשטות חשמלית.

לסיכום, המתודולוגיה שתוארה כאן מאפשרת דור יעיל של ICMS מבוסס על משלוח retroviral של גורמי שעתוק M, G, T במבנה אחד. הפרוטוקול שלנו מספק פלטפורמה לשחזור ובעל ערך למחקר ICM, ויקל על מאמצים מתמשכים על הקרנת תפוקה גבוהה ומחקרים מכניסטית של תכנות מחדש ICM, וסופו של דבר להעביר את שדה תכנות מחדש ICM קרוב יותר ליישומים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics