Name: Intra-tracheale Amministrazione Haemophilus influenzae In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Impara l'inoculazione intratracheale di Haemophilus influenzae nei topi per studiare l'infiammazione delle vie aeree. Questo metodo riproducibile permette di analizzare le risposte immunitarie polmonari durante le infezioni batteriche.

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Ringraziamo il Dr. Carson Harrod per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il signor Minghui Zeng e i dottori Mahesh Kathania e Prashant Khare per i loro contributi. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) e del Sammons Cancer Center (sovvenzione del progetto pilota) a K. Venuprasad.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Baylor Research Institute. 1. Coltura non tipizzabile Haemophilus influenzae (NTHi) e preparazione del Inoculo <ol><li> Piatto NTHi su una piastra di agar cioccolato e mantenere la piastra capovolta in un umidificata CO 2 incubatore notte a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno seguente, la cultura i batteri in brodo Brain Heart Infusion. Quindi, aggiungere 1 ml di brodo in una provetta sterile da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare a 4000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Poi, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile 1x. Ripetere questa operazione una sola volta. </li><li> Trasferire 100 ml di soluzione di ri-sospeso in 900 ml di PBS 1x e misurare l&#39;assorbanza della cultura diluito a 600 lunghezze d&#39;onda nm in uno spettrofotometro. </li><li> Determinare l&#39;unità di vitalità e formazione di colonies (CFU) del inoculo di coltura 1:10 diluizioni seriali su piastre di agar cioccolato e incubando overnight a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Sulla base della vitalità e CFU determinata dal passaggio precedente, regolare l&#39;inoculo ad una concentrazione finale di 20 x 10 6 CFU / ml. </li></ol> 2. intra-tracheale (esso) instillazione <ol><li> Iniettare il mouse per via intraperitoneale (ip) con 0,1 ml / 10 g di peso corporeo di mouse con un / ketamina + 20 mg / ml soluzione xylazina ml 150 mg. La procedura deve essere eseguita nel cappuccio con una sorgente luminosa per mantenere l&#39;animale caldo. </li><li> Pizzicare lo spazio interdigitale del mouse per verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato. </li><li> Posizionare il mouse sul dorso. Radere la zona ventrale del collo e disinfettare con clorexidina e il 70% di alcol etilico. </li><li> Sollevare la pelle della parte ventrale superiore del collo usando ratto pinze dente. Fai una piccola incisione (0,5-1,0 cm) sopra il timo con un bisturie sezionare accuratamente il muscolo per esporre la trachea. <ol><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, iniettare lentamente 0,05 ml di aria, seguito da 0,05 ml NTHi ottenuti dalla sezione 1 o soluzione salina come controllo, seguita da un&#39;altra 0,05 ml di aria. Tenere animali verticale per circa 1 min. </li></ol></li><li> Chiudere l&#39;incisione con la colla chirurgica. Mantenere il mouse lateralmente reclinata e caldo per circa 10 min. </li></ol> 3. Raccolta BALF <ol><li> Sacrificare il mouse cervicale dislocazione 24 ore dopo l&#39;infezione. </li><li> Aprire la cavità addominale del mouse con forbici anatomiche e tagliare l&#39;aorta ventrale a sanguinare. Esporre la parte ventrale del polmone. </li><li> Esporre la trachea e intubare con un catetere 20 gauge. Instillare 0,8 ml di tampone BAL (1x PBS, 0.1% di destrosio, 10 U / ml di eparina) e raccogliere il lavaggio aspirando delicatamente. Ripetere questa procedura per tre volte. </li><li> Contare il numero totale di cellule in 100 microlitri di sospensione BALF utilizzando un hemocytometro a 10 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione. </li><li> Preparare vetrini per modificare la colorazione Giemsa. Un&#39;aliquota di 100 ml di BAL nei rispettivi pozzetti della cytospin e centrifugare a 500 xg per 5 min. Asciugare le diapositive per 10 minuti e macchiare le cellule utilizzando modificato macchia Giemsa secondo protocolli del produttore. </li><li> Utilizzare le cellule rimanenti per la successiva analisi, come la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), microscopia confocale, l&#39;espressione genica e Western Blot 11-13. </li></ol> 4. istopatologia Preparazione <ol><li> Per l&#39;analisi istopatologia, infettare i topi con NTHi come descritto al punto 2.4. Dopo 24 ore di infezione, sacrificare gli animali da dislocazione cervicale. Tagliare aprire la cavità toracica con le forbici anatomiche per esporre i polmoni e la trachea come accennato prima. Quindi, inserire il catetere 20 gauge nella trachea. </li><li> Riempire il polmone con il 2% soluzione di agarosio calda preparata in formalina 4%. Una volta che ilpolmoni sono completamente gonfiati, posto ghiaccio sulla parte superiore dei polmoni a solidificare la soluzione di agarosio. </li><li> Poi, rimuovere con attenzione la spina dorsale e metterlo in una soluzione 50 ml di formalina 4% in PBS 1x fino a quando non viene elaborato per (H &amp; E) sezioni ematossilina eosina. </li></ol> 5. FACS colorazione delle cellule nel BALF <ol><li> Mettere 1 x 10 5 cellule dal fluido BALF in un piatto titolo micro V-bottom 96 pozzetti. </li><li> Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS e far girare a 4000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Macchiare le cellule con soluzione macchia cellule in 100 microlitri 1x PBS (1: 1.000 diluizione) e mantenere a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Mantenere cellule in 100 ml di FACS tampone di lavaggio [tampone di lavaggio (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide] contenente 1: 100 diluito Fc-Block per 15 min a 4 ° C. </li><li> cellule centrifugare a 4000 xg per 3 min e scartare supernatant. </li><li> cellule macchia con 100 microlitri superficie colorazione cocktail (diluizione 1: 100) in tampone di lavaggio FACS per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 300 ml di tampone di lavaggio FACS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Fix cellule in 100 ml di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule due volte con 300 microlitri di PBS 1x a 400 xg per 3 min a 4 ° C e risospendere in 300 ml di tampone di lavaggio FACS. </li><li> Effettuare controlli per la colorazione monocolore citometria a flusso perline. <ol><li> Aggiungere una goccia di perle nel piatto microlitro 96 pozzetti V-parte inferiore e lavare con 200 microlitri 1x PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di colorazione degli anticorpi a 100 l PBS 1x e perline e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Lavare perle due volte con 300 ml 1x PBS. </li></ol></li><li> Analizzare i controlli e le singole cellule macchiato mediante citometria di flusso 14. </li></ol> 6. L&#39;omogeneizzazione di tessuto polmonare per isolare l&#39;RNA <ol><li> Dopo l&#39;infezione, raccogliere un piccolo pezzo di polmone (20-40 mg) e conservarlo in RNA stabilizzante reattivo a 4 ° C durante la notte. Poi, conservare a -80 ° C fino alla fase successiva. </li><li> Lavare i tessuti del polmone a freddo 1x PBS per sbarazzarsi del reagente stabilizzazione RNA. </li><li> Posizionare il tessuto in un tampone di lisi contenente 1,5 ml tubo da centrifuga (1 ml di buffer di lisi + 10 ml β-mercaptoetanolo). </li><li> Tritare il tessuto in piccoli pezzi con le forbici a punta ed omogeneizzare con un cordless pestello pellet motore per 20-40 secondi. </li><li> Mantenere il lisato in ghiaccio per 5 minuti e procedere con passo 7.1. </li></ol> 7. Isolamento RNA dal polmone <ol><li> Centrifugare il lisato a 18.000 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante pipettando e trasferire con cura in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1 volume di etanolo 70% al lisato. Mescolare immediatamente pipettando e aspettare 2-4 minuti. </li><li> Trasferire fino a 700 ml di lisato ad una colonna di spin localein un tubo di raccolta 2 ml. </li><li> Centrifugare a 9.600 xg per 15 sec e scartare il flow-through. </li><li> Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 80 microlitri DNasi direttamente alla membrana Spin Column e mantenere a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e far girare a 9.600 xg per 2 minuti. Gettare il flow-through. </li><li> Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 30-50 acqua priva di RNasi microlitri direttamente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. RNA Conservare a -80 ° C. </li><li> Eseguire l&#39;analisi RNA-Seq 14. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o in...

L&#39;infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute 1. Tuttavia, l&#39;infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche 2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare 3. L&#39;Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superiori ed inferiori polmonari croniche 4,5. E &#39;la specie dominante isolati dalle vie aeree inferiori di bambini e adulti con cronica ostruttiva 4,6,7 malattia polmonare. La risposta infiammatoria dopo l&#39;infezione NTHi è caratterizzata dalla sovraregolazione di citochine proinfiammatorie (come TNF e IL-1β), ed è mediata by mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) e fattore nucleare-kB (NF-kB) attraverso i recettori Toll-like (TLR) 8. Modelli murini sono strumenti molto utili per analizzare la patologia sottostante del polmone malattia infiammatoria a causa della disponibilità di diverse linee gene-carenti. Diversi metodi sono stati utilizzati per inoculare batteri vivi attenuati / e prodotti batterici, tra intranasale instillazione e aerosolized 9,10 inalazione. Qui, dimostriamo intra-tracheale instillazione. Sebbene utilizzato meno frequentemente, questo approccio è più efficace e altamente riproducibili a causa della consegna diretta dell&#39;inoculo al tratto respiratorio inferiore.

<table><tbody><tr><td>Piastra agar per cioccolato</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio anidro</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Hospira, Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione rapida Deft</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa 20/26G&nbsp;</td><td>BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml siringa</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Catetere 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>Forbici da dissezione, diritte, lunghe 10 cm</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iride, seghettate, lunghe 10 cm</td><td>kentscientific</td> Pinzetta <td>per INS650915</td><td></td></tr><tr><td>#5 in acciaio inossidabile, lunga 11 cm</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 ml in polistirene a fondo tondo</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Motore pestile a pellet (Omogeneizzatore tissutale)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 piastre per microtitolazione a pozzetti Fondo V</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Diluizione di lavoro 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Diluizione di lavoro 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi RBC (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione per cellule morte aqua riparabile Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>tubi Facs tubo fondo tondo polistirene</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-tracheale amministrazione<em&gt; haemophilus influenzae</em&gt; in modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l&#39;analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l&#39;isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l&#39;inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.

Instillazione intra-tracheale provocato un marcato aumento del numero di leucociti nel BALF (Figura 1A, pannello di sinistra) di installazione con soluzione salina. L&#39;analisi conteggio differenziale dei leucociti mostrato chiaramente migliore infiltrazione dei neutrofili (Figura 1, pannello di destra). L&#39;analisi FACS delle cellule nel BALF confermato ulteriormente l&#39;aumento del numero di neutrofili (Figura 1B). L&#39;analisi ...

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le risposte immunitarie nel polmone durante un'infezione batterica. Questo argomento può contribuire a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo dell'infiammazione polmonare, come ad esempio quali sono i principali meccanismi regolatori e i geni che inibiscono o promuovono l'infiammazione polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto efficiente e altamente riproducibile grazie alla somministrazione diretta dell'inoculo batterico nelle vie respiratorie inferiori.Per iniziare, seminare il NTHi su una piastra di agar al cioccolato. Incubare la piastra capovolta per tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, coltivare i batteri in un brodo di infusione cerebrale-cardiaca.Quindi, in un tubo da microcentrifuga, aggiungere un millilitro di terreno. Centrifugare il campione a 4.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di PBS.Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta. Successivamente, diluire 100 microlitri di soluzione ri-sospesa in 900 microlitri di PBS e mi

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Venuprasad, K., et al. Somministrazione intratracheale di Haemophilus influenzae in modelli murini per studiare l'infiammazione delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la somministrazione intratracheale di un inoculo batterico patogeno polmonare in un topo anestetizzato per modellare l'infezione del tratto respiratorio inferiore.

Esecuzione della somministrazione batterica intratracheale in un modello murino

Fonte: Venuprasad, K., et al. Somministrazione intratracheale di Haemophilus influenzae in modelli murini per studiare l'infiammazione delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la raccolta e l'elaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare da un topo eutanasia infetto da Haemophilus influenzae non tipizzabile per l'analisi a valle.

Raccolta di liquido di lavaggio broncoalveolare da un modello murino infetto da Haemophilus influenzae non tipizzabile

Fonte: Lenhard, A. et al. Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno dopo la co-infezione virale riproduce la malattia aggravata dall'età. J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un modello di co-infezione topina in cui il virus influenzale innesca la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno. Descrive le fasi coinvolte nella colonizzazione batterica, nelle infezioni virali e nella progressione della malattia.

Un modello murino per studiare la transizione patogena di Streptococcus pneumoniae dopo la co-infezione virale

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.

Intubazione endotracheale in Mouse<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia diretta usando un otoscopio

L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

C'è una generale mancanza di conoscenza su come funzionano i vaccini. Qui proponiamo l'uso combinato della genetica inversa e dei topi chimerici del midollo osseo per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie precoci dell'ospite ai vaccini, con particolare attenzione alle cellule dendritiche e all'immunità delle cellule T.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Questo protocollo fornisce istruzioni per la somministrazione intranasale di IAV e l'analisi a valle del danno polmonare di topo e delle modifiche trascrizionali associate ai tipi di cellule polmonari.

Modellazione della riparazione alveolare polmonare displastica e funzionale dopo l'infezione influenzale

Impara l'inoculazione intratracheale di Haemophilus influenzae nei topi per studiare l'infiammazione delle vie aeree. Questo metodo riproducibile permette di analizzare le risposte immunitarie polmonari durante le infezioni batteriche.

Intra-tracheale Amministrazione

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