Деацетилирование Assays распутать Interplay между Sirtuins (SIRT2) и специфического белка-субстратов

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. In Vitro дезацетилирования Пробирной

  1. Очистка SIRT2
    1. Приготовьте 10 см культуры блюдо из НЕК 293Т клеток , культивированных в 8 мл DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотиков и выращивали в 37 ° C, 5% СО 2 культуральную инкубаторе тканевых составляет около 70% сплошности на следующий день.
    2. На следующий день, со-трансфекции 4 мкг PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector сделано в нашей лаборатории), 4 мкг pCMV- dR8.2 dvpr (упаковка вектор) и 0,5 мкг PCMV-VSV-G (конверт вектор) 18 с использованием полиэтиленимина (ПЭИ) в соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
    3. Изменение средств массовой информации после 12 часов.
    4. Соберите супернатант после 36-48 ч.
    5. Удалите мусор центрифугированием при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    6. После фильтрации через 0,22 мкм фильтры, составляют 1 мл аликвоты SIRT2 лентивирусов и держать при температуре -80 ° С.
    7. Оттепели SIRT2 лентивирусов на льду (важно хранить вирус при -80 ° С, когда вирус не используется).
    8. Инфицировать 6-луночный планшет 80-90% сплошности НЕК 293Т с 1 мл лентивирусов в присутствии 8 мкг / мл полибрена.
    9. Поместите инфицированные вирусом клетки в 37 ° C инкубаторе до следующего дня (24 ч).
    10. Заменить среду после 24 часов.
    11. 48 ч после заражения, проверьте эффективность инфекции путем обнаружения GFP-положительных клеток под флуоресцентным микроскопом.
    12. Если эффективность инфекции хорошо ( по крайней мере , на 40-50% инфицированных клеток), заменить среду с культуральной средой , содержащей 2 мкг / мл пуромицин , чтобы выбрать для стабильного SIRT2 над экспрессирующих клеток.
      Примечание: Это занимает около 2-х недель, а среда меняется каждые 3-4 дня. Неинфицированных клетки умирают за этот период селекции и только инфицированных клеток с SIRT2 лентивирусов растут.
    13. Анализ экспрессии Flag-меченый SIRT2 с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Flag (1: 1000 разведение) после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE перед запуском Purification процесс (рекомендуется) 19,20.
    14. Для очистки активного SIRT2, расщепленных клеток в соотношении 1: 3 по трипсином, чтобы иметь достаточное количество блюд клеток НЕК 293Т стабильно с гиперэкспрессией Flag-SIRT2 (Десять 10 см блюд позволит очистку достаточное количество белка для последующих экспериментов).
      1. Для Trypsinize клеток, удаления культуральной среды и ликвидации остатков сыворотки путем промывки клеток стерильной ДЗФР. Медленно добавляют 2,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клеточный монослой, инкубировать при комнатной температуре в течение 30-45 сек. После удаления раствора трипсина-ЭДТА, инкубировали при 37 ° С до тех пор, пока клетки не начнут отделяться. Затем добавляют питательную среду и переносят клетки на новые блюда.
    15. Удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки обработкой трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
    16. Осадок Lyse клеток в 500 мкл лизис буфера А (20 мМ HEPES рН 7,9, 18 мМ KCl, 0,2 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl 2, 20% глицерине, 0,1% NP-40), в том числе коктейль ингибиторов протеазы и 1 мкМ TSA в течение 30 мин при 4 ° С при постоянном вращении.
    17. Центрифуга при 14000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
    18. Выполните иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag, конъюгированного с агарозном бисером, как описано ниже.
      1. Добавить 200-300 мкл анти-Flag антитела, конъюгированного с агарозными гранулами с белком лизатов (10-20 мг белка).
      2. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
      3. Собрать иммуноосажденными центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
      4. Вымойте гранул 5 раз с помощью 10 мл лизирующего буфера А при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. После каждой промывки, гранулы бусинки и заменить супернатант буфером А.
    19. Приготовьте 1х раствор пептида Flag (в том числе коктейль ингибиторов протеазы и 1 мкМ TSA в PBS).
    20. Добавить 500 мкл 1x флага пептиде решение агарозном бусин и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
    21. Собирают супернатант центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    22. Повторите предыдущие два шага.
    23. Удалить бусы из надосадочной жидкости при помощи фильтровальной трубки и центрифугирования при 15000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
    24. Концентрат элюированный образец до конечной концентрации белка равно 1 мкг / мкл с использованием ультрафильтрационной мембраны.
    25. Проверка процесса очистки с помощью электрофореза с использованием 1 мкг элюированного образца.
    26. Пятно гель с коммерчески доступным красящим раствором, чтобы подтвердить очистку SIRT2.
    27. Хранить очищенный SIRT2 при -80 ° С.
  2. Очистка ацетилированный белок-субстрат
    1. Подготовьте 10 см х блюд культуры 10 см с НЕК 293Т составляет около 70% вырожденная на следующий день.
    2. На следующий день, со-трансфекции клеток с 5 мкг флага помечено плазмиды вектор expressinг белок-субстрат, а также 5 мкг специфического ацетил-трансферазы, который может ацетилировать белка с использованием PEI при соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
      Примечание: Если конкретный ацетил-трансферазы не известно, со-трансфекции смеси известным гистонов ацетил-трансферазы (HATS), таких как р300, ОШП GCN5, Tip60 и PCAF.
    3. Изменение среды после 12 часов.
    4. За день до лизиса клеток, лечить клетки с 1 мкМ TSA и 2 мМ никотинамида (NAM) в течение ночи путем замены культуральной среды на среду, содержащую TSA / NAM, чтобы максимизировать уровни ацетилирование белка-субстрата путем ингибирования дезацетилазами.
    5. 48 ч после трансфекции, удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки путем обработки трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
    6. Лизируйте осадок клеток в 500 мкл буфера для лизиса А на чашку (20 мМ HEPES, рН 7,9, 18 мМ КСl, 0,2 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl2, 20% глицерина, 0,1% NP-40), в том числе протеаза Inhibitors коктейль, 1 мкМ АСП и 2 мМ NAM в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
    7. Центрифуга при 14000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
    8. Выполните иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag, конъюгированного с агарозном бисером, как описано ниже.
      1. Добавить 200-300 мкл анти-Flag антитела, конъюгированного с агарозными гранулами с белком лизатов (10-20 мг белка).
      2. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
      3. Собрать иммуноосажденными центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
      4. Вымойте гранул 2 раза с помощью 10 мл лизирующего буфера А при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. После каждой промывки, гранулы бусинки и заменить супернатант с лизис буфером А.
      5. Вымойте гранул 3 раза с помощью 10 мл лизирующего буфера А без NAM при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. После каждого мытья, гранулы шарики и заменить супернатант с лизис буфера А. Это IMPORTAнт не переносить любой NAM к реакции деацетилирования.
    9. Приготовьте 1х раствора пептида Flag (в том числе ингибиторы протеазы и 1 мкМ TSA в PBS).
    10. Добавьте 500 мкл раствора пептида 1 x флага на агарозном бусин и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении.
    11. Собирают супернатант центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    12. Повторите предыдущие два шага.
    13. Удалить бусы из надосадочной жидкости при помощи фильтровальной трубки и центрифугирования при 15000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
    14. С использованием ультрафильтрационной мембраны, концентрат, элюированный образец до тех пор, концентрация белка не является 1 мкг / мкл.
    15. Выполните электрофорез, выполнив 1 мкл элюированной пробы на 4-12% геле SDS-PAGE.
    16. Подтверждение ацетилирование белка-субстрата с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител против Ac-K (1: 1000 разведение) и белка-субстрата (разбавление зависит от конкретного используемого антитела).
    17. Держите пуриFied ацетилированный белок-субстрат при температуре -80 ° С.
  3. In Vitro дезацетилирования реакции
    1. Подготовьте деацетилирования буфера В (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 , 0,5 мкМ АСП)
    2. Подготовьте 3 различные реакции в различных пробирках в 20 мкл конечного объема (таблица 1).
    3. Включите дополнительные реакции для подтверждения деацетилирование белка-субстрата с помощью SIRT2 ( по желанию). Добавить 2 мкг очищенного дезацетилирования нулевого мутантного SIRT2 (это может быть сделано с использованием протокола , описанного в пункте 1.1 после использования lentivector PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) по отношению к реакции вместо деацетилаз активного SIRT2 или добавить 10 мМ никотинамида (NAM ) по отношению к реакции , чтобы ингибировать дезацетилирование активность SIRT2 (Таблица 1).
    4. Инкубируйте реакции в течение 3 ч при 30 ° С при постоянном перемешивании.
    5. Остановить реакцию добавлением 20 мкл 2х буфера для образцов и кипятите образцов Fили 10 мин при 95 ° С.
    6. Выполните электрофорез путем запуска реакционной смеси на 4-12% геле SDS-PAGE и определить статус ацетилирования белка-субстрата с помощью Вестерн - блоттинга с использованием анти Ac-K - антитела (1: 1000 разведение) 19,20.

2. В Vivo дезацетилирования анализе

  1. SIRT2 Гиперэкспрессия в культивируемых клетках
    1. Приготовьте 10 см культуры блюд с НЕК 293Т клеток , стабильно с гиперэкспрессией PCDH-Puro-GFP-пустой вектор, PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag и PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (как описано в пункте 1.1) составляет около 70 % сплошности.
    2. В качестве альтернативы, подготовить 10 см чашки для культивирования с клетками около 70% сплошности и выполняют переходную избыточную экспрессию с использованием 5 мкг векторов, упомянутых выше, с использованием PEI при соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
    3. Выполнение вестерн-блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием антитела анти-Flag (1: 1000 разведение), чтобы продемонстрировать избыточную экспрессию Flag-тagged SIRT2 19.
  2. Интерференция РНК в нокдаун SIRT2 в культивируемых клетках
    1. Приготовьте 10 см культуры блюдо из клеток 293Т НЕК составляет около 70% вырожденная на следующий день.
    2. На следующий день, со-трансфекции 4 мкг pLKO1-Puro-ш SIRT2 (lentivector) 19, 4 мкг pCMV- dR8.2 dvpr (упаковка вектор) и 0,5 мкг PCMV-VSV-G (конверт вектор) 18 с использованием полиэтиленимина (PEI) в соотношении 3 мкл PEI / мкг ДНК.
      Примечание: Для сбивания SIRT2, мы используем простые шпилька shRNAs в векторе pLKO.1 лентивирусов, построенный по проекту RNAi Consortium (TRC).
    3. Следуйте процедуре, описанной в пункте 1.1 для получения shSIRT2 лентивирус и инфицировать клетки - мишени в нокдаун SIRT2.
    4. Выполнение вестерн - блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием анти-SIRT2 антитела (1: 1000 разведение) , чтобы продемонстрировать эффективное SIRT2 нокдаун после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE.
    5. В качестве альтернативы,подготовить 10 см чашки для культивирования клеток с около 70% сплошности и выполнять переходные нокдаун SIRT2 использованием миРНК следующие инструкции производителя.
    6. Выполнение вестерн - блоттинга от общего количества клеточных экстрактов с использованием анти-SIRT2 антитела (1: 1000 разведение) , чтобы продемонстрировать эффективное SIRT2 нокдаун после запуска 40 мкг общего белка на 10% геле SDS-PAGE.
  3. Иммунопреципитации и иммуноблоттинга для обнаружения ацетилированный уровней в культивируемых клетках
    1. 12 ч до сбора клеток гранул либо из клеток с гиперэкспрессией SIRT2 (см 2.1 выше) или SIRT2 нокдауне клетки (см 2.2 выше), добавьте 1 мкм АСП к культуральной среде для ингибирования не являющиеся III класса гистондезацетилазы.
    2. Удалить культуральной среды, промыть клетки дважды в PBS и собирают клетки обработкой трипсином с последующим центрифугированием при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
    3. Добавляют 10 мл лизирующего буфера А (20 мМ HEPES, рН 7,9, 18 мМ КСl, 0,2 мМ EGTA, 1,5мМ MgCl 2, 20% глицерине, 0,1% NP-40) , в том числе коктейль ингибиторов протеазы, 1 мкМ TSA и 2 мМ NAM.
    4. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин при постоянном вращении.
    5. Собирают супернатанты центрифугированием при 20000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
    6. Рассчитать концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    7. Передача 1 мг общего белка в новые пробирки в конечном объеме 1 мл с использованием буфера для лизиса A. Использование таблицу 2 в качестве эталона для подготовки образцов белка из клеток , либо с гиперэкспрессией SIRT2 или после SIRT2 нокдаун.
    8. Выполнить иммунопреципитации с использованием антитела против специфического белка-субстрата вместе с белком A / G (40 мкл шарик суспензии рекомендуется). В качестве альтернативы, используйте анти Ac-K антитела, конъюгированного в агарозном бусин (20 мкл суспензии шарик как правило, достаточно), чтобы иммунопреципитации все ацетилированные белки.
    9. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С при Констант вращение в течение ночи.
    10. Сбор иммуноосажденными центрифугированием при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    11. Промыть бусин 5 раз с 1 мл буфера А при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
    12. Ресуспендируют бусины в 40 мкл буфера 2х образца.
    13. Образцы кипятить в течение 10 мин при 95 ° С.
    14. Выполните электрофорез, запустив элюированный образцы (40 мкл из стадии 2.3.12) на 4-12% геле SDS-PAGE, не нарушая бусинки при передаче элюированной пробы.
    15. Обнаружение ацетилированные уровни белка-субстрата с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-Ac-K-антитела (1: 1000 разведение), если белок-субстрат специфическое антитело использовали для иммунопреципитации, или специфическое антитело против белка-субстрата (следуют рекомендации специфическое антитело в отношении разбавления), если анти-Ac-K гранулы использовали для иммунопреципитации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того , чтобы белок , следует рассматривать в качестве законной цели дезацетилирования для любого фермента с дезацетилирования активностью, как в пробирке и в естественных деацетилировании анализов должны быть выполнены , чтобы установить взаимосвязь между деацетилаз и его субстратом. Для экстракорпоральное деацетилаз анализа, очищение как деацетилаз и ацетилированного белкового субстрата требуется до того , как анализ может быть сделано. При этом мы используем цитоплазматический Sirtuin SIRT2 как специфическая деацетилаза для изучения. SIRT2 является деацетилаза ферментом и использование мутанта, который испытывает недостаток в дезацетилазы активность настоятельно рекомендуется в качестве отрицательного контроля для анализа дезацетилирования. С помощью процедуры очистки , описанной в 1.1, как SIRT2 и SIRT2 H187Y могут быть успешно очищены при конечной концентрации 1 мкг / мкл. Это может быть подтверждено после запуска очищенных белков на геле с последующим окрашиванием(Фигура 1А, верхняя), а также после того, как вестерн - блоттинга с использованием антитела анти-Flag , так как SIRT2 и SIRT2 H187Y помечены флажком пептида (Фигура 2А, ниже). Та же процедура очистки может следовать для очистки белкового субстрата с некоторыми изменениями. Белок должен быть ацетилированный, прежде чем он может быть использован для анализа деацетилирования, что означает, что он должен быть очищен в клетках с гиперэкспрессией специфическую ацетилтрансферазы или смесь шляп, способных ацетилировани белок. С помощью процедуры очистки , описанной в разделе 1.2, ацетилированный белок может быть очищен (Фиг.1В, верхний). Для того, чтобы подтвердить , что белок действительно ацетилированный и могут быть использованы для анализа дезацетилирования в пробирке, Вестерн - блоттинга с использованием анти антитела Ас-K необходимо показать увеличенные ацетилированные уровни очищенного белка в клетках с гиперэкспрессией ацетил-трансферазы (Фигура 1В, лоур).

После очистки успешного белка, анализ деацетилирования в пробирке может быть выполнена. Сиртуины, в том числе SIRT2, относятся к классу III деацетилазы гистонов лизина , которые отличаются от других деацетилазами , поскольку они требуют NAD + для их ферментативной функции. В соответствии с этим, ни одна деацетилирования не может быть обнаружено с помощью Вестерн - блоттинга с использованием антитела анти Ас-K в отсутствие НАД +, независимо от присутствия каталитически активного SIRT2 (рисунок 2, полоса 2 против 1). Напротив, снижение ацетилированные уровни ацетилированного белка , когда оба SIRT2 и NAD + , присутствующие в реакции позволяют предположить , что белок может рассматриваться в качестве мишени для деацетилирования SIRT2. Для проверки этих результатов, могут быть использованы различные негативные контроли. Например никакой разницы в уровнях дезацетилирования белка не может быть обнаружен , когда деацетилирования дефицитных SIRT2 (SIRT2 H187Y) используется вместо каталитически активного дикого типа SIRT2 (рисунок 2, дорожка 5 против 4). Подобный эффект можно наблюдать, когда хорошо установленный ингибитор Sirtuin, NAM, добавляют к реакционной смеси, что предполагает, что снижение ацетилированный уровни белка опосредована деацетилаз активностью SIRT2.

Ненормальная деацетилирования участвует в ряде клеточных процессов и заболеваний, связанных с возрастом. Таким образом, важным шагом в углублении наших знаний о взаимосвязи между деацетилаз и его субстратом является установление эту взаимосвязь в клетках, где это явление может иметь физиологическое воздействие. Кроме того, проверка дезацетилирование в системах клеточных культур в естественных условиях позволяет исследовать события дезацетилирования в конкретной ячейке или тканевой контекст , который может быть более легко подключены к определенному фенотипу или результата. Это исключает возможность того, что обнаруженный в пробирке DEACetylation активность искусственно из-за присутствия обоих деацетилаз и его субстрата в трубе в то же самое время, которое может никогда не произойти в нормальных физиологических условиях в клетках. Для анализа дезацетилирования в естественных условиях, клетки , избыточно экспрессирующие как SIRT2 и SIRT2 H187Y, а также белковый субстрат может быть использован в соответствии с процедурами , описанными в разделе 2.1 и 2.2. Клеточные экстракты , полученные из этих клеток , может быть подтверждено , чтобы выразить SIRT2, SIRT2 H187Y, и белковый субстрат с помощью Вестерн - блоттинга с использованием специфических антител. В исследовании , описанном здесь, все экзогенно выраженные белки помечены для простоты проведенных экспериментов (рис 3, нижняя панель для обнаружения HA-меченый SIRT2 / SIRT2 H187Y и средняя панель для обнаружения Flag-меченый субстрат белка). Для того, чтобы определить, белок-мишень, является ли деацетилирования субстрат SIRT2, иммунопреципитация проводится с использованием антитела анти-Flag рушить целевого белка Followed с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти Ас-K. Снижение ацетилированный уровней белка в клетках , экспрессирующих SIRT2 (рис 3 верхняя панель, полоса 3 против 2) и неспособность влиять на ацетилированные уровни в клетки , экспрессирующие дезацетилазы дефицитный SIRT2 мутант (рис 3 верхняя панель, полоса 4 против 3) свидетельствуют о том , что ацетилированный белок может быть мишенью деацетилирования специфического деацетилаз в естественных условиях. Это может быть подтверждено дополнительно , когда SIRT2 опосредованной деацетилирования тормозится после обработки клеток с NAM (рисунок 3 верхней панели, дорожка 5 против 3) , устанавливающего конкретные оси деацетилаза-подложки в исследованных клетках.

Рисунок 1
Рисунок 1: Очистка как деацетилаз и ацетилированного белка-субстрата , которые будут использоваться для экстракорпорального дезацетилирования пробирного. (A) 1 мкг как SIRT2 и SIRT2 H187Y (деацетилирования дефектным мутантным) проводили на геле следующий протокол очистки , как описано в пункте 1.1. Гель окрашивали с помощью коммерчески доступного красящим раствором и после того, как Обесцвечивание, как очищенные белки могут быть обнаружены (верхний). Белки могут быть обнаружены после переноса в PVDF мембрану и вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Flag (ниже). (В) 1 мкг белкового субстрата и гипер ацетилированный белкового субстрата (альфа-энолаза использовали в качестве субстрата SIRT2 на основе масс - спектрометрии неопубликованные данные , полученные в нашей лаборатории) были выполнены на геле следующий протокол очистки , как описано в разделе 1.2. Гель окрашивали с помощью коммерчески доступного красящим раствором и после того, как Обесцвечивание, очищенный белковый субстрат может быть обнаружен (верхний). Ацетилирование может быть обнаружен после переноса в PVDF мембрану и вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Ac-K (средний). Общая р roteins могут быть обнаружены с помощью анти-Flag антитела (ниже). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. В пробирке пробирного дезацетилирования Очищенная ацетилированный белок субстрат (альфа-энолаза) инкубируют с SIRT2 или SIRT2 H187Y (деацетилирования дефектным мутантным) в присутствии NAD + (дорожки 4 и 5). Уменьшенные ацетилированные уровни обнаруживаются с помощью Вестерн - блоттинга с использованием антитела анти Ас-K в присутствии SIRT2 но не в присутствии SIRT2 H187Y (дорожка 4 против 5). Не наблюдали деацетилирования активность при NAD + , не входит в реакционной смеси (дорожка 2 против 4) , или когда NAM добавляют к реакционной смеси (дорожка 6 против 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. In vivo на клетках HEK293T деацетилирования анализ стабильно избыточно экспрессирующих либо SIRT2 или SIRT2 H187Y котрансфицируют с белковым субстратом (альфа-энолазы) и шапочек увеличить ацетилированный уровни белка (дорожка 2 против 1). Деацетилирование была проверена в естественных условиях после иммунопреципитации с использованием антитела анти-Flag , чтобы спустить субстрат белка и Вестерн - блоттинга с использованием анти антитела Ac-K. Ацетилирование значительно уменьшилась в клетках с гиперэкспрессией SIRT2 по сравнению с SIRT2 H187Y гиперэкспрессией клеток (дорожка 3 VS 4). SIRT2-опосредованной деацетилированиясубстрата белка тормозится , когда клетки обрабатывают NAM (дорожка 5 против 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Реакции 1 2 3 4 ( по желанию) 5 ( по желанию)
очищенный ацетилированный белок-субстрат (10 мкг) + + + + +
буфер В + + + + +
Очищенный SIRT2 (2 мкг) - + + - +
NAD + (1 mΜ) - - + + +
Очищенный SIRT2 H187Y (2 мкг) - - - + -
NAM (10 мМ) - - - - +

Таблица 1: Реакционные ингредиенты.

образцы избыточная экспрессия сбить
1 PCDH-Puro-GFP-пустой вектор pLKO1 пустой вектор или си СУУ
2 PCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag pLKO1 Ш. SIRT2 1 или си SIRT2 1
3 PCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag pLKO1 Ш. SIRT2 2 или си SIRT2 2

Таблица 2: Белковые образцы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Описанный здесь проект был поддержан грантом NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), а также Роберт Х. Лурье Comprehensive Cancer Center - Lefkofsky Family Foundation / Лиз и премии Эрик Lefkofsky инновационных исследований А. В. Мы хотели поблагодарить сотрудников лаборатории (Кэрол o'Callaghan и Элизабет Энн Wayne) для критического чтения и редактирования рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. e51682 (2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics