Test très sensible pour la mesure de l'attachement arénavirus-cell

Immunology and Infection

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Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

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Abstract

Introduction

Arénavirus sont une famille de virus enveloppés, d'ARN simple brin qui sont maintenus principalement chez les rongeurs dans la nature 1-3. Bien que ces virus établissent généralement, une infection persistante asymptomatique dans les réservoirs de rongeurs 1,2, ils peuvent causer des maladies graves chez l' homme 3. Espèces pathogènes importants comprennent le virus du Nouveau Monde Junin (JUNV) 4 et le virus Lassa Vieux Monde 5, qui sont les agents étiologiques de la fièvre hémorragique argentine en Amérique du Sud et de la fièvre de Lassa en Afrique, respectivement. Virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), le virus prototypique de la famille 6, a une distribution mondiale et est responsable d'une variété d'états pathologiques , y compris la méningite aseptique chez les personnes immunocompétentes 6, des malformations congénitales graves chez le fœtus en développement 7, ou létalité élevée en immunodéprimés personnes suivantes solide transplantation d' organes 8,9. Le manque de États-UnisFood and Drug Administration (FDA) CSEh vaccins ou des antiviraux efficaces pour lutter contre ces virus met en évidence le besoin critique de développer de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement ces agents pathogènes émergents / ré-émergentes.

Le génome de arénavirus se compose de deux segments simple brin d' ARN, la grande (L) (~ 7,2 kb) et petite (S) (~ 3,6 kb) 10 segments. Le segment S code pour la nucléoprotéine virale (NP) et de glycoprotéine d'enveloppe (GP), tandis que le segment L code pour la polymerase virale (L) et de la protéine de matrice (Z). Le L et S segments d'ARN génomique (ARNv) sont emballés dans des virions 10-12. L'étape initiale de l' infection est arénavirus fixation des particules virales aux cellules hôtes par le biais d' une interaction entre le GP virale et ses récepteurs de cellules hôtes correspondantes qui, pour JUNV, comprend le récepteur de la transferrine humaine 1 (hTfR1) 13,14. Après la fixation, les particules JUNV sont prises dans la cellule par l' intermédiaire de la clathrine endocytose 15.Les particules puis la circulation à la fin du endosome où le faible pH de ce compartiment déclenche l'activation du GP 16,17. Une fois activés, les inserts peptide de fusion GP-codées dans la membrane endosomale, initiant la fusion entre les membranes virale et endosomique. Résultats de la fusion réussie dans la libération des ARNv de virions-emballés dans le cytoplasme, où ils servent de modèles pour la réplication génomique et de la transcription. Lorsque des quantités suffisantes de protéines et ARNv structurales virales sont générées, de nouvelles particules se rassemblent et le bourgeon de la cellule infectée pour terminer le cycle de vie de 18 ans.

Pour faciliter la découverte de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement les arénavirus pathogènes, notre groupe a mis l'accent sur l'identification des facteurs de l'hôte qui sont essentiels pour la propagation du virus, mais dispensable pour l'hôte. Dans ce contexte, définissant le moment précis (s) du cycle de vie viral contrôlé par ces facteurs de l'hôte est nécessaire pour guider ledéveloppement de stratégies antivirales. Nous décrivons ici une analyse quantitative (q) de test à base de RT-PCR qui peut être utilisée pour mesurer la fixation arénavirus des cellules dans le but d'identifier si les protéines hôtes choisies et / ou des molécules antivirales influencent cette phase initiale de la pénétration du virus 19. D' autres approches pour mesurer l' attachement arénavirus cellules ont présenté des virions marqués avec de la biotine 20, des colorants fluorescents 21, ou des isotopes radioactifs 22. Les inconvénients de ces méthodes peuvent inclure l'exigence de grandes quantités de virus d'entrée (par exemple , des multiplicités élevés d'infection (MOI)), l'utilisation de la radioactivité et / ou d' étapes de manipulation supplémentaires pour préparer le virus de l' entrée (par exemple , la concentration et / ou l' étiquetage des virus) . En particulier, l'utilisation de MOI élevé, il est difficile de faire la distinction productive par rapport à des événements de fixation improductives 15,23. Le test à base de qRT-PCR décrit ici peut détecter des événements de fixation en utilisant aussi peu que 20 pour la plaqueunités ming (UFP) du virus, ce qui se traduit par une MOI de 0,0004 pour une plaque de 48 puits. Par conséquent, la forte sensibilité de l'essai surmonte l'exigence de MOI élevé, ainsi que des mesures d'étiquetage de virus ou de concentration. En outre, le dosage peut être i) adapté pour mesurer virion endocytose ainsi que la libération du génome du virus dans le cytoplasme suivant la fusion et ii) adapté pour une utilisation avec d'autres virus à travers le développement de réactifs qRT-PCR spécifiques du virus (pour des exemples, voir 24-27).

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Protocol

Remarque: Il est essentiel que le protocole décrit être effectuée en utilisant la technique de pré-PCR stricte (voir 28 pour une excellente vue d' ensemble sur la façon de mettre en place un laboratoire pré-PCR et la façon de mener des expériences en utilisant une technique bonne pré-PCR). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d'ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Un aperçu du protocole est représentée sur la figure 1.

1. Préparer les médias et les cellules de semences dans 48 puits Plaques

  1. Préparer 500 ml d'complet du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de HEPES (N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane acide sulfonique), solution tampon par addition de 50 ml de inactivé sérum de veau fœtal à la chaleur et 5 ml chacune d'une solution tampon pénicilline- streptomycine et 100x 100x HEPES à une bouteille de 500 ml de DMEM. Ce réactif peut être conservé à 476; C pendant des mois.
  2. Seed 2,5 x 10 4 cellules Vero E6 par puits dans un tissu de 48 puits plaque de culture dans un volume final de 500 pi de DMEM complet. Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2 pendant 10 à 18 heures.
    1. Graine de la plaque à la fin de la journée de travail. Testez chaque échantillon de virus soit en double ou en triple puits.
      Remarque: Même si une plate-forme de 48 bien pour ce dosage est décrit, il devrait être possible à l'échelle du dosage vers le bas pour une utilisation dans 96- ou plaques 384 puits.

2. Carry Out Attachment Virus-cell

Remarque: Le virus utilisé dans ce protocole, la souche JUNV Candid # 1 (C # 1), a été utilisé avec succès comme un vaccin vivant atténué pour la prévention de la maladie JUNV 29. JUNV C # 1 a été dérivée de la souche virulente de JUNV XJ par un passage en série à la fois in vivo et in vitro et diffère de la souche parentale XJ par 12 acides aminés 30. because JUNV C # 1 est un niveau de biosécurité (BSL) -2-pathogène classé, les travaux décrits pour cette section doit être effectuée à l' aide BSL-2 pratiques appropriées 31. Cela inclut l'utilisation d'équipements de protection individuelle (par exemple , une protection oculaire, blouse de laboratoire, des gants doubles), une biosécurité armoire de classe II, et veiller à ce que tout le personnel a reçu la formation institutionnelle et les approbations nécessaires pour gérer en toute sécurité cet organisme.

  1. Diluer le JUNV C # 1 échantillon (s) à tester à la PFU souhaitée ou se concentrer unités formant dans la glace froide DMEM complet et stocker sur la glace jusqu'à ce que prêt à ajouter à chaque puits.
    Remarque: Comme une alternative à la réalisation des études de liaison avec le virus dilué dans DMEM complet, utiliser un milieu minimal contenant du PBS avec une concentration réduite de sérum (2%) et un tampon approprié pour déterminer si le sérum peut provoquer des interférences avec l'attachement du virus. protocoles de fixation similaires pour les virus alternatifs ont rapporté l'utilisation de RPMI 1640 sans bicarbonate contenant 0,2% d' albumine de sérum bovin, 10 mM de (2- (morpholino) éthanesulfonique) et 10 mM d' HEPES, pH 6,8 32. Ce média de liaison peuvent être supérieurs pour empêcher des changements de pH qui pourraient survenir lorsque les médias est retiré du CO 2 -Environnement de l'incubateur.
    1. Inoculer des puits avec PFU allant de 200 à 2000 afin de limiter les événements de fixation non productifs. Comme on le voit sur ​​la figure 2, cet essai est capable de détecter la fixation en utilisant aussi peu que 20 PFU (ou autant que 2 x 10 6 UFP).
    2. Créer un mélange maître du virus pour l'inoculation sur des cellules. Chaque échantillon de virus est inoculé dans des puits en double dans un volume de 50 ul par puits. Par conséquent, si l'addition de 2.000 PFU de virus par puits est souhaitée, diluer 4.800 PFU dans un volume total de 120 pi de glace froid DMEM complet.
      1. Pour contrôler la spécificité du test, utiliser une paire assortie de lignées de cellules ovariennes de hamster chinois qui soit n'expriment pas TfR1 (TRVB) ou express hTfR1 (TRVB-1) JUNV attachement à ces cellules devrait être soit réduite ou non, respectivement 13,33. Alternativement, traiter les cellules avec une protease telle que la protéinase K pour empêcher l' attachement arénavirus 34 ou l' entrée 35. Soluble hTfR1 ou ch128.1 d'anticorps monocolonal, qui est spécifique pour hTfR1, pourraient également être considérés comme ils sont connus pour bloquer l' entrée de JUNV dans les cellules 13,36. En outre, le prétraitement des cellules avec mannose libre 14 ou l' incubation des particules avec des anticorps neutralisants 37 spécifiques JUNV peut inhiber l' entrée du virus.
      2. S'il vous plaît noter, cependant, que ces derniers réactifs et approches, en dépit de blocage JUNV entrée, n'a pas été confirmée pour bloquer la fixation, bien que ce soit une explication probable. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour déterminer formellement si ces différentes approches incidence virion attachement.
  2. Retirer les plaques de la 37 ° C incubateur etplacer soit dans un réfrigérateur C à 4 ° C ou sur de la glace pendant 15 minutes pour inhiber la capacité des cellules étalées à effectuer endocytose.
  3. Ensuite, aspirez le DMEM complet de chaque puits et laver rapidement chaque puits deux fois en utilisant 100 pi de glace froide PBS (tampon phosphate salin) pH 7,4. Ensuite, ajouter 50 ul des échantillons de virus pré-dilué (préparé à l'étape 2.1) dans les puits appropriés.
  4. Enveloppez la plaque dans une pellicule plastique et placez immédiatement soit de retour sur la glace ou dans un réfrigérateur C 4 ° C pendant 1 à 1,5 h pour permettre la fixation du virus à se produire. Gardez la plaque, le tampon de lavage, et des échantillons de virus à froid à 4 ° C tout au long de cette étape.
  5. Après l'achèvement de l'incubation à 4 ° C, aspirer le inoculum de virus dans chaque puits et laver 3 fois avec 200 pi de PBS glacé.

3. Viral RNA Extraction

  1. Purifier l' ARN viral à partir de JUNV C # 1 particules attachées aux monocouches en utilisant le kit commercial (par exemple, RNeasy Mini kit) according le protocole du fabricant. Plus précisément, suivre la "purification de l' ARN total à partir de cellules animales utilisant le protocole de la technologie de spin» sur les pages 23-28 dans le Mini Handbook RNeasy (4 e édition, avril 2006) avec les modifications ci - dessous.
    1. Lyser les cellules comme indiqué dans l'étape 1b, par l'addition de 350 ul de tampon RLT de lyse directement à chaque puits. Mélanger le tampon à plusieurs reprises pour assurer la lyse des cellules. A noter que les cellules lysent facilement dans ce tampon et une lyse complète peut être vérifié en observant les puits sous un microscope inversé.
    2. Transférer le lysat cellulaire résultant à la colonne de kit (étape 3a) et suivre le reste du protocole tel que décrit. À ce stade, le virus a été neutralisé par le tampon de lyse de sorte que les étapes restantes du protocole peut être fait en dehors de la prévention des risques biotechnologiques armoire de classe II à condition que les tubes du kit ne sont pas contaminés par des virus infectieux.
    3. Inclure l'étape facultative 9 du protocole du fabricant, qui est un suppional centrifugation de la colonne de centrifugation pour éliminer toute report possible du tampon RPE.
    4. Dans la dernière étape du protocole du fabricant (étape 10), éluer l'ARN purifié à partir de la colonne de centrifugation en utilisant 30 pi de ddH 2 O. sans nuclease ARN de magasin à -80 ° C à ce point ou utiliser directement dans le dosage qRT-PCR. Pour éviter la dégradation des échantillons purifiés d'ARN viral par des nucléases, utiliser des réactifs et du matériel sans nucléase et conserver des échantillons d'ARN décongelés sur de la glace.
      Note: Tampons RLT et RW1 contiennent du sel de guanidine et ne doivent pas être mélangés avec l'eau de Javel. Tampon RW1 contient de l'éthanol.

4. qRT-PCR Mesure du génome viral

  1. # 1 pour convertir l'ARN du segment S JUNV C en ADNc pour la qPCR postérieure, sous l'ARN viral (généré à l'étape 3.1.4) à la température ambiante dans un volume total de 50 ul.
    1. Pour configurer la réaction de RT, créez d'abord un mélange maître contenant chacun des réactifs suivants par réaction: 6,75 pi de nucléase-free ddH 2 O, 5 pi d'une 2 uM actions de la RT amorce S 2098- à 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), qui est complémentaire de la région NP de l'ARN génomique du segment S, 5 pi de tampon 10X PCR II, 11 pi d'une solution mM MgCl 25 2, 1,25 pi (62,5 unités) de RT enzyme, 1 pi (0,4 unités) d'inhibiteur de RNase, et 10 pi d'un stock de dNTP 500 uM.
      Remarque: Au cours de la réplication arénavirus, 4 espèces virales d'ARN du segment S sont générés: un ARN de pleine longueur génomique (ARNv), une pleine longueur ARN antigénomique (vcRNA) (qui est le complément inverse de l'ARNv), et deux ARNm subgénomiques codant pour les gènes NP et GP, respectivement. L'amorce de RT énumérées ici est spécifique pour que le segment d'ARNv S, mais pas la vcRNA, NP ARNm ou ARNm GP.
    2. Mélanger délicatement le mélange maître RT puis aliquoter 40 pl dans 0,2 ml tubes de PCR individuels. Ajouter 10 ul de l'ARN viral dans chaque tube. Inclure i) un tube pas de contrôle de modèle (par exemple ,. Ajouter 10 pl de libre nucléase de ddH 2 O à 40 pi du mélange maître) et ii) un pas de contrôle de l' enzyme RT (par exemple , ajouter 10 ul d'un échantillon d'ARN viral connu positif à 40 pi de mélange maître qui n'a pas reçu toute enzyme RT) pour dépister la contamination des réactifs de RT avec l'ADN amplifié contenant la séquence cible virale. Inclure l'ARN extrait à partir de cellules non infectées avec le master mix complet RT pour contrôler la spécificité pour le dosage en présence d'ARN cellulaire.
    3. En outre, inclure un échantillon d'ARN viral connu positif au mélange maître complet pour vérifier la qualité des réactifs RT. A noter que le volume de la réaction de RT peut être réduit à 25 ul, si nécessaire.
  2. Soumettre les tubes RT dans les conditions de cyclage suivantes: 25 ° C pendant 10 min, 48 ° C pendant 30 min et 95 ° C pendant 5 min. A noter que les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à ce point ou laissé une nuit dans le thermocycleur en ajoutant une étape C à 4 ° C.
  3. PqPCR dans une performance des services de volume total de 25 ul.
    1. Faire un mélange maître qPCR en combinant les éléments suivants: 2,5 pi (d'un 9 uM stock) de chaque l'amorce directe de PCR S1937 + à 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') et inverse PCR amorce S 2001- à 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 pi (d'un 2 uM stock) de la qPCR sonde S 1960+ à 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), et 12,5 pi du maître 2X universel qPCR mélanger. Notez que l'amorce directe rapportée ici, qui est spécifique pour JUNV C # 1, diffère de 1 nt de la séquence d' amorce initialement rapporté 38, qui vise la souche virulente JUNV Romero.
    2. Mélanger doucement la solution, puis ajouter 20 ul à chaque qPCR ainsi. Ajouter 5 ul de chaque réaction de RT dans les puits appropriés de la qPCR. Mener qPCR en triple pour chaque échantillon testé. A noter que le volume de la réaction PCR peut être réduite à aussi peu que 12,5 pi, si nécessaire.
      Remarque: Le logiciel associéla machine qPCR génère des nombres de copies absolues de n ° 1 segment S ARN génomique JUNV C en comparant la valeur de chaque échantillon inconnu à une série de dilutions standard de plasmide codant pour le gène NP JUNV C # 1, qui est la cible de l'amorce qPCR et l'ensemble de sondes. L'essai qPCR ne peut fournir la quantification des valeurs qui se situent dans la plage de la courbe standard. Pour cette raison, y compris les quantités suivantes de plasmides dans des puits ( en triple exemplaire): 5, 50, 5 x 10 3 à 5 x 10 5 et 5 x 10 7 copies par puits.
  4. Chargez la plaque qPCR dans le thermocycleur et exécuter les conditions de réaction suivantes: 95 ° C pendant 10 min et 40 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 1 min.
    1. Recueillir et analyser les données pour déterminer la quantité d'ARN viral présent dans chaque échantillon selon le protocole du fabricant.
  5. Pour établir une courbe standard en utilisant un échantillon nouvellement purifié du plasmide contenant le goudron qPCRobtenir la séquence, déterminer le nombre de copies du plasmide dans cette solution.
    1. Calculer le poids moléculaire du plasmide. Si la séquence du plasmide entier est connu, le calcul de cette aide de la formule suivante: M = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Rappelez-vous d'inclure le nombre total d'un nucléotide particulier trouvé sur chaque brin de la double plasmide brin.
    2. Si la taille du plasmide est connu, mais sa séquence exacte est pas, calcule le PM dans l'hypothèse que chaque paire de bases ADNdb a un poids moléculaire de 600.
      Note: Le pCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmide utilisé ici a un poids moléculaire de 4,2 x 10 6.
    3. Une fois que le MW du plasmide a été déterminé, calculer le nombre de copies par ml sont présents dans la solution mère de plasmide.
    4. Tout d' abord calculer le pg total de plasmide dans la solution, puis convertir ce nombre de moles de plasmide (par exemple , si 69 ug de plasmide sont contenues dans 300 ul d'eau, puis 6,9 x 10 -5 g de plasmide * 1 mole / 4,2 x 10 6 g de plasmide = 1,6 x 10 -11 moles de plasmide), qui peut être converti en nombre de copies (par exemple 1,6 x 10 -11 moles de plasmide * 6,022 x 10 23 molécules / mole = 9,8 x 10 12 molécules (ou copies)).
    5. Diviser les copies totales du plasmide dans la solution plasmidique par le volume de cette solution pour obtenir des copies par ml (par exemple , 9,8 x 10 12 copies / 300 pi = 3,28 x 10 10 copies).
    6. Diluer cette solution appropriée de telle sorte que 5 volumes ul peuvent être chargés sur la plaque PCR pour fournir la gamme de nombres de copies nécessaires pour établir la courbe standard.

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Representative Results

Pour démontrer la sensibilité et la dynamique de l'essai qPCR, des quantités connues d'un plasmide codant pour le gène NP de JUNV C # 1 (gamme 5-5 x 10 7 copies) ont été soumis à qPCR comme décrit dans la section 4 du protocole. L'essai est sensible et peut détecter de manière fiable aussi peu que 5 copies de l'acide nucléique cible (figure 2). En outre, la plage dynamique de l'essai est grande et, comme le montre la figure 2, peut couvrir au moins 7 logs de modèle. Bien que non représenté, on a détecté moins de 5 x 10 9 copies d'acide nucléique.

Pour illustrer l'utilité du dosage pour la mesure de la fixation # 1 de particules JUNV C, diverses quantités de JUNV C # 1 a été préalablement relié à des cellules Vero E6 comme décrit dans le protocole. Après élimination par lavage de particules non liées, les cellules ont été lysées pour la purification d'ARN et les échantillons d'ARN résultants ont été soumis à une qRT-PCR. Comme on le voit sur ​​la figure 3, le test peut détecter des événements d'attachement viral en utilisant aussi peu que 20 ou autant que 2 x 10 6 pfu, ce qui se traduit par des IAM 0,0004 et 40, respectivement.

Comme on le voit sur ​​la figure 4, il est possible de modifier le protocole de mesurer non seulement la fixation du virus, mais aussi le taux d'amplification du génome contenu dans les particules virales entrant dans le temps. Cette approche modifiée peut être utilisé comme substitut pour déterminer si d' autres défauts dans les étapes restantes de l' entrée virale (endocytose par exemple des particules et / ou la fusion et la libération du génome viral dans le cytoplasme) pourraient se produire. Fait intéressant, la quantité du génome viral semble diminuer au cours de la première fixation 6 h suivant, ce qui indique qu'une partie du génome viral entrant est dégradée. Cela pourrait se produire à des particules qui ne parviennent pas à prendre dans la cellule et se dégradent dans le extracellespace parti- ou peut-être en raison de la dégradation au sein du réseau endolysosomal. Les données présentées démontrent que 12 ou 18 heures après l'infection serait périodes optimales pour le dépistage de la réplication du génome actif.

Figure 1
Figure 1. Représentation du protocole de flux de travaux Les principales étapes de l'essai de fixation du virus de cellule sont : 1) l' incubation des particules virales avec des cellules à 4 ° C pour permettre la fixation du virus à cellules de se produire ensuite des lavages pour éliminer le virus non lié, 2) Purification de l' ARN viral à partir des cellules, 3) transcription inverse (RT) pour convertir JUNV S segment de l' ARN génomique (ARNv) dans l' ADNc, et 4) la qPCR pour énumérer les copies de JUNV S ARNv en tant que mesure de l' attachement du virus des cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2:. Test qPCR pour la détection du génome du segment de JUNV est sensible et peut être utilisé sur une grande plage dynamique Le JUNV S segment de qPCR sonde-amorce ensemble a été testé pour sa capacité à mesurer avec précision des quantités connues (5, 16.6, 50, 5 x 10 3 à 5 x 10 5 ou 5 x 10 7 copies) d'un plasmide de contrôle standard d'ADN codant pour la séquence cible. Dépeints sont les graphes d'amplification (A) et des lignes courbes d'ajustement standard (B). R 2, coefficient de corrélation de jeu amorce-sonde. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: essai de fixation JUNV-cellulaire fiable des mesuresla fixation des particules en utilisant aussi peu que 20. cellules Vero E6 UFP ont été préalablement relié avec des quantités connues de JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2 2 x 10 3 2 x 10 4, 2 x 10 5 ou 2 x 10 6 PFU) pendant 1,5 heure à 4 ° C. particules non liées ont été éliminées par lavage, les cellules ont été lysées pour une extraction d'ARN, et les échantillons d'ARN résultants ont été soumis à une qRT-PCR pour détecter JUNV C # 1 segment d'ARNv S en tant que mesure de la fixation des particules aux cellules Vero E6. Les données représentent le nombre de copies moyen par puits dans des puits en double ± SEM.

Figure 4
Figure 4:. Cinétique de # 1 réplication du génome JUNV C après l' infection des cellules Vero E6 ont été incubées avec 2 x 10 3 PFU de JUNV C # 1 (MOI de 0,04) pendant 1,5 heure à 4 ° C. Après plusieurs lavages dans PBS glacée, les cellules ont été récoltées soit immédiatement (0 h point de temps)ou chauffé à 37 ° C pendant les temps indiqués avant la collecte. Dans chaque cas, l'ARN total a été extrait des cellules et soumis à une qRT-PCR pour détecter JUNV C # 1 S segment d'ARNv. Les valeurs sont inscrites copies en tant que moyenne par puits dans des puits en double ± SEM.

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Discussion

Le protocole que nous décrivons est simple et robuste à condition que les considérations critiques suivantes sont respectées. Tout d' abord, la technique stricte pré-PCR doit être utilisé (voir 28 pour une excellente revue). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d'ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Deuxièmement, pour la partie de fixation virus-cellule du protocole, le virus, les cellules, et les médias doivent être maintenus à 4 ° C pour empêcher l'endocytose des virions liés à la surface. En troisième lieu, la quantité de cellules recueillies pour l'extraction de l'ARN ne doit pas dépasser la capacité de liaison d'ARN du filtre de purification de l'ARN. Quatrièmement, les échantillons purifiés d'ARN viral doivent être protégés de la dégradation de la ribonucléase médiée par l'utilisation de réactifs et de l'équipement sans nucléase et en les gardant sur la glace lors de la décongélation. En cinquième lieu, la plage de la courbe d'étalonnage inclus dans l'analyse qPCR doit être suffisamment grandepour capturer toutes les valeurs observées à partir des échantillons inconnus. En sixième lieu, réplicats techniques devraient être inclus à la fois la partie de fixation du virus à cellules de l'essai, ainsi que la qPCR des échantillons d'ARN individuels. (Par exemple, les contrôles des lignées cellulaires qui expriment hTfR1 ou non) septièmes peuvent être inclus pour contrôler la spécificité de l'essai. Enfin, tout le personnel doit avoir une formation de biosécurité appropriée et l'approbation des institutions pour gérer JUNV infectieuse C # 1 ou d'autres arénavirus pathogènes.

La partie qPCR du protocole appelle à une sonde qPCR principalement pour assurer la spécificité du produit amplifié au cours de chaque étape de la réaction PCR. Le coût de l'essai peut être réduite, cependant, en éliminant cette sonde qPCR en faveur d' une autre chimie qPCR qui ne nécessite pas une sonde (par exemple , l'utilisation du colorant asymétrique SYBR Green I 25) et / ou en réduisant le volume de la mélange réactionnel qPCR utilisé. Si un qPCR application de la sonde indépendanteroach est utilisé, il serait important de vérifier que les conditions de réaction sont suffisamment rigoureux pour assurer la spécificité des amorces qPCR. Il est également important de noter que l' ARN arénavirus, que ce soit extrait des cellules ou virions, peut être apprêtée de manière non spécifique pour former l' ADNc au cours de la RT en l'absence d'une amorce de RT spécifique du virus 12. Par conséquent, copier des numéros détectés en utilisant une amorce RT ARNv spécifique ne reflètent pas strictement seulement les espèces ARNv ciblés par l'amorce de RT. Si une spécificité pour le génome ou l' antigénome est nécessaire, on a rapporté un moyen de contourner ce phénomène d'amorçage non spécifique par l'utilisation d'amorces de RT biotinylé et des billes de streptavidine 12.

Une force importante de ce test est sa sensibilité extrême. D' autres dosages de fixation arénavirus-cellulaire comportant radiomarqué 22, 20 biotinylés ou marqués par fluorescence 21 particules ont exigé de 0,2 IAM, 100 ou 1000, respectivemently. Bien que l'utilisation des résultats des particules radioactivement marqués dans une bonne sensibilité, il nécessite l'utilisation de la radioactivité, ce qui augmente les problèmes de complexité et de sécurité logistiques associés à ce test particulier. La méthode basée sur la qPCR décrite ici nécessite aussi peu que 20 PFU (MOI de ~ 0,0004 dans une plaque de 48 puits) et peut détecter de manière fiable la fixation sur une grande plage dynamique des IAM (par exemple , les IAM de 0,0004 à au moins 40) (Figure 3 ). La forte sensibilité de cet essai permet d'utiliser bas pour IAM mesure plus précise des événements de liaison productives par le virus type infectieux. La sensibilité élevée permet également de réduire de façon significative la quantité de virus nécessaire pour le dosage et, ce faisant, limite les étapes de manipulation supplémentaires qui peuvent influer sur la qualité des virions utilisés dans l'essai (par exemple , le polyéthylène de précipitation à base de glycol de virions, l' étiquetage virions avec fluorophores ou des isotopes radioactifs et / ou le saccharose-bandes de VIRIOns). En outre, le dosage qPCR lui-même est simple à effectuer ainsi que très précis et reproductible.

L'essai cellulaire fixation décrit peut être modifié de manière à mesurer les étapes supplémentaires d'entrée virale, y compris l'endocytose des particules virales, ainsi que l'étape finale de fusion du virus, ce qui est la libération du génome viral dans le cytoplasme. Pour mesurer l'endocytose des particules, les mêmes étapes du protocole de fixation seraient suivies à l'étape 2.5, qui est l'attachement de particules aux cellules à 4 ° C. Les cellules seraient alors chauffées pour permettre aux particules virales à une endocytose, suivie d' un traitement avec une protéase pour enlever toutes les virions extérieurement liés qui ne sont pas endocytose comme décrit 22,24. Les articles 3 et 4 de ce protocole seraient ensuite suivies pour extraire l'ARN viral et quantifier des copies de l'ARN génomique viral en tant que mesure de l'endocytose. Pour mesurer le génome déshabillage suivant la fusion des membranes virales et endosomes, les cellules seraient préliées avecvirus à 4 ° C, réchauffé (pour permettre l'endocytose et la fusion) et dépouillé de particules extérieures, puis collecté pour analyse. Dans une approche, les cellules peuvent être lysées dans un tampon isotonique pour préserver des vésicules intracellulaires, puis divisé en 2 fractions: l' une qui serait traité avec un cocktail de RNases (ARN viral non couché est sensible à la dégradation) et l'autre qui ne serait pas 39 . Alternativement, les cellules peuvent être séparés en cytosolique ou endosomes fractions 40. Dans les deux cas, qRT-PCR sera utilisée pour quantifier le génome viral dans le cytoplasme, en tant que mesure de la décapsidation du génome viral. Enfin, le test qRT-PCR peut être facilement modifié pour étudier l' attachement du virus, l' endocytose, la fusion ou pour d' autres virus à condition que les réactifs de RT-PCR sont adaptés au nouveau virus d'intérêt (voir les exemples 24-27).

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, et Benjamin roi pour des discussions utiles et les National Institutes of Health pour le soutien de ces études par le biais de subventions T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), et P20RR021905 (JB) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’
Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

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