Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Developmental Biology

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Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

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Abstract

Introduction

Induzidas células-tronco pluripotentes a partir de amostras humanas (hiPSCs) são uma tecnologia em rápido desenvolvimento da investigação sobre células estaminais. Eles oferecem uma alternativa à investigação em células estaminais embrionárias (hESC) com muito menos inconvenientes éticos e morais 1,2. Embora eles não são idênticos epigeneticamente para hESCs 3-5, hiPSCs oferecer uma forma única para o modelo de desenvolvimento de doença e fenótipos, e eles podem ser derivados a partir de tecidos relevantes para o estado de doença 5-8. Novos métodos de hiPSCs geradoras estão constantemente a ser explorado para identificar tipos de células ideais para começar, como uma maneira de se preparar iPSCs GMP-qualidade adequados para transplante, e também para aumentar a prontidão ea eficiência do processo de reprogramação 6,9-11.

As células epiteliais das vias respiratórias são críticos no desenvolvimento de inflamação alérgica 12, e o epitélio é um importante factor de respostas alérgicas das vias aéreas e a remodelação através da interacção com Immune estromais e células. O epitélio das vias aéreas desempenha um papel essencial na origem e persistência de doenças pulmonares como a asma. No entanto, as células epiteliais das vias aéreas inferiores são difíceis de obter em um ambiente clínico, especialmente a partir de pacientes de controle saudáveis ​​e crianças. Dados de vários estudos apoiam a premissa de que as células epiteliais da mucosa nasal são uma procuração válida e prático para as vias aéreas inferiores células epiteliais 13-20, especialmente quando se estuda as respostas a poluentes do ar e alérgenos. A mucosa nasal é composto de células epiteliais das vias aéreas ciliada mais de 90% e amostragem dessas células epiteliais nasais (CNE) podem ser facilmente realizados em crianças a partir dos quatro anos de idade ou cinco, como é menos invasivo do que outras técnicas de amostragem de células / tecidos e é associado com um risco mínimo de efeitos adversos, como infecção 20-23. Ele oferece uma maneira rápida e simples para provar as crianças saudáveis ​​e doentes sem tempo, desnecessário e muitas vezes dolorosa procedu broncoscopiares que necessitem de sedação. Estudos anteriores mostraram que os subtipos de doença relacionados com a gravidade da asma podem ser distinguidos em ambos da mucosa nasal, bem como amostras de células bronquiais tomadas a partir de crianças asmáticas, e a expressão do gene entre os dois tipos de tecidos foi semelhante em cerca de 90% dos genes não ubíquos 22 , 24. Como fonte para iPSCs, CNE oferecer vantagens sobre outros tipos de células frequentemente utilizados. Os fibroblastos são muitas vezes utilizados para a geração de CIPS, mas apesar dessas células pode facilmente ser cultivada a partir de uma biópsia da pele, este processo normalmente requer anestesia local, uma incisão, e suturas, e está associada a um certo risco de infecção. Portanto, a obtenção de consentimento informado dos pacientes para este tipo de biópsia pode ser difícil 25. Uma alternativa para os fibroblastos são as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). No entanto, pode ser difícil de obter sangue suficiente para geração iPSC de pacientes pediátricos. Além disso, há limitações de AP jusanteplicações para fibroblastos e iPSCs de glóbulos derivados, especialmente sua capacidade de diferenciação de certos tipos de células 5,26. Portanto, dada a acessibilidade relativa e o baixo risco de efeitos colaterais após a colheita, NECs representam uma fonte de células ideal para a geração de iPSC de populações pediátricas.

iPSCs têm recebido muita atenção recentemente como uma plataforma para o estudo do desenvolvimento humano, gerando novos modelos de doenças, e como uma fonte potencial de células para terapias personalizadas. Antes de todo o potencial desta tecnologia pode ser realizado, as bases moleculares do processo de reprogramação precisam ser elucidadas, mas por agora este protocolo e os procedimentos descritos no prazo irá elucidar os estudos de pesquisa voltadas para as exposições das vias aéreas, bem como fornecer uma plataforma para estudar os efeitos da medicina personalizada envolvendo iPSCs.

O trabalho colaborativo de vários laboratórios levou à generatioN de uma técnica bem sucedida, não só para a amostragem da mucosa nasal, mas também a cultura CNE, e reprogramar essas células para iPSCs 23. Este artigo fornece um esboço de um protocolo de amostragem ideal, cultura e condições de reprogramação.

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Protocol

O protocolo a seguir segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana instituições.

1. A amostragem da mucosa nasal

NOTA: obter amostras de indivíduos que estão livres de sinais de infecção viral respiratória.

  1. Prepare um 15 ml fresco cónica antes da visita participante e adicionar 2 ml BEGM (brônquica epitelial Médio celular Crescimento) mais 20 ul estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. Abrir escova de citologia pouco antes de tomar a amostra, e não se esqueça de manter a escova estéril e não tocá-lo para qualquer superfície, além das superfícies nasais.
  3. Peça ao participante para ficar parado e incline a cabeça para cima em direção teto. Têm menor ou mais crianças inquietas se sentar em suas mãos e / ou deitado para evitar golpear escova de distância.
  4. Aponte escova na parte de trás do nariz, onde a passagem estreita (Parece que um pequeno buraco negro). Deslize a escova para baixo e torcer pulsos enquanto o pincel é removido nostrieu.
  5. Coloque a escova no cônica e submergir em BEGM. Corte o excesso de escova e recoloque a tampa no tubo. NÃO VORTEX.
    NOTA: Se o participante está disposto, obter uma segunda escova da mesma maneira, mas no segundo narina. A obtenção de uma escova de ambas as narinas vai resultar em uma maior probabilidade de que a amostragem será bem sucedida. Amostragem do mesmo narina pode resultar em sangramento e não irá provavelmente aumentar a amostra.
  6. Manter as amostras como perto de 37 ° C quanto possível durante o transporte usando um copo com água morna.

2. Contagem de Células e Cytospin

  1. Agite suavemente o pincel na BEGM e tomar 10 ml da amostra para uma contagem de células usando um hemocitômetro. Adicionar 10 ml de uma mancha ao vivo / morto e contar apenas células vivem sob um microscópio.
  2. Tomar 50 ul de amostra e dilui-se para 200 mL com PBS 1x. Adicionar ao funil cytospin ligado a lâmina de vidro e girar a 300 rpm durante 2 min. Vamos deslizar O N e mancha de slides / dry following instruções do fabricante. Deixar secar S / N, de preferência no escuro.
  3. Deslize mancha com Hema 3 Stain
    1. Transfira cada solução (Hema fixador, azul claro; Solution Hema 3 I, rosa, e Hema 3 Solução II, azul profundo) em uma placa de coloração; Manter coberto quando não estiver em uso. Inserir slides em slides barco coloração
    2. Dip slides continuamente em fixador durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso escorra para. Dip desliza continuamente em Solução I durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso escorra para. Dip desliza continuamente na solução II durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso de drenar
    3. Enxágüe com água deionizada até que a água corre claro. Deixar secar S / N, de preferência no escuro
  4. Olhe para a corrediça sob o microscópio células e contagem, determinar porcentagem de células epiteliais. Deve ser de 90% ou mais se a amostragem é boa.

3. Células Sementeira

NOTA: Realizar todos os procedimentos de cultura de células em uma cultura de tecidos adequada e certificadaexaustor com técnica estéril.

  1. placas de revestimento com Bovine Collagen dérmica (BDC), tipo 1. Adicione 0,5 ml de 3 mg / ml BDC diluído em 49,5 ml de 1x PBS. Prepare menos se será utilizado apenas algumas placas. Revestimento um frasco T25 com 2 ml BDC e incubar em estéril capa O / N ou a 37 ° C durante 2 horas, se necessário.
  2. Após a incubação, aspirar o líquido restante. Expor frascos à luz UV durante 30 minutos na capa estéril. frascos para armazenar até um mês a 4 ° C, mas trazê-los à temperatura ambiente ou 37 ° C antes de semear as células.
  3. Mantenha a escova e em células BEGM a 37 ° C até estar pronto para semear. Escove suavemente swish dentro cônica, mas não vórtice.
    1. Placa de 7 x 10 5 células em um frasco T25. Se houver menos, utilizar um recipiente mais pequeno, tal como um poço de uma placa de 6 poços. Esta placa de tamanho requer cerca de 3 x 10 5 células.
      NOTA: Se não houver esta quantidade de células, não é aconselhável para continuar.
  4. Sob um capuz estéril, leve escova fora do tubo e gently girar escova na superfície do frasco revestido, tomando cuidado para não riscar o revestimento. Descarte pincel em um recipiente de risco biológico apropriado.
  5. Lentamente pipetar as células restantes em BEGM fora da cónica e para o balão T25. Observar as células ao microscópio. Um número de células flutuantes serão observados e pode haver alguns detritos a partir do nariz, o que é aceitável nesta fase (Figura 3A).

Cultura 4. celular

  1. Depois de células semear, deixá-los se contentar com 48 horas sem interrupção (Figura 3). Após 48 horas, lenta e suavemente adicionar 2 ml quente BEGM e 20 mL estéril penicilina / estreptomicina / Fungizone (P / S / F).
    NOTA: NÃO aspirar os originais 2 ml de mídia.
  2. No 4º dia após a sementeira, aspirar cuidadosamente todo o líquido, e substituir com 4 ml fresco, aquecida BEGM mais 1x Pen / Strep (fungizona não é mais necessário). Mudança de mídia a cada dois dias e avaliar células para anexarmento, crescimento e confluência. Quando as células atingem ~ 80% de confluência, geralmente em 2-3 semanas, eles estão prontos para ser passado.
  3. Um balão T25 (cerca de 2,5 X 10 6 células quando confluentes) podem ser passadas para frascos T25 três ou um frasco T75. Após a primeira passagem, as células devem ser robusto e saudável, atingindo confluência a cada três dias.

5. As células Passaging

  1. Aspirar cuidadosamente a mídia a partir da placa. Adicionar 1 ml de solução de 0,05% de tripsina por frasco T25 a placa e lugar na incubadora durante cerca de 4 min, ou até que as células separar da placa. Verifique o nível de desprendimento de células a cada 2 min e não deixe de tripsina em mais de 10 min.
  2. Adicionar 5 ml de tripsina Neutralizante Solution (TNS), ou a mídia contendo soro para neutralizar a enzima. Retire todo o líquido e as células do frasco e coloque em um tubo de 15 ml.
  3. Centrifuga-se a 200 x g (aceleração desaceleração 0 0) durante 5 min para obter um pellet de células. Aspirar supernatant células e ressuspender em BEGM + P / S no volume necessário para os novos frascos (4 ml para um frasco T25, 10 ml para um frasco T75)
  4. Efectuar a contagem de células com um corante vivo / morto, tal como descrito acima (2,1). Adicionar uma quantidade adequada de células BEGM e para os frascos revestidos e retornar para a incubadora. Manter como detalhado acima ou criopreservar em meio de congelação (70% BEGM, 20% de FBS e 10% de DMSO) a uma concentração de 0,5-2 x 10 6 culas por ml.

6. A reprogramação para iPSCs

NOTA: Antes de gerar iPSCs, garantir a adesão a todas as normas institucionais que regem a produção ea utilização de iPSCs humanos. técnica estéril é especialmente importante para as culturas IPSC, como meio de cultura não rotineiramente contêm antibióticos. É fundamental que NECs parecem saudáveis ​​e são robustamente proliferativa para a reprogramação de sucesso.

  1. Placa de 5 x 10 5 CNE por poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Após 24 horas, adicionar polibrenopara BEGM a uma concentração final de 8 mg / ml e transdução NECs adicionando partículas lentivirais expressando Oct4, Sox2, KLF4, c-Myc para a mídia. Destinam-se a conseguir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ~ 27.
    1. Para a determinação do MOI, preparar diluições em série do stock concentradas-lentiviral e transduzir células HT1080 com estas diluições. Após a primeira inequivocamente a detecção de expressão dTomato nas células HT1080, calcular o número de "unidades de transdução / mL", marcando o número de células positivas / dTomato pequenos aglomerados de células em cada diluição.
      NOTA: Normalmente, haverá diluições que são demasiado elevados (tudo é dTomato positivo) e muito baixa (nenhum ou apenas um par de células positivas).
    2. Execute pontuação das diluições em que as células positivas discretas / pequenos aglomerados de células é identificada. Determinar o título corrigindo o número de transduzir unidades / ml com o factor de diluição apropriado. MOI é, em seguida, a relação entre o númerode células transduzidas com o número de partículas de vírus 27.
      NOTA: Cada dTomato celular positiva / pequeno grupo é assumido a surgir a partir de uma única partícula de vírus.
  2. Cerca de 3 horas após a transdução, remova a mídia e substituir com BEGM fresco. Descarte de mídia contendo Lentivírus usando procedimentos institucionalmente aprovados. Retorno CNE transduzidas para a incubadora durante 3 dias.
  3. No dia 3, substituir a mídia com BEGM frescos, e, em seguida, incubar por mais 3 dias. Aspirar gasto meios, lavar as células com PBS 1x e adicionar 1 ml de 0,05% de solução de tripsina para o poço. células de passagem com tripsina como escrito acima (seção 5). Aspirar cuidadosamente as células sobrenadante e ressuspender em 4 ml BEGM + P / S. As células podem ser passadas para um novo poço de uma placa de 6 poços revestidas com BDC, ou adicionados a culturas MEF, se pronto (ver próximo passo).
  4. Prepare placas revestidas MEF. No dia 4 adicionar solução de gelatina a 0,1% (1 ml / poço) para 2 poços de uma 6 bem (para realizar +/- Thiazovivin (SPT) veja o passo 6.6). Na próximadia, descongelar um frasco de MEFs inativadas 28.
  5. Coloque MEFs em 10 ml de meio DMEM + MEF (1x NEAA + 10% de dFCS). Centrifugação a 200 xg durante 5 min para sedimentar. Ressuspender em media MEF. Gelatina aspirado a partir da placa de 6 poços e adicionar 1,87 x 10 5 MEFs por poço da placa de 6 poços revestidos com gelatina. Incubar O / N a 37 ° C, ou para um mínimo de 24 hr.
  6. Transferir 2 ml de BEGM contendo células transduzidas por poço em 2 poços de uma placa de 6 poços previamente revestidas e incubar O / N. No dia seguinte, substituir BEGM com 2,5 ml por poço de meio de células estaminais embrionárias humanas normais que contêm o factor de 4 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico. Alimentar as células com a mídia CTEh fresco +/- SPT dia durante 10 dias
    NOTA: É possível adicionar um cocktail de pequenas moléculas (SB431542, PD0325901 e Thiazovivin () cocktail SPT) para melhorar a eficiência e cinética de reprogramação para NECs 23.
  7. Depois de dez dias, continuar a alimentar diária usando a mídia hESC sem SPT. Alimente culturas diariamente até colónias hESC-likeaparecer (Figura 5A, P0 colónia). Identificar colônias que abrigam iPSCs putativos por sua alta núcleo: relação citoplasmática e nucléolos proeminentes.
  8. Manualmente especiais de consumo e de transferência de colónias com morfologia hESC-like para separar poços para a cultura e expansão como linhas separadas em um sistema de livre-alimentador. colónias excisadas deve adaptar-se rapidamente a estas condições.
    1. Depois de colônias chapeamento excisadas estas linhas IPSC putativos discretos são agora considerados passagem 1 (P1). culturas diário de ração com mTeSR1. Passagem e expandir linhas de IPSC, utilizando procedimentos padrão. Pode demorar vários dias a uma semana para as colónias p1 para alcançar o tamanho em que eles devem ser passadas.

7. Manutenção iPSCs em Cultura

  1. Alimentar e avaliar culturas diariamente. Manualmente áreas especiais de consumo exibindo diferenciação ostensiva raspando com uma pipeta de vidro esterilizada ou ponteira micro. Mudança de mídia após a colheita diária.
  2. células de passagem após approximamadamente, de quatro em quatro dias: meios delicadamente aspirado, adicionar 1 ml de dispase quente (1 mg / ml) por poço de uma placa de 6 poços (metade do volume de alimentação), em seguida, incuba-se a 37 ° C durante cerca de 4 min. As bordas das colônias vai começar a levantar, que se parece com um esboço branco ao redor da colônia. Suavemente aspirar o Dispase e lavar 3x com aquecida DMEM / F12.
  3. Adicionar 2 ml mTeSR1 e utilizar um elevador de célula para levantar as colónias da placa. Use uma pipeta de 5 ml serológicos ou micropipeta P1000 para triturar suavemente as células até que as colônias são divididos em grupos menores.
    1. Evite produzindo muito pequenos grupos ou células individuais, como a sobrevivência e proliferação subsequente será sub-óptima. Quando re-plaqueamento colónias, uma mistura 1: 4 a 1: 6 de divisão vai manter a densidade óptima de colónias. Remova cuidadosamente colônias e mídia da placa e adicione aos poços novos, revestidos com Matrigel.

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Representative Results

A parte inicial do nariz, chamado de vestíbulo nasal, é a área cercada por cartilagem 29. A escova tem de ir suavemente passado esta área do nariz, para além da válvula nasal (ostium internum, ou o "buraco negro" visto na parte de trás da narina), e a amostra é obtida a partir da concha inferior (Figura 1). As conchas nasais são estruturas ósseas que aumentam a área da superfície do nariz 29, o que os torna um local ideal para a amostragem. A área também é revestida por tecido da mucosa vascularizada, o que se assemelha o revestimento das vias aéreas inferiores e também é ativa na resposta imune às exposições ambientais.

Amostragem do tecido correcta garante que as células que são reprogramadas são células epiteliais. Isto pode ser avaliado pela contagem de células Cytospin e inicial, mas também através da observação das células em cultura. oCytospin, uma vez centrifugadas, seca, e manchada, mostra a composição da amostra. A maioria das amostras são constituídos por células epiteliais, que são colunar e ciliados, com um núcleo redondo. Com o kit de mancha Hema 3, eles manchar uma cor azul claro com um núcleo roxo mais escuro (Figura 2), e, muitas vezes, quando tomado diretamente do nariz eles são vistos aglutinados. Embora amostras de células nasais são inicialmente uma mistura de tipos de células, bem como os detritos a partir do nariz, com o tempo em cultura e com mudanças de meio, as células epiteliais se tornam predominantes (Figura 3A, B). Quando as células epiteliais estão a crescer até à confluência, elas têm a forma de um ovo recentemente obtido por cracking, onde o núcleo é grande e está localizado no centro e o citoplasma é uma espécie de "estendendo" e estendendo-se a célula se prepara para dividir (Figura 3B). Como as células crescem juntos, eles começam a assumir mais de uma forma de futebol, e se encaixam perfeitamente no prato (Figura3C).

Uma vez que as células transduzidas são, eles irão expressar o tdTomato marcador fluorescente no núcleo. A Figura 4 mostra as células uma vez que foram transduzidas, em campo brilhante, fluorescência e com ambas as imagens fundidas. Não cada célula expressa o marcador, e portanto nem todas as células foi transduzido, mas cada poço deverá ter cerca de 90 por cento da eficiência de transdução, e isso irá aumentar a probabilidade de que algumas células irá alcançar pluripotência após serem semeadas em MEFs.

Uma vez que co-cultivadas com MEFs e como as células começam a se formar colônias, eles gradualmente vai parar de expressar tdTomato. No entanto, esta não é a melhor indicação de formação de colónias. A melhor indicação da formação de colónias é a confirmação visual. colónias hESC, que são o "padrão ouro" da pluripotência, são na sua maioria redonda e são compostos de muitas células pequenas, redondas com large núcleos e uma elevada proporção de núcleo para o citoplasma. Cada célula aparece principalmente composta dos núcleos, e outros organelos não são claramente visíveis. Seguindo iPSC colheita colônia, e da cultura em condições normais de livre-feeder, recém-formado colónias IPSC deve olhar bem como suas contrapartes hESC, e as células individuais são quase idênticos para o fenótipo hESC, como visto na Figura 5B.

Antes de iPSCs utilizando gerados a partir de células epiteliais nasais (NEC-iPSCs) em experimentos, é aconselhável para avaliar a qualidade de novas linhas. Isto tipicamente envolve a avaliação do cariótipo, a expressão de marcadores de pluripotência, e a capacidade de se diferenciar em iPSCs cada uma das 3 camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme). Capacidade de diferenciação pode ser ensaiada de várias maneiras, mas actualmente, o ensaio mais rigoroso é o ensaio de teratoma 2,23,30. ensaios mais abrangentes, tais como transcricional e profiling epigenômico são úteis para determinar se quaisquer anormalidades cromossômicas são introduzidos através da reprogramação 23.

figura 1
Movimento Figura 1. corneto inferior. Amostragem e o alvo de amostragem, o corneto inferior, é indicado pela seta preta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Cytospin. A maior parte da amostra é constituída por células epiteliais, que são longos e colunar, com cílios numa das extremidades e um núcleo em torno do outro. Eles são muitas vezes aglutinados quando amostrados diretamente do nare. As setas indicam células epiteliais individuais."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. As células primárias nasais epiteliais em cultura. Células flutuantes (A) e detritos apenas após a amostra é recolhida e banhados. (B) Células um dia depois de ser passadas. A morfologia celular é consistente e a cultura é principalmente constituída por células epiteliais nasais, ampliação de 10x e ampliação (C) 5X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Transdução de CNE. Cells sendo transduzidas assumiram o vector e mostrar o tdTomato fluorescência marcador vermelho. Este marcador deve desaparecer à medida que progridem rumo a um estado pluripotente. (A) imagem de campo brilhante de células transduzidas. (B) imagem fluorescente de células transduzidas. (C) Sobreposição de campo brilhante e imagens fluorescentes (painéis A e B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. iPSC tronco colônias de células-like. (A) que cresce em MEFs, colônia é principalmente redonda sobre as bordas e mostra pouca ou nenhuma diferenciação. (B) As células individuais mostram morfologia típica hESC-like, com pequenas células redondas com núcleos grandes.5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Células epiteliais nasais (CNE) são uma plataforma acessível para o estudo de doenças das vias respiratórias, e NEC-iPSCs oferecer uma avenida emocionante para explorar o desenvolvimento da doença, tratamento e terapia 1,31,32. CNE pode ser facilmente obtida sem procedimentos prejudiciais estressantes ou potencialmente 6,23. Em nossa experiência, a amostragem da mucosa nasal, como descrito neste protocolo parece ser menos estressante e melhor percepção do que a coleta de sangue para as crianças. Por conseguinte, este método pode ser particularmente úteis nas populações de pacientes pediátricos e relevante para o estudo de doenças das vias respiratórias. A outra vantagem do CNE é que uma vez que eles estão em cultura, as células epiteliais são selecionados para com os meios e condições de cultura e se tornar homogénea. Isto é vantajoso do que usando um tecido complexo, tais como células do sangue e faz com que seja mais fácil para avaliar o impacto de origem celular em linhas de IPSC resultante utilizando abordagens transcriptomic e epigenética.

Quandoamostragem da mucosa nasal, é importante que a área correcta do nariz é amostrado de modo que as células epiteliais são recuperados principalmente, como evidenciado através da visualização do Cytospin sob um microscópio (Figura 2). Uma amostragem correcta vai render ≥90% de células epiteliais. É crítico para obtenção de amostras de pacientes saudáveis, e para assegurar que a amostra é recolhida de forma apropriada de modo a maximizar o número de células obtidas e plaqueadas. O movimento de torção descrito no protocolo (secção 1.5) garante que a escova entra em contacto com o máximo da superfície nasal quanto possível. É um reflexo natural de virar a cabeça quando um objeto estranho está caminhando para o rosto. Portanto, no caso de uma criança ou vira a sua cabeça ou afasta-se, é essencial que a amostragem ocorre rapidamente e com precisão. Usando estas técnicas irá aumentar a eficiência de qualquer outro passo do protocolo, e determinar o risco de reprogramação. Pedindo à criançadeitar-se, e até mesmo para colocar as mãos debaixo deles ou ter um pai ou irmão segurar suas mãos é uma boa maneira de incentivá-los a permanecer imóvel e para ajudar a garantir uma coleta de amostra suave e indolor.

Recentemente, algumas outras técnicas de amostragem foram avaliadas para o conforto, facilidade, e os resultados da amostra, com base no conteúdo celular e composição, bem como ARN e ADN produz 33. O grupo de avaliação de amostragem com uma escova de citologia em comparação com um swab de poliéster, e eles amostrados tanto o corneto inferior, bem como as narinas anteriores por agitação vigorosamente a pincel ou cotonete em volta das narinas. Amostragem da concha inferior com uma escova foi encontrado para ser um pouco desconfortável, embora deu os melhores rendimentos de ARN, é constituída pelas células epiteliais ciliadas mais, em comparação com um cotonete de poliéster. O método proposto neste protocolo é, portanto, verificar como o método mais confiável de amostragem os epitélios nasais como uma forma de estudar vias aéreas respiratóriasepitélio.

Uma vez que a amostra é obtida, ela deve ser mantida a 37 ° C. Uma das maneiras mais eficazes é para aquecer um copo de água para mais de 37 ° C e se aninham-lo em um recipiente de isopor para transporte seguro enquanto se prepara para enfrentar o participante. Pouco antes de a amostra é recolhida, adicionar água fria de modo a que a temperatura é levada até cerca de 37 ° C, e adicionar o tubo cónico com os meios de comunicação. Quando a escova é adicionado ao tubo de cónico, devolver o tubo imediatamente para o banho de água e mantê-lo aí até que possa ser devolvido ao laboratório, no ponto em que o tubo deve ser colocado num banho a 37 ° banho de água regulado C até as células são semeadas em um frasco de cultura. Em todos os pontos, uma técnica estéril deve ser usada para evitar a introdução de agentes estranhos na cultura.

Uma quantidade considerável de variabilidade entre as amostras foi observada quando as células foram colocadas em cultura. Esta variabilidade parece decorrer tanto a fonte de dador, bem comoa própria qualidade da amostra. Uma maneira de aumentar a qualidade da amostra é a obtenção de uma escova de cada narina, ou duas escovas por participante. Após espalhar a amostra fresca, e, como as células são passadas, a condição das células devem ser monitorizados regularmente para ter certeza de que eles estão aptos a ser reprogramado. Células que produzem os melhores candidatos para são os que levam à cultura e proliferam rapidamente. Não se sabe por que as células provenientes de certos dadores são mais robustos do que os de outras células, mas pode ser devido a factores tais como a idade, tamanho do nariz, e a saúde do doador no momento da amostragem. Quando uma amostra rendimentos muito poucas células, ou somente um pequeno número de células uma vez com anexação plaqueadas, a amostra é improvável a crescer até à confluência. Se uma cultura lutando faz chegar a confluência, as células tendem a ser fracos e muitas células morrem durante passaging. Este tipo de amostra é um candidato muito pobre para a reprogramação, uma vez que é essencial que as células a proliferar rapidamente e de forma robusta, e que eles sãotransduzidas com a maior brevidade número de passagens possível. Não é aconselhável para transfectar células que estão a crescer lentamente, se isto é devido à variabilidade doador, pobre amostragem, ou culturas Passaging muito fino. Se a reprogramação é tentada com uma cultura de células pobre, é pouco provável que continue a ser concretizadas.

Preparação das células para a transdução é uma parte do protocolo que é mais difícil de preparar. Com base no crescimento das células, 2 x 10 5 a 5 x 10 5 células são sugeridos para a transdução e este pode dependente de amostras específicas do paciente. Por isso, pode exigir algumas poços revestidos a variação do número de células para obter o número ideal.

Este protocolo descreve não só a facilidade de amostragem, mas também a relativa facilidade e prazos de estabelecer culturas de células primárias, e subsequente reprogramação dessas culturas de células primárias para linhas de IPSC para oportunidades de pesquisa mais sustentáveis ​​e versáteis. o inteiroprocesso de clínica para estabelecimento de iPSCs discretas na cultura leva cerca de 3 meses, e novos métodos para reduzir os tempos de reprogramação estão sendo desenvolvidos 6,34,35. Este campo está evoluindo rapidamente para encontrar formas mais eficientes e completos para converter células primárias para iPSCs, e para diferenciar posteriormente iPSCs em tipos de células e tecidos específicos de interesse. No entanto, os protocolos de diferenciação de tecidos importantes para a doença das vias aéreas, tais como o epitélio do pulmão, estão ainda a ser trabalhados 36-38.

Gerando iPSCs de CNE tem a vantagem de isolamento simples e relativamente indolor de células. Além disso, é possível que NEC-iPSCs oferecer vantagens sobre iPSCs derivadas de outros tipos de tecidos que podem ser exploradas. O impacto da epigenética IPSC na subsequente diferenciação iPSC não é completamente compreendido, embora as evidências indicam que ratos e humanos iPSCs abrigar a memória da transcrição e epigenética de sua célula somática deorigem e que isso favorece selectivamente a sua diferenciação em linhagens associados com o tipo de célula do dador, enquanto restringir outros destinos 5,26. Devido à importância do tecido de origem, e como isso afeta as propriedades funcionais de iPSCs, especialmente com respeito à retenção de marcas epigenéticas específicas do tecido 39-45, linhas de IPSC precisam ser mais claramente estudado a fim de melhor compreendida a impacto do tecido de origem. Foi previamente mostrado que iPSCs NEC-derivados abrigar uma assinatura metilação genómico indicando retenção de uma memória epigenética do seu tecido de origem 23. Tal memória epigenética retida na NEC-iPSCs pode ser benéfico na diferenciação de células estaminais pluripotentes para células das vias respiratórias, como estudos anteriores demonstraram que iPSCs de glóbulos derivados exibem memória epigenética das células sanguíneas de origem são mais facilmente diferenciar-se em células de sangue de fibroblastos ou iPSCs derivadas de músculos lisos que faltam Blood específica de células 5,26 memória epigenética. Dado o enorme potencial das células das vias aéreas iPSC derivadas de doenças pulmonares modelagem, será importante para estudar se NECs representam um tipo de célula ideal para a diferenciação das iPSCs em vias aéreas células / tecidos. Além disso, esta memória estavelmente mantidos pode representar localizações cromossómicas resistentes à reprogramação e candidatos para estados de doença de células dadoras. Como protocolos para converter iPSCs para proximal e tipos de células de pulmão distais são desenvolvidos 36-38, estes NEC-iPSCs podem ter uma vantagem em doenças das vias respiratórias modelação, tais como asma, COPD, fibrose quística, e muitos outros, e em estudar os efeitos ambientais no desenvolvimento de pulmão e homeostase.

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Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Stem Cell pluripotentes ea Imagem Confocal Núcleo do Hospital Infantil de Cincinnati. Este trabalho foi apoiado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

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