Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Emostasi richiede l'attività combinata e regolata di cellule, proteine, ioni e tessuti in un contesto spazio-temporale limitato 1. Attività incontrollata può portare a emorragia o trombosi e morbilità o mortalità in uno spettro di disturbi legati alla coagulazione del sangue. Un esperimento camera di flusso microfluidica è una tecnica impegnativa che imita emostasi in vitro. Questo approccio permette di indagine della complessa interazione di processi che prendono parte a emostasi con un ruolo di primo piano per le piastrine del sangue.

A seguito di danno vascolare, le piastrine aderiscono alle proteine ​​della matrice sottoendoteliale esposto (glico) per prevenire la perdita di sangue. Dopo l'adesione, piastrine attivano e aggregate in risposta automatiche e segnalazione paracrina che alla fine porta alla formazione di una rete di piastrine, stabilizzata da fibrina e conseguente fermo, avvolti trombo 2 sigillatura. A differenza di molti altri test di funzionalità piastrinica, rienzementi con camere di flusso tengono conto del parametro fisico del flusso sanguigno e quindi l'influenza della reologia sulle cellule e biomolecole 3,4 partecipanti.

esperimenti camera di flusso hanno generato intuizioni punto di riferimento in emostasi e trombosi variando i parametri chiave che influenzano emostatico (sub) processi tra cui i profili matrice adesiva, reologia e di flusso, composizione cellulare, la presenza di tossine o farmaci, forza ionica e molti altri. Negli ultimi due decenni, bassa produttività esperimenti camera di flusso che richiedono grandi volumi di campione (10-100 ml) si sono evoluti per camere di microfluidica spesso costituite da piccole camere a piatti paralleli e tra le moderne tecnologie per la perfusione di sangue intero in condizioni di parete di taglio a controllo 5. Microscaling ha notevolmente aumentato il throughput test soprattutto perché la configurazione hardware è semplificato ed è richiesto meno (del sangue) del volume, rendendo l'esperimento più accessibile e versatiLe. Per esempio, il sangue da piccoli animali da laboratorio può ora essere utilizzato senza dover sacrificare animali. I campioni di sangue di topi geneticamente modificati hanno quindi aiutato l'identificazione di molecole chiave che promuovono o inibiscono emostasi e in nuove intuizioni fondamentali 6.

Laboratori di ricerca specializzati spesso usano ancora camere a flusso su misura, ad esempio, da polidimetilsilossano (PDMS) 7 che polimerizza su stampi litografate che può essere blueprinted da un software. La camera risultante è poco costoso, monouso e può essere facilmente smontato per l'analisi post hoc. Inoltre, in pratica qualsiasi progettazione di navi, comprese le biforcazioni o curve strette può essere costruito su comando. Questo vantaggio è anche il suo lato negativo in quanto la standardizzazione era già il problema principale con gli esperimenti camera di flusso, e PDMS su misura le camere non hanno aiutato questo. In cima a questa particolare questione, rivestimento (condizioni), sonde fluorescenti, anticoagulante, temperaturaeratura e ora tra il campionamento e l'analisi sono tutti poco standardizzati 8. La standardizzazione di queste variabili è impegnativo, ma comunque atti a consentire un confronto dei risultati tra laboratori. Questo argomento è il principale soggetto della Società Internazionale sulla Trombosi e Emostasi in sottocomitato scientifico e standardizzazione su Biorheology 9,10.

concentrati piastrinici (PC) sono trasfusi in pazienti affetti da varie malattie che causano trombocitopenia e / o sanguinamento. Ma piastrine in PC sono noti per desensibilizzare, soprattutto in funzione del tempo di memorizzazione 11, un processo di degrado legato all'invecchiamento e comunemente indicato come lesione stoccaggio delle piastrine. A volte si afferma che tali piastrine ripristinare in circolazione una volta trasfuse 12, ma la prova di questo è scarsa. Inoltre, la funzionalità delle piastrine che compongono un PC non è normalmente testato perché il rapporto tra tali analisi eefficacia terapeutica o profilattica non è chiaro 13. camere di flusso microfluidica offrono un mezzo per indagare la funzione piastrinica in PC per ottimizzare la catena di manipolazioni tra raccolta e rilascio. Si tratta di un potente strumento di ricerca per (appaiati) il confronto diretto dei PC, come abbiamo precedentemente pubblicati 14,15 ed è descritto qui.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida etiche istituzionali per la ricerca su campioni umani e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori coinvolti. L'approvazione per gli esperimenti descritti qui è stato ottenuto dal Comitato Etico dell'Ospedale di Anversa University.

Nota: le indicazioni di temperatura sono sempre a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

Installazione 1. Preparazione camera di flusso

  1. Lanes Preparazione, tubi e Pins
    1. Vortex la sospensione collagene vigorosamente e diluire 1/20 nella soluzione di glucosio isotonica fornito dal fornitore per una concentrazione finale di 50 pg / ml.
      Nota: Usiamo collagene tendine equino, costituito principalmente di tipo I fibrille. Il equina collagene di tipo I è spesso definito come "Horm" collagene ed è lo standard d'oro per questo tipo di test 9 per entrambe le ragioni storiche e biologiche. tipo umano collagene III può anche essere utilizzato, ma the fibrille cappotto meno bene e la risposta piastrinica non è così forte. Altre superfici rivestimento possono anche essere utilizzati, ad esempio von Willebrand (VWF), fibrinogeno, fibronectina, laminina, vitronectina, thrombospondin-1 o combinazioni di questi 16.
    2. Prendere un nuovo biochip usa e getta dal contenitore del provider. Le dimensioni dei biochip usati qui sono 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3.
    3. Pipettare 0,8 microlitri nella corsia (s) del biochip microfluidico su un'estremità del chip e marchio come uscita. Assicurarsi che la corsia è riempito 5/6 ° con il collagene contenente soluzione di rivestimento preparata in 1.1.1. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria.
      Nota: I canali sono parzialmente rivestite per evitare l'accumulo di fibre collagene all'ingresso del canale (vedi la discussione).
    4. Incubare a 4 ° C per 4 ore o durante la notte in un contenitore umidificato e chiuso.
    5. Bloccare i canali rivestiti pipettando tampone di bloccaggio (1,0% (w / v) di siero bovino di albumina und 0.1% (w / v) di glucosio in 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) Soluzione salina tamponata (HBS, 0,9% (w / v) di NaCl, pH 7,4) all'altra estremità e marchio come ingresso. Assicurarsi che la corsia è completamente riempito con il tampone bloccante evitando bolle d'aria.
    6. Tagliare il tubo a parità di lunghezza (12 cm). Utilizzare uno per corsia e collegare ogni tubo con uno spillo. Ad esempio, un esperimento a confronto due condizioni, eseguire in duplice copia richiederà quattro tratti di tubi e quattro perni per essere preparati.
    7. Risciacquare il tubo con acqua distillata utilizzando una siringa e un ago G 26 o connettori di accompagnamento.
    8. Saturare il tubo con tampone di bloccaggio. Conservare in un contenitore chiuso e umidificato per almeno 1 ora.
  2. Preparazione della pompa e collettore
    1. Risciacquare la pompa e il collettore con acqua distillata, rimuovere le bolle d'aria.
    2. Aspirare il tampone bloccante dalla corsia biochip (s) con la punta 10 microlitri fissato all'uscita. Pulire la superficie diil biochip con una polvere di precisione senza strofinare e alcol denaturato per rimuovere impronte e polvere.
    3. Fissare il biochip su un palco microscopio automatizzato. Se più di una corsia viene utilizzata contemporaneamente in una corsa, collegare l'otto corsie collettore splitter alla presa biochip.
      Nota: Il collettore splitter otto corsie è un pezzo di hardware (Figura S1) collegato alla pompa e il biochip. Esso consente il funzionamento di tutti (otto) corsie su un biochip o una combinazione di corsie che possono essere operatore definito nel software di accompagnamento disponibile.
    4. Utilizzare i perni nel tubo di risolverli in entrata biochip. Inserire l'altra estremità del tubo (senza perno) in 1,5 ml provetta conica riempita con HBS. Risciacquare tutti i tubi e loro corsie comunicanti con 1 ml HBS utilizzando la pompa, in modo da eliminare resto tampone bloccante e scarsamente aderente collagene.

2. Preparazione di campioni di sangue

  1. Raccolta e separazionesangue intero fresco da un volontario sano. 17
    1. Raccogliere i primi millilitri di sangue in un tubo sottovuoto contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante e utilizzare esclusivamente questo campione per la completa emocromo (CBC) con un analizzatore ematologico automatico.
    2. Raccogliere un volume di sangue in un anticoagulante adeguato utilizzando tubi evacuati. anticoagulanti standard per esperimenti di camera di flusso sono eparina o irudina quando fibrina formazione non è parte del protocollo di studio e citrato di sodio quando è.
      Nota: eparina è stato usato come anticoagulante per tutti gli esperimenti descritti nei risultati.
      Nota: La quantità di sangue dipende dal numero di esperimenti da eseguire. Circa 1 tubo (7 ml) per 3 corsie.
    3. Posizionare i tubi su un rotatore in attesa di ricostituzione del sangue.
      Nota: Il test dovrebbe essere completato entro 3 ore di salasso.
    4. Centrifugare per 15 minuti a 250 g per preparare plasma ricco di piastrine (PRP). Non utilizzare la pausa centrifuga per evitare disturbi del pellet poco compresso.
      1. Quando più di un tubo è stato raccolto, unire il sangue in un singolo tubo di centrifugazione conica.
        Nota: centrifugazione può essere fatto più lentamente o meno lungo, a seconda della resa PRP e "contaminazione" differenziale cellulare preferito.
    5. Rimuovere e gettare la PRP e buffy coat cedendo globuli rossi concentrati con poche piastrine.
      Nota: la conta piastrinica nella frazione di globuli rossi al sacco è 13 ± 5 x 10 3 per ml (media ± SD, n = 12), in media, nelle nostre mani.
  2. Ricostituzione del sangue
    1. Scongelare gruppo sanguigno AB (Rhesus D negativo) plasma a 37 ° C per 5 min e 20 sec per 4 ml.
    2. Determinare l'ematocrito dei globuli rossi concentrati preparati in 2.1.5 utilizzando un analizzatore ematologico automatico.
    3. Determinare la concentrazione di piastrine nella banca del sangue preparato concentrato piastrinico that saranno utilizzati per ricostituire la frazione di globuli rossi sopra.
    4. Calcolare il volume di globuli rossi concentrati e concentrato piastrinico che consentiranno di ottenere il 40% di ematocrito e 250 x 10³ piastrine / ml in un campione di 1 ml.
      Nota: Altri titoli bersaglio di cellule possono essere fissate in modo arbitrario, a seconda del protocollo di studio.
    5. Trasferimento imballato globuli rossi e il plasma in una nuova provetta utilizzando una punta della pipetta tagliata e aggiungere delle piastrine concentrato fino a raggiungere un volume di campione di 1 ml.
      Nota: a seconda delle variabili studiate, la frazione di plasma deve essere uguale in tutti i campioni ricostituiti perché plasma ha una notevole influenza sul tasso di formazione di trombi. Per esempio, ripetuti di congelamento-scongelamento o plasma presi da donatori diversi o in differenti anticoagulanti può influenzare il risultato.
    6. Mescolare il sangue ricostituito con cura capovolgendo ed eseguire un CBC.
    7. Preparare un campione di controllo "vuoto", in cui viene sostituito il volume della frazione piastrinicodallo stesso volume di 0,9% (m / v) di cloruro di sodio in acqua per determinare la concentrazione di piastrine endogeni (cioè piastrine bancari non sangue) nel sangue ricostituito utilizzando un CBC.
  3. etichettatura
    1. Pipettare 1 ml ricostituito sangue in una provetta contenente 1 ml 5 mM calceina AM (5 mM concentrazione finale).
      Nota: Altri coloranti cellulari possono essere utilizzati 14.
    2. Mescolare delicatamente per inversione.
    3. Incubare per 5 min a 37 ° C prima dell'uso.

3. perfusione Assay

  1. Fuoco l'obiettivo sulle fibre di collagene aderito al fondo delle corsie. Idealmente, utilizzare le impostazioni differenziale contrasto interferenziale (DIC) a contrasto di fase o per questa strategia messa a fuoco. Seleziona 'Z corrente impostato per le regioni di piastrelle selezionate' nel software esperimento per correggere digitalmente gli Z-posizioni selezionate.
  2. Selezionare una regione di interesse (ROI) in corsia (xy) nel software esperimento del microscope che verrà registrato durante l'esperimento.
    Nota: Il ROI può essere qualsiasi superficie arbitrariamente scelto all'interno di una corsia di perfusione. Si consiglia di non analizzare formazione di trombi vicino al ingresso e l'uscita di una corsia in modo da evitare effetti collaterali del profilo portata variabile in quella regione, anche se questo è relativamente piccola. La superficie ROI deve contenere un numero significativo di piastrine o trombi per consentire il livellamento del segnale. In questo protocollo il ROI è un aggregato digitalmente cucita di tre immagini uguali dimensioni side-by-side conseguente 0,62 millimetri 2 al centro della lunga corsia 2 cm.
  3. Miscelare i campioni con cura capovolgendo e posizionare questi accanto al biochip sul palcoscenico automatizzato.
  4. Posizionare il tubo che è collegato con l'ingresso del biochip in provette contenenti i campioni ematici ricostituiti.
  5. Avviare la pompa a 50 dyne / cm 2 (o altre sollecitazioni di taglio a piacere) per quei canali legati alla Provettecontenente i campioni di sangue ricostituiti utilizzando il software della pompa.
    Nota: Altri sollecitazioni di taglio possono essere usati.
  6. Registrazione di immagini ogni 15 secondi per 5 minuti in tempo reale utilizzando il software di acquisizione e l'esperimento del microscopio.
    Nota: altre serie tempo può essere utilizzato a seconda del set-up sperimentale.
    Nota: Generalmente usiamo un ingrandimento 100X (obiettivo 10X e 10X lenti), ma superiore (o inferiore) ingrandimento può essere facilmente utilizzato come alternativa.

4. Lavare Out

  1. Lavare tutti i tubi attaccato alla presa e collegato al collettore multicanale o pompa con acqua distillata, seguito da ipoclorito di sodio (candeggina) 0,5% (v / v) ed infine 0,1 M NaOH in acqua. Scartare il tubo appuntato verso l'ingresso del biochip come rifiuti pericolosi.

Analisi 5. I dati

  1. Determinare cinetica di crescita trombo con il software di analisi delle immagini. I seguenti comandi sono specifici per ZEN2012. Aprire il plug-in di analisi dell'immagine per determinare la copertura della superficie delle piastrine.
  2. Impostare la soglia di fluorescenza nella Analizzare scheda interattiva per definire l'intensità dei pixel che si correla con un segnale positivo, vale a dire di una targhetta aderito o piastrine aderenti.
  3. Usare Creare tabelle per generare automaticamente un foglio di calcolo che conterrà le superfici separate (in micron 2) di quegli "oggetti" che contengono pixel con un segnale tra le soglie selezionate. Questa operazione viene eseguita per ogni punto.
    Nota: Una volta che le soglie di fluorescenza sono stati scelto, il software di analisi rileva automaticamente "oggetti" nel campo che soddisfano i criteri. Questi oggetti sono trombi, piccoli aggregati piastrinici o piastrine singole e coprono un numero di pixel. Ogni oggetto è elencata nel foglio di calcolo a parte.
  4. Salvare questi fogli di calcolo in formato XML e aprirli in un programma di foglio di calcoloper ulteriori calcoli.
  5. Totale aree della superficie degli oggetti selezionati per sommatoria e dividere il risultato per la superficie totale del campo di misura (micron 2). Questo produrrà la copertura della superficie relativa (%). Farlo per ogni punto di tempo.
  6. Tracciare queste coperture superficiali in funzione del tempo di perfusione e calcolare la pendenza mediante regressione lineare, ottiene il cinetica di crescita trombo di quella particolare condizione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per dimostrare la variazione intra-saggio, tre identici campioni di sangue intero sono stati ricostituiti perfusi simultaneamente su superfici di collagene rivestito (Figura 1). Ciò ha determinato un coefficiente di variazione del 8,7%. Questa statistica suggerisce accettabile intra-saggio e la variazione intralaboratorio permettendo il confronto affidabile tra i campioni relativi.

L'entrata della camera di flusso commerciale che descriviamo qui è perpendicolare alla camera di misura e questo può causare leggermente turbolenta invece di flusso laminare in quel punto. Soprattutto negli esperimenti senza anticoagulante puo causare intasamento a causa del maggior tempo di contatto tra il sangue e l'agonista immobilizzato. L'ingresso intasato può confondere la lettura a valle nella camera. Pertanto, la configurazione è stata ottimizzata parzialmente rivestimento della camera di flusso (figura 2) in uscita dalinsenature privi di agonista piastrinico, evitando in tal modo di attivazione prematura di emostasi primaria e secondaria. Rivestimento parziale di superfici adesive è inoltre utilizzato con successo da altri gruppi di ricerca nel campo 16. Inoltre, questo trucco pratico semplice è una risorsa per studiare la zona di "transizione", in cui il sangue che scorre sopra la superficie non reattivo (non rivestito) continua sopra la (patinata) porzione reattiva.

Transfusion è stato simulato ricostituzione del sangue con il componente carente. A questo scopo, il sangue intero anticoagulato da un donatore sano è stato reso trombocitopenica per centrifugazione e PC differenziali piastrine sono state aggiunte per aumentare la conta piastrinica. Una questione importante è stato quello che conta piastrinica di puntare? Nella maggior parte dei casi, trasfusioni reali non comportano normalizzazione della conta piastrinica nel paziente trombocitopenica. Piuttosto un valore al di sopra di una certa soglia si rivolge per,anche se il valore di riferimento esatto è mal definito 19. Per comprendere l'influenza di variare conta piastrinica su microfluidici camere di flusso risultati nel contesto della ricostituzione del sangue, diverse ricostruzioni sono state eseguite con concentrazioni decrescenti di piastrine (Figura 3). Come previsto, la conta piastrinica inferiore portato in meno di adesione in funzione del tempo di perfusione. Pertanto, all'interno di un dato studio, la conta piastrinica devono essere standardizzati per consentire il confronto tra le condizioni del campione 20. Il solo fatto che ci sia meno aderenza quando la conta piastrinica sono bassi non, tuttavia, non implica che il test non può essere utilizzato per misurare la deposizione delle piastrine nei campioni di trombocitopenia, perché le impostazioni di microscopia e della fotocamera possono essere adattati per aumentare la sensibilità. Infine, nella maggior parte dei casi, il campione trombocitopenica usato per la ricostituzione contiene restante piastrine autologhe che assomiglia alla situazione più esigenti trasfusione pazienti 19. E 'currtemente chiaro se e quale sia il ruolo delle piastrine autologhe è nel contesto della trasfusione di piastrine con allogenici, ma è una domanda interessante per la ricerca futura.

Dopo il prelievo del sangue da donatori volontari sani, sangue intero è spesso raffredda a e mantenuta a temperatura ambiente costante prima della preparazione del componente. Le piastrine sono comunque sensibili alle variazioni di temperatura. La Figura 4 mostra l'effetto del diminuito temperature dopo la raccolta del sangue e durante la perfusione. Trombi sono stati trovati per costruire più lentamente quando il sangue è stato raffreddato a temperatura ambiente (Figura 4A) rispetto ad un campione identico (accoppiato) mantenuta a 37 ° C durante lo studio (Figura 4B).

In circolazione, le piastrine si legano a siti di lesioni dei vasi in condizioni di elevata sforzi di taglio. Variando velocità di taglio in microfluidica camere a flusso coated con VWF / fibrinogeno ha comportato differenze di adesione piastrinica totale al punto finale (Figura 5A) e per la cinetica di crescita di trombi (Figura 5B).

Infine, per dimostrare come microfluidica camere di flusso può essere utilizzato per studiare PC utilizzato per la trasfusione, cinetica di crescita trombo in funzione di stoccaggio PC è stato studiato. Tutte le variabili in preparazione del campione e set-up sperimentale sono stati standardizzati per tutto il periodo di studio. Quindi, l'unico parametro variabile era PC memorizzazione tempo. Figura 6 indica diminuendo crescita trombo in funzione del tempo di stoccaggio dimostrare l'effetto di lesione stoccaggio piastrinica dell'emostasi in vitro.

Figura 1
Figura 1:. Variazione intra-saggio in esperimenti camera di flusso microfluidica flo Microfluidic esperimenti camera w sono stati eseguiti su collagene immobilizzato a 50 dyne / cm. identiche Tutti e tre campioni di sangue intero ricostituiti sono stati perfusi in parallelo e, allo stesso tempo. I risultati sono mostrati in gamma (baffi) per la copertura di superficie in funzione del tempo di perfusione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Canale parzialmente rivestiti (A) Le fibre di collagene visualizzati al microscopio a contrasto di fase sono stati trovati solo nella regione rivestito. (B) un'istantanea dopo 5 min di perfusione con un campione di sangue intero calceina AM etichettato ricostituito pompato a 50 dine / cm 2 è indicata. Entrambe le immagini sono state scattate con un ingrandimento 100X. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: cinetica di crescita trombo dipendono conta piastrinica nel sangue ricostituito (A) Il sangue è stato ricostituito con un piastrine banca del sangue concentrato ottenendo diverse concentrazioni di piastrine:. 245 x 10³ / ml (●), 42 x 10³ / ml (■) e 12 x 10³ / ml (▲). esperimenti camera di flusso Microfluidic con canali collagene rivestite sono state eseguite simultaneamente per tutti e tre i campioni a una sollecitazione di taglio di 50 dyne / cm. (B) Le piste calcolati mediante regressione lineare dei dati grezzi nel pannello A sono raffigurati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ontent "fo: together.within-page keep-=" 1 "> Figura 4
Figura 4:. Temperatura e camere di flusso microfluidica raccolti in vacutainer eparina Sangue intero è stato conservato per 15 minuti in un bagno d'acqua a temperatura ambiente (A) oppure a 37 ° C (B). Perfusione Microfluidic sul collagene immobilizzato ad una sollecitazione di taglio di 50 dine / cm 2 è stata eseguita. Snap scatti a punto finale (5 min di perfusione) sono raffigurati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Ruolo shear stress sulla adesione piastrinica al immobilizzato VWF / fibrinogeno (A). Quattro identici, calceina AM etichettato, ricostituito sangue interocampioni sono stati perfusi su una superficie rivestita VWF / fibrinogeno con la variabile sforzo di taglio: 4,5 dine / cm² (●), 50 dine / cm² (■), 90 dine / cm² (▲) e 225 dine / cm² (♦). Dopo 3 minuti di perfusione, un snap shot è stato preso di tutti e quattro i canali. Coperture (B) di superficie in funzione del tempo dei campioni descritti in (A) sono riportati illustrano le differenze di cinetica di crescita di trombi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. La formazione del trombo di concentrati piastrinici in funzione del tempo di conservazione Tutti gli esperimenti camera di flusso microfluidica sono stati eseguiti in condizioni standardizzate su superfici rivestite di collagene a una velocità di taglio di 50 dine / cm 2. Il sangue era reconstistituito con i campioni di piastrine dello stesso concentrato testato in duplicato su tre giorni (●), sette (■) e dieci (▲) della donazione. Coperture di superficie in funzione del tempo di perfusione sono raffigurati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

S Figura 1

Figura S1:. Impostazione hardware camera di flusso Microfluidic (A) A Vena 8 Fluoro + biochip è montato sulla fase automatizzata del microscopio ed è collegata tramite tubo flessibile ad una pompa a siringa con il collettore di dividere la funzione di pompaggio in otto canali separati. (B) il sangue ricostituito scorre attraverso il tubo monouso a destra nei canali selezionate del biochip (ingresso). Il tubo usa e getta è risolto in entrata attraverso un stainlpin usa e getta in acciaio ess fornito con l'installazione. Il flusso di sangue a (B) è da destra verso sinistra ed è raccolto in lunghi tubi flessibili. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Esperimenti camera di flusso microfluidici sono un ottimo strumento per studiare la funzione delle piastrine nel sangue che scorre e sono utilizzate per valutare l'emostasi in vitro in diversi contesti sperimentali. Nonostante scarsa standardizzazione interlaboratorio 9, dimostriamo che all'interno del nostro laboratorio la variazione sperimentale è accettabile. Questo permette di confrontare in modo affidabile campioni (appaiati) all'interno di un determinato studio. Questo è stato convalidato utilizzando il fenomeno ben documentato di lesione stoccaggio delle piastrine, che è una conseguenza dannosa di stoccaggio delle piastrine in condizioni di banca del sangue 11. Inoltre, abbiamo recentemente pubblicato l'impatto delle tre tecnologie di inattivazione dei patogeni disponibili sulla funzione piastrinica PC in camere a flusso microfluidica dopo la ricostituzione del 14,15 sangue.

Le piastrine rispondono in modo diverso quando i parametri biofisici e chimici sono molteplici 20. Pertanto, sforzo di taglio, numero di cellulare e composi cellularezione, la temperatura, il rivestimento, anticoagulante e molti altri fattori possono essere modificati all'interno di questo protocollo seconda domanda di ricerca. Questo protocollo utilizza solo disponibili in commercio strumenti hardware e software, permettendo ad altri laboratori di eseguire un test simile. Per scopi di ricerca di base questo può essere uno svantaggio soprattutto perché l'hardware disponibile è inferiore versatile di configurazioni su misura. Il saggio in sé è robusto ma riproducibilità soffre variazione biologica e temporale. Pertanto, campioni di dosaggio devono essere accoppiati per quanto possibile e studiare le dimensioni devono essere sufficientemente grande. I campioni devono anche essere accoppiato in tempo, perché il sangue ricostituito può essere memorizzato solo per un breve periodo.

Anche se camere di flusso microfluidica per gli studi sulla funzione piastrinica hanno favorito il campo di ricerca, si deve usare cautela per overinterpret la dipendenza delle piastrine sulla reologia del sangue. Innanzitutto, la forma rettangolare della camera di flusso non è fisiologico, but la migliore che abbiamo per consentire ottica focalizzazione sulla crescita trombi. In secondo luogo, i vasi sanguigni non sono in plastica e l'influenza di elasticità vaso sanguigno sulla funzione piastrinica non può pertanto essere studiato in questo protocollo. In terzo luogo, il cuore provoca flusso pulsatile, mentre le pompe siringa sono più lineare (anche se un po 'anche pulsatile). Infine, di tipo fibrillare collagene è il materiale standard utilizzato per gli studi di piastrine in condizioni di flusso, che è di origine animale. Da segnalare però, di tipo fibrillare collagene e risultati clinici per la funzione piastrinica correla bene in molti casi, come dimostrano decenni di esperienza nel settore (trasmissione della luce) aggregometria 21,22.

Ci sono molti metodi per studiare la funzione delle piastrine 23. La maggior parte di questi indirizzi uno o un paio di caratteristiche delle piastrine, mentre le piastrine mettendo a lavorare in (modelli di) emostasi. imaging in tempo reale di formazione di trombi come dimostrato qui è il più inclusivo, fino ad oggi. Questo significa che la maggior parte degli aspetti del PLALa risposta di telet al danno nave sono inclusi. Vantaggi unici sono l'inclusione del flusso sanguigno e della presenza di tutte le cellule del sangue. Il saggio è sensibile ai farmaci attualmente utilizzati per la terapia antipiastrinica 24 nonché ai cambiamenti genetici conseguente funzione piastrinica aberrant 25. Questo dimostra il suo valore come indicatore rilevante della funzione piastrinica. La completezza di questo test implica tuttavia anche che è meno analitico di quei saggi che misurano caratteristiche specifiche di risposta del piastrinica. Effetti di manipolazioni bancari sangue sul concentrati piastrinici possono dunque, a raccolti da saggi di camera di flusso, ma di interpretare ciò che li provoca, è necessaria un'ulteriore analisi. Per esempio, i nostri dati indicano che la temperatura influenza significativamente l'adesione piastrinica in camere di flusso microfluidica. Ma l'analisi dettagliata supplementare ha dimostrato che le piastrine refrigerati cambiano forma e grappolo GPIbα recettori 26.

et al. 16 hanno dimostrato l'importanza della definizione di substrato di piastrine biologia dei sistemi. Inoltre, la combinazione di diversi tassi di taglio in funzione del substrato è importante perché legame delle piastrine di immobilizzato VWF si richiedono alte velocità di taglio, mentre questo è meno importante per il legame al collagene. Pertanto, secondo la domanda di ricerca, scelte possono essere fatte su quali substrati e le portate rispettive devono essere incluse.

In conclusione, vi presentiamo un protocollo per la sperimentazione camera di flusso microfluidica per studiare la funzione delle piastrine nel contesto di banche del sangue e medicina trasfusionale. Gli sforzi di standardizzazione sono in corso 9,10,28-30 e la maggior parte di queste raccomandazioni sono compresi nel protocollo presentato. La ricostituzione del sangue è un modello pertrasfusione ma il lavoro un'ulteriore convalida devono indicare la rilevanza di risultati clinici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
  2. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
  3. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
  4. Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
  5. Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
  6. Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
  7. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. (2013).
  8. Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87, (Suppl 1), S51-S55 (2012).
  9. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
  10. Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
  11. Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
  12. Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
  13. Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
  14. Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
  15. Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. (2015).
  16. de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
  17. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  18. Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7, (Suppl 1), 17-20 (2009).
  19. Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
  20. Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
  21. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
  23. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
  24. Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
  25. Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
  26. Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. (2012).
  27. Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
  28. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  29. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
  30. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics