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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

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Abstract

Una questione fondamentale nella biologia delle cellule è come dimensioni delle celle e organelli sono regolati. È stato riconosciuto che la dimensione del nucleo generalmente diminuisce con la dimensione della cella, in particolare durante l'embriogenesi quando si verificano drammatiche riduzioni sia cella e dimensioni nucleari. Meccanismi di regolazione dimensione nucleare sono in gran parte sconosciuti e possono essere rilevanti per il cancro in cui le dimensioni nucleare alterato è un parametro diagnostico e prognostico chiave. In vivo approcci per identificare i regolatori di dimensioni nucleari sono complicate dalla natura essenziale e complessa della funzione nucleare. L'approccio in vitro descritto qui per studiare il controllo dimensione nucleare sfrutta le normali riduzioni di dimensioni nucleare che si verificano durante lo sviluppo laevis Xenopus. Innanzitutto, nuclei sono assemblati in X. laevis estratto uovo. Poi, questi nuclei sono isolati e risospese nel citoplasma da embrioni in fase avanzata. Dopo un 30 - periodo di incubazione di 90 minuti, la superficie nuclearediminuisce di 20 - 60%, fornendo un test utile per identificare i componenti citoplasmatici presenti negli embrioni fase avanzata che contribuiscono al ridimensionamento dimensione nucleare di sviluppo. Un importante vantaggio di questo approccio è la relativa facilità con cui gli estratti uova e embrioni possono essere manipolati biochimicamente, consentendo l'identificazione di nuove proteine ​​e attività che regolano dimensione nucleare. Come con qualsiasi approccio in vitro, convalida dei risultati in un sistema in vivo è importante, e microiniezione di X. embrioni laevis è particolarmente adatto per questi studi.

Introduction

Le dimensioni di organelli cellulari tipicamente scala con la dimensione della cella, e questo è stato forse meglio documentati per la disincrostazione di dimensioni nucleare con dimensione delle celle 1-10. Questo è particolarmente vero durante l'embriogenesi e la differenziazione cellulare, quando drammatiche riduzioni sia cellulare e dimensione nucleare sono spesso osservate 11,12. Inoltre, la dimensione nucleare alterato è un parametro fondamentale nella diagnosi del cancro e la prognosi 13-17. I meccanismi che contribuiscono alla regolazione di formato nucleare sono in gran parte sconosciuti, in parte a causa della complessità e la natura essenziale della struttura nucleare e funzione. Il metodo descritto qui è stato sviluppato come un test in vitro per il ridimensionamento della dimensione nucleare, che è suscettibile di manipolazione biochimica e delucidazione dei meccanismi di regolazione dimensione nucleare.

Xenopus laevis estratto uovo è un sistema consolidato di ricapitolare e lo studio dei processi cellulari complessi in un in vitro 18-22. Uno dei principali vantaggi del sistema estratto è che X. laevis estratti uova rappresentano un citoplasma quasi non diluito cui composizione può essere facilmente modificato, ad esempio con l'aggiunta di proteine ​​ricombinanti o immunodeplezione. Inoltre, si è in grado di manipolare processi essenziali utilizzando trattamenti che altrimenti potrebbero essere letali in un contesto in vivo. Le modifiche della procedura di estratto di uovo permettono l'isolamento di estratti di X. laevis embrioni piuttosto che uova, e questi estratti embrionali sono ugualmente suscettibili di manipolazione biochimica 23. Durante X. laevis sviluppo, l'embrione fecondato singola cellula (~ 1 mm di diametro) subisce una serie di dodici divisioni cellulari rapidi (punti 1 - 8) per generare diverse migliaia 50 μm di diametro e le cellule più piccole, raggiungendo una fase di sviluppo definito il passaggio midblastula (MBT) o la fase 24-26 agosto. La MBT è caratterizzata dalla comparsa di trascrizione zigotico, la migrazione delle cellule, divisioni cellulari asincrone, l'acquisizione delle fasi gap, e la creazione di formati di stato stazionario nucleari piuttosto che l'espansione nucleare continua come nell'embrione pre-MBT. Dalla fase 4 per gastrulation (stadi 10.5 - 12), il volume dei singoli nuclei diminuisce di più di 10 volte 11.

Qui, l'obiettivo è quello di individuare i meccanismi responsabili di queste riduzioni delle dimensioni nucleare durante la progressione evolutiva. L'approccio è quello di assemblare prima nuclei a X. laevis estratto uovo e isolare i nuclei dall'uovo citoplasma / estratto. Questi nuclei sono poi risospese nel citoplasma da embrioni fase avanzata gastrula. Dopo un periodo di incubazione, i nuclei di estratto di uova diventano più piccoli in estratto fase avanzata embrionale. Abbiamo ragionato che questo woulD un test utile per identificare i componenti citoplasmatici presenti negli embrioni fase avanzata che contribuiscono al ridimensionamento dimensione nucleare di sviluppo. Usando questo test, insieme con la convalida in vivo, abbiamo dimostrato che la proteina chinasi C (PKC) contribuisce alla riduzione di sviluppo in termini di dimensioni nucleari a X. laevis 23.

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Protocol

Tutte le procedure di Xenopus e gli studi sono stati condotti in conformità alla guida NRC per la cura e l'uso di animali da laboratorio 8 ° edizione. I protocolli sono stati approvati dalla University of Wyoming Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (Assurance # A-3216-01).

1. Preparazione di X. Estratto laevis Egg (adattato da 27,28)

  1. Prime X. femminile laevis rane un minimo di tre giorni e un massimo di due settimane prima della raccolta delle uova con una singola iniezione 100 UI di gravidanza gonadotropina del siero di cavalla (PMSG).
  2. Un giorno prima dell'esperimento, iniettare rane vaccinati con 800 UI di gonadotropina corionica umana (HCG) e posto a 16 ° C in 1 L per rana di 1 / 3x dita modificati di Marc (MMR). Vedi Tabella 1 per tutte le composizioni di buffer.
    Nota: alcuni rane non deporre le uova o le uova saranno di scarsa qualità. Tipicamente 2 - 3 rane vengono iniettati per garantire almeno una rana getterà sufficiennumeri t di uova di buona qualità. La rana media getterà abbastanza uova per la produzione di almeno 1 ml di estratto uovo.
  3. Preparare 1 L 1 / 3x MMR con acqua deionizzata fredda distillata (DDH 2 O), 500 ml di tampone B, 1 L tampone C, 500 ml di buffer di D, e 100 ml di tampone E.
  4. Trasferimento dalle uova ad un piatto di vetro di cristallizzazione (150 x 75 mm). Usando una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata, coltivare fuori gonfi attivato uova bianche o uova lisati. mantenere solo uova con distinte e uguali pali animali scuro e poli vegetali bianchi.
  5. Preparare 13 x 51 mm provette per centrifuga con 1 ml di tampone E integrato con 355 mM citocalasina D aggiunto appena prima di utilizzare nella fase 1.7.
  6. Dejelly e lavare le uova.
    1. Lavare le uova brevemente con freddo 1 / 3x MMR in un bicchiere di dimensioni adeguate, modificare il buffer 3 - 4 volte.
    2. Rimuovere i cappotti di gelatina delle uova da incubazione con tampone B. Questo vi porterà ovunque 3-10 min. Come i cappotti gelatina nuvoloso vengono rilasciati dall'uovos, modificare il buffer.
      Nota: Dejellying è completa quando le uova appaiono accuratamente imballati in un angolo del piatto quando inclinati e poli vegetali sono orientate verso il basso. Le uova sono molto più fragili dopo dejellying, in modo da non incubare le uova con tampone B per più di lavaggi necessari e successive devono essere eseguite con molta attenzione.
    3. Lavare le uova brevemente con 3 - 4 cambi di tampone C.
    4. Lavare le uova brevemente con 2 cambi di tampone D.
    5. Lavare le uova brevemente con 2 cambi di tampone E.
  7. Riempire provette da centrifuga con le uova utilizzando una vasta pipetta di vetro diametro o contagocce di plastica. Aspirare il tampone in eccesso. Per imballare le uova e rimuovere quanto più buffer come possibile, centrifugare a rotore secchio oscillante a 212 xg per 60 sec e poi a 478 xg per 30 sec. Aspirare il tampone in eccesso.
    Nota: È importante rimuovere il più eccesso di tampone possibile in questa fase per garantire l'estratto dell'uovo è minimamente diluito.
  8. In una oscillazione rotore secchio, ultracentrifuga sotto vuoto per 15 min a 12.000 xg e 4 ° C per schiacciare le uova aperto e separato in diversi strati, con il citoplasma essendo lo strato ambrata nel mezzo. Rimuovere provette da centrifuga e posto immediatamente in ghiaccio.
  9. Raccogliere l'estratto.
    1. Utilizzando un ago calibro 18 e la siringa, forare il tubo da centrifuga appena sopra lo strato pigmentato scuro sul fondo del tubo e rimuovere il ambrato livello citoplasmatico centrale. Non raccoglie dello strato lipidico superiore. Raccogliere il citoplasma in un tubo di dimensioni adeguate.
      Nota: In generale, 1 rana produce almeno 1 ml di estratto.
    2. citoplasma Supplement con 1 / 1.000 il volume di 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 il volume di LPC magazzino, e 1/50 del volume di 50x mix energetico. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Non eccessivamente pipettare l'estratto.
    3. Mantenere l'estratto su ghiaccio e utilizzare entro 3 ore di preparazione per i migliori risultati.
_title "> 2. Preparazione di Demembranated X. laevis Sperma (adattato da 29)

Nota: I volumi procedura qui presentati sono per un massimo di 8 testicoli.

  1. Rimuovere 0,05% benzocaina (10% benzocaina magazzino preparata in etanolo e diluita al 0,05% in acqua serbatoio rana) da 4 ° C e portarlo a temperatura ambiente. Anestetizzare e sacrificare maschio X. laevis rane in soluzione benzocaina a temperatura ambiente per 20 - 30 min. Assicurare morte per assenza di battito cardiaco esaminando e sentire il torace, dalla mancanza di risposta alla stimolazione meccanica, e / o per decapitazione.
  2. Effettuare una incisione a forma di U lungo l'addome. Rimuovere la massa tubulated di corpi grassi gialli. Nella parte superiore dei reni, individuare i testicoli, che sono masse rosa pallido circa 1 cm di lunghezza 29 di forma ovale. Accise L'testicoli e li rotolare su carta assorbente per rimuovere il sangue e altri tessuti.
  3. Lavare testicoli in Buffer T. Utilizzare un pestello stretto montato tritare testicoli con 1 ml di tamponeT in una provetta da 1,5 ml fino omogeneo (10 colpi o più). Centrifuga 5 - 10 sec in un mini centrifuga e raccogliere il surnatante, rimozione di grandi pezzi di tessuto. Ripetere la centrifugazione ancora una volta e raccogliere il surnatante.
  4. Trasferire la soluzione sperma contenente un tubo di plastica da 15 ml. Aumentare il volume per un totale di 2 ml con tampone T. Centrifugare a 1.411 xg per 10 min a 16 ° C per far sedimentare lo sperma.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di buffer di T. Centrifugare a 1.411 xg per 10 min a 16 ° C. Ripetere questa operazione una o due volte come necessario per pulire il pellet di globuli rossi e somatiche.
  6. Risospendere il pellet in 100 microlitri tampone T e 300 microlitri tampone S. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    Nota: Buffer S contiene lisolecitina, che è responsabile per demembranation.
  7. Aggiungere tre volumi di tampone R (preparato fresco prima dell'uso). Capovolgere tubo esattamente una volta. Centrifugare a 1.411 xg per 15 min a 16 &# 176; C.
  8. Risospendere il pellet in 400 microlitri di buffer R e quindi aggiungere un ulteriore 2 ml di tampone R. Centrifugare a 1.411 xg per 15 minuti a 16 ° C.
  9. Risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer T.
  10. Diluire 1 ml demembranated nuclei degli spermatozoi con 9 ml Tampone T. Applicare questa diluizione ad un emocitometro. Contare il numero di sottili nuclei degli spermatozoi a forma di S in un unico grande 4 x 4 griglia e moltiplicare quel numero per 100 per ottenere la concentrazione dello stock in nuclei degli spermatozoi per ml.
  11. Diluire il brodo a 100.000 nuclei degli spermatozoi per ml con il tampone T, risultando in un magazzino 200x. Preparare 3 - 5 aliquote microlitri. Flash congelamento in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

3. Montaggio nucleare

  1. Supplemento 100 ml di estratto di uovo con 1,5 ml 35,5 mM cicloesimide (concentrazione finale ~ 0.5 mm), 6 ml 20x calcio di soluzione (concentrazione finale ~ 0,6 mm), e 0,7 ml 200x spermatozoi (concentrazione finale ~ 700sperma nuclei / ml). Scalare il volume di reazione verso l'alto o verso il basso, se necessario. Invertire o picchiettare delicatamente per mescolare.
    Nota: estratto pedalato da metafase in interfase fornisce una piattaforma più solida e affidabile per il montaggio nucleare.
  2. Incubare a bagnomaria a 16 - 20 ° C per 90 min. Mescolare picchiettando delicatamente ogni 15 min per assicurare nuclei rimangono sospese nell'estratto.
  3. Monitorare i progressi di assemblaggio nucleare a 45 min preparando una zucca come segue.
    1. Dispensare 2 ml di estratto su un vetrino e aggiungere 2 ml nucleo correzione.
    2. Overlay con un coprioggetto 22 millimetri 2. Immagine su un microscopio a epifluorescenza con acqua, olio o aria 20 - obiettivi 100X e un filtro DAPI.
      Nota: I nuclei possono essere visualizzati da immagini in campo chiaro, ma sono molto più facili da visualizzare con la fluorescenza.
    3. Utilizzare nuclei immediatamente o aliquote Flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
      Nota: L'aggiunta di 4% glicerolo al pr nucleiIOR al gelo può aiutare a mantenere la loro integrità. nuclei congelati sono generalmente ancora vitale e capace di importazione nucleare, tuttavia il processo di congelamento può portare a nuclei fragili interrotte o più strutturalmente. Nuclei fino ad un anno dopo congelamento può essere utilizzato.

4. Preparazione di X. laevis Embryo Extract

  1. Indurre X. femminile laevis rane per deporre le uova, come descritto in 1.1 e 1.2.
  2. Isolare testicoli da X. maschio laevis rane come descritto al punto 2.2. Immergere testicoli nei media L15 integrato con 50 UI / ml di penicillina e la streptomicina in un bicchiere di 35 x 10 mm Petri. Conservare a 4 ° C per un massimo di due settimane.
  3. Raccogliere e fertilizzare le uova.
    1. Raccogliere le uova appena deposte tenendo rane su un piatto di vetro riutilizzabile Petri e promuovere la deposizione delle uova, applicando una leggera pressione alla parte bassa della schiena vicino alla cloaca. Comprimendo la rana troppo duro può causare lesioni, portando ad un addome gonfio e requiring l'eutanasia 29.
    2. Prop il piatto con un angolo di circa 45 °, consentono di raccogliere le uova sul bordo del piatto, rimuovere tutti tampone in eccesso, e aggiungere abbastanza 1 / 3x MMR per coprire a malapena le uova. Fertilizzare uova entro 15 minuti dal prelievo.
    3. Utilizzare un pestello strettamente montato a macerare ed omogeneizzare 1/4 di testicoli in una provetta da 1,5 ml con 500 ml di sale alto modificati di Barth Saline (sale alto MBS). Aggiungere testicoli macerati alle uova e consentire la fecondazione venga eseguita a temperatura ambiente per 15 - 20 min, poi inondare uova con 1 / 3x MMR.
      Nota: L'efficacia dei testicoli diminuisce con il tempo di conservazione, quindi più testicoli tessuto può essere necessaria per la fecondazione di successo quando si utilizza testicoli che sono stati conservati per più di una settimana.
    4. Conferma fecondazione controllando contrazione del polo animale pigmentata scura e dalla rotazione degli embrioni con i loro poli animali rivolto verso l'alto, di solito circa 20 - 30 min dopo l'aggiunta teste schiacciatoS. Aspettatevi la prima scissione delle cellule che si verifichi entro 90 min.
    5. Utilizzando una vasta pipetta di vetro foro rimuovere diligentemente morti (bianco e gonfio o la distribuzione non uniforme del tuorlo e pigmento), lisato, o uova non fecondate (cioè non spaccati), in quanto saranno rapidamente indurre la morte in embrioni limitrofi.
    6. Ovunque 1-2,5 ore post-fertilizzazione, dejelly embrioni in 2 - 3% cisteina sciolti in 1/3 x MMR e portati a pH 7.9 con 10 N KOH. Eseguire due modifiche del buffer che sono ogni 3 - 4 min. Lavare accuratamente gli embrioni con 6 - 10 brevi cambiamenti di 1 / 3x MMR per rimuovere tutte le tracce di cisteina.
      Nota: gli embrioni Dejellied hanno una membrana vitellina e non sono così fragili come uova dejellied.
  4. Utilizzando una vasta pipetta di vetro foro, trasferire fecondati (cioè spaccati,) gli embrioni sani per una capsula di Petri contenente fresco 1 / 3x MMR e consentire loro di sviluppare allo stadio desiderato a temperatura ambiente o, se lo sviluppo più lento è preferito, 16 ° C. Continuare a rimuovere morti o menteembrioni sed indicato dalla mancanza di prima divisione o l'aspetto gonfio bianco.
  5. Verificare la fase degli embrioni controllando per quasi completa chiusura della blastoporo e confrontando ai disegni di embrioni in scena disponibili in materiali di riferimento 24.
    Nota: embrioni coltivati ​​a 16 ° C raggiungerà fase 11,5-12 in circa 12 ore.
  6. Incubare fase 11.5 - 12 embrioni in fresco 1 / 3x MMR integrato con 0,5 mm cycloheximide per 1 ora a temperatura ambiente, per arrestare gli embrioni a fine interfase.
  7. Trasferimento con ampio vetro diametro o pipetta di plastica da un minimo di 15 (preferibilmente di 30 o più) embrioni interfase-arrestato in una provetta.
    Nota: 15 embrioni sono sufficienti per produrre circa 20 ml di estratto. Scalare in base alle esigenze.
  8. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi uovo (ELB) integrato con 1 ml di LPC magazzino. Capovolgere lavare embrioni, permettere che gli embrioni cadono sul fondo della provetta, e rimuovere il tampone. Ripetere questa fase di lavaggio altre due volte. </ Li>
  9. embrioni risospendere in 500 ml di ELB più 0,5 l di LPC magazzino, 5 ml di 19,7 mM cicloesimide, e 5 ml di 35,5 mM citocalasina D (per inibire polimerizzazione). Centrifugare a 200 xg per 1 minuto in una microcentrifuga da tavolo.
  10. Rimuovere il tampone in eccesso e utilizzare un pestello per schiacciare a fondo gli embrioni. Centrifugare in un rotore secchio oscillante per 10 min a 10.000 xg e 16 ° C.
  11. Perforare lo strato lipidico dall'alto con una punta di pipetta 200 microlitri. Con un pulito 200 microlitri punta della pipetta, rimuovere lo strato ambrato citoplasmatica mezzo di un tubo di dimensioni adeguate.
  12. Supplemento estratto embrionale con 1/50 del volume di 50x mix energetico (per fornire un sistema di rigenerazione ATP), 1/100 del volume di 35,5 mM Cicloesimide, 1/500 del volume di 19,7 mM citocalasina D, e 1 / 1.000 il volume di LPC magazzino.
  13. Preparare una zucca come descritto al punto 3.3 di visualizzare nuclei embrionali endogeni nell'estratto.
    Nota: estratto di embrioni possono essere congelati con i nuclei endogeni a questo punto. Aliquotare per ridurre gelo / disgelo e conservare a -80 ° C.
  14. Per rimuovere i nuclei dalla estratto embrionale, diluire l'estratto con un volume uguale di ELB contenente 1/50 del volume di 50x mix energetico, 1/100 del volume di 35,5 mM Cicloesimide, 1/500 del volume di 19,7 mM citocalasina D, e 1/1000 il volume di LPC magazzino. Centrifugare in un rotore secchio oscillante a 17.000 xg per 15 min a 16 ° C.
  15. Raccogliere il surnatante facendo attenzione ad evitare qualsiasi lipidi rimanendo in alto. Non disturbare i nuclei pellet sul fondo della provetta. Preparare una zucca come descritto in 3.3 per garantire che la maggior parte dei nuclei sono stati rimossi. Utilizzare l'estratto fresco o aliquotare e conservare a -80 ° C.
  16. Per riscaldare inattivare estratto embrionale per esperimenti di controllo, di calore 30 - 100 microlitri aliquote di estratto a 56 ° C per 30 minuti utilizzando un termociclatore. Lasciare che il calore estratto inattivato per tornare a temperatura ambiente prima dell'uso.
_title "> 5. Nucleare Shrinking Assay e immunofluorescenza

  1. Isolare nuclei assemblati in estratto uovo diluendo 25 - 150 ml di nuclei premontati in 1 ml ELB in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 1600 xg per 3 min a 4 ° C in una microcentrifuga da tavolo. Rimuovere tampone, facendo attenzione a non disturbare il pellet fragile nuclei sul fondo della provetta.
  2. Risospendere nuclei in un volume di estratto embrionale pari al volume originale dell'estratto dell'uovo usato in 5.1. Utilizzare ELB o di calore estratto inattivato per le reazioni di controllo, a seconda dei casi.
  3. Battere delicatamente il tubo per rompere il pellet e risospendere i nuclei. Incubare a temperatura ambiente per 90 min, picchiettando delicatamente la provetta per miscelare frequenza di 15 - 30 min. Nota: La maggior parte del restringimento nucleare si verifica entro i primi 30 min.
  4. Monitorare i progressi di restringimento nucleare preparando una zucca.
    1. Dispensare 2 ml di estratto su un vetrino e aggiungere 2 ml nucleo correzione.
    2. Sovrapposizione con un 22 millimetri 2
  5. Toccare il tubo per sospendere di nuovo i nuclei appena prima di aggiungere 500 ml di fissativo costituito da ELB, 15% glicerolo, e del 2,6% paraformaldeide. Invertire immediatamente, e posizionare il tubo su un rotatore per 15 min a temperatura ambiente.
  6. Preparare spin down tubi per l'allestimento di 15 ml provette di vetro con fondo arrotondato con inserti in plastica fondo tondo (progettazione e schemi disponibili su richiesta). Aggiungere 5 ml di tampone cuscino nucleare. Eliminare un vetrino circolare 12 millimetri nel tubo, essendo sicuro che adagiata sulla parte superiore del inserto in plastica.
  7. strato delicatamente la soluzione contenente nuclei fissi sulla parte superiore del cuscino nucleare con una punta di pipetta ampio tunnel. Centrifugare in un rotore secchio oscillante per 15 min a 1000 xg e 16 ° C.
  8. Utilizzare un aspiratore per rimuovere tutto il tampone ed estrarre l'inserto in plastica alla sommità del tubo. Rimuovere il vetrino con un paio di pinze sottili, facendo attenzione a notare il lato del coperchioscivolare su cui i nuclei sono stati filate. Post-fix in metanolo freddo (conservato a -20 ° C) per 5 minuti a temperatura ambiente.
  9. Trasferire il lato coprioggetto nucleo su sopra un foglio di pellicola di plastica di paraffina fodera un grande piatto di plastica Petri. Posizionare salviettine monouso umide lungo il lato del piatto per prevenire la disidratazione.
  10. Reidratare nuclei sul vetrino con 500 ml di PBS-NP40 (1x PBS più 0,1% NP40) e aspirare dopo 5 - 10 sec.
  11. strato con cautela 75 ml di PBS-3% di sieroalbumina bovina (BSA) sul vetrino. Consentire al blocco 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
  12. Rimuovere soluzione bloccante, e incubare con l'anticorpo primario (ad esempio, mAb414 contro il complesso poro nucleare, 1: 1000) diluiti in PBS-BSA 3% per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Lavare con cinque cambiamenti immediati di PBS-NP40.
  13. Incubare con anticorpo secondario diluito in PBS-BSA 3% per 1 ora a RT. Lavare con cinque cambiamenti immediati di PBS-NP40.
  14. covarecon 10 ug / ml Hoechst diluito in PBS-BSA 3% per 5 minuti a RT. Lavare cinque volte con PBS-NP40. Rimuovere tutti i buffer di eccesso.
  15. Montare il vetrino su un vetrino con 5 ml antifade mezzo di montaggio. Sigillare con smalto trasparente. Immagine immediatamente utilizzando un microscopio a epifluorescenza con 20 - 100x obiettivi o conservare a 4 ° C per l'imaging in seguito.
    Nota: Eseguire la quantificazione come descritto in precedenza 23.

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Representative Results

Assemblea dei nuclei a Egg estratto

I primi passi di questo protocollo sono da preparare X. laevis estratto di uovo (protocollo 1) e nuclei degli spermatozoi demembranated (protocollo 2). Questi reagenti vengono poi utilizzati per assemblare nuclei de novo (protocollo 3). La Figura 1 mostra alcuni dati rappresentativi. Aggiunta di calcio spinge dell'estratto dell'uovo meiotically arrestato in interfase, e la cicloesimide mantiene l'estratto arrestato in interfase. In 30 - 45 minuti dopo l'inizio della reazione, le sottili inizialmente nuclei degli spermatozoi a forma di S dovrebbero cominciare ad addensarsi in masse cromatina a forma di lumaca. formazione di successo di una busta nucleare intatto può essere valutata l'importazione e il mantenimento di un carico di importazione fluorescente, come GST-GFP-NLS (dati non riportati), o da parte di RIM colorazione per il complesso del poro nucleare utilizzando mAb414 che riconosce FG-repeat containing nucleoporins (Figura 1A). Dopo che si verifica assemblaggio nucleare, forma nucleare dovrebbe diventare più arrotondate e il volume nucleare dovrebbe aumentare l'involucro nucleare espande e proteine ​​nucleari sono importati (Figura 1B-C). La mancata osservanza di formazione di una busta nucleare intatto o la crescita nucleare indica una scarsa estratto uovo di qualità. In questo caso, è meglio ricominciare con una nuova partita di uova.

Rimozione di endogena Nuclei da Embryo Extract
Il passo successivo è quello di preparare una fase embrionale estratto (protocollo 4). Dopo preparazione iniziale dell'estratto e prima della rimozione dei nuclei, è meglio preparare una zucca Hoechst macchiato di una piccola aliquota di estratto. Visualizzazione di molti piccoli nuclei embrionali è una buona indicazione di successo nella preparazione dell'estratto (Figura 2A). Come endogeni nuclei embrionali possono interferire con l'analisi de valles, è anche importante controllare un'aliquota dell'estratto dopo rimozione nuclei per diluizione e centrifugazione. Rispetto alla prima squash, pochissimi nuclei devono essere lasciati nell'estratto (Figura 2B). Se ci sono ancora molti nuclei presenti, è necessario un secondo turno di centrifugazione.

Nucleare Assay Shrinking
La figura 3 mostra i risultati rappresentativi per il test nucleare contrazione (Protocollo 5). Nuclei estratto Uovo risospese in estratto fase avanzata embrionale diventano più piccoli nel corso del tempo (Figura 3B). Un buon controllo negativo per il saggio è incubare nuclei con estratto embrionale che è stato inattivato al calore (Figura 3A). Come nuclei riescono a ridursi in estratto inattivato con il calore, questo fornisce una certa sicurezza che osserva nucleare contrazione con estratto di embrione non trattato non è una conseguenza di effetti osmotici. L'entità della dimensione nucleareriduzioni osservate varia a seconda della particolare lotto di uovo nuclei estratto nonché la qualità del estratto embrionale. Nella nostra esperienza, restringimento nucleare è sempre osservato (ad esempio, in più di 40 differenti estratti embrionali), tuttavia è importante ripetere questi esperimenti più volte con diversi nuclei ed estratti di affrontare la variabilità intrinseca del dosaggio. Figura 4 mostra uno schema dell'intero protocollo.

Figura 1
Figura 1. Assemblea nucleare Andamento temporale in X. laevis Egg estratto. I nuclei sono stati assemblati de novo in X. laevis estratto uovo come descritto nel protocollo 3. Aliquote dalla stessa reazione sono state fissate e visualizzate mediante immunofluorescenza utilizzando un anticorpo contro il complesso del poro nucleare (NPC) (mAb414) a: > A) 30 min, B) 60 min, e C) 90 minuti dopo l'inizio del montaggio nucleare. Il protocollo di immunofluorescenza è descritto nel protocollo 5. La barra della scala è di 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Rimozione di nuclei da X. laevis Embryo Extract. X. laevis estratto embrionale è stato preparato dalla fase 11.5 - 12 embrioni come descritto nel protocollo 4. Una piccola aliquota di estratto è stato fissate e colorate con Hoechst: A) prima della rimozione dei nuclei, e B) dopo la rimozione dei nuclei per centrifugazione. La barra della scala è di 25 micron.om / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Rappresentante dei dati dal restringimento del test nucleare. I nuclei sono stati assemblati de novo in X. estratto laevis uovo integrato con ricombinante GFP-LB3 (per visualizzare la lamina nucleare). Come descritto nel protocollo 5, uovo nuclei estratto sono stati isolati e risospese in fase di 11,5-12 estratto embrionale da cui erano stati rimossi nuclei embrionali endogeni. immagini dal vivo time-lapse è stata eseguita a intervalli di 30 secondi per 90 min. Pannelli Figura mostrano immagini acquisite a 6 numero minimo di intervalli per nuclei incubate in: a) gli estratti fase tardiva dell'embrione (Lee), e B) inattivato con il calore (HI) estratto embrionale. Immagini dalla relativi tempi procedonoda sinistra a destra. La barra della scala è di 25 micron. C) nucleari contrazione dati provenienti da 46 diversi estratti di uova e di embrioni. Barre mostrano i mezzi per> 240 nuclei. Le barre di errore sono la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Schema del nucleare Shrinking Assay. Ogni casella colorata rappresenta un protocollo. Il rosso indica la preparazione di X. Estratto laevis uovo (protocollo 1). Blu indica la preparazione di X. demembranated laevis spermatozoi (protocollo 2). Rosa indica de novo assemblaggio nucleare in estratto uovo (protocollo 3). Il colore verde indica la preparazione di X. laevis estratto embrionale (protocollo 4). Viola indica la s nuclearihrinking protocollo del test e immunofluorescenza (protocollo 5). Parti di questa figura sono stati riutilizzati da 23. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

nome Buffer composizione Buffer
di Marc Modified Ringers (MMR), 1 / 3x 33 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,3 mM MgSO 4, 0,7 mM CaCl 2, 1.7 mM HEPES, pH 7.4
tampone estratto (XB), 10x 1 M KCl, 1 mM CaCl 2, 10 mM MgCl 2, 500 mM di saccarosio, 100 mM HEPES, pH 7,8 (pH regolato con 10 N KOH, conservato a 4 ° C)
Buffer B 4% cisteina sciolto in 0.8x XB (preparato con DDH 2 O freddo, pH undjusted a 7,8 con NaOH 10 N)
Buffer C Mescolare 100 m di 10x XB con 900 ml di DDH 2 O freddo
Buffer D Buffer C più 5 mM EGTA e 800 micron MgCl 2
LPC magazzino, 1,000x 10 mg / ml ciascuno di leupeptina, pepstatina e Chymostatin disciolto in DMSO (immagazzinate in aliquote a -20 ° C)
Buffer E 100 ml Buffer D più di 100 ml LPC magazzino
mix energetico, 50x 190 mM creatina fosfato disodico, 25 mM ATP sale bisodico, cloruro di magnesio 25 mM
Buffer T 15 TUBI mM, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 7 mM MgCl 2, 80 mM KCl, 0,2 M saccarosio, pH 7,4 (filtro sterilizzare e conservato a 4 ° C)
Buffer S 20 mm maltosio e 0,05% lisolecitina preparato in tampone T
Buffer R Buffer T più il 3% dei bovinisiero albumina
Calcio soluzione madre, 20x 10 mM CaCl 2, 0.1 M KCl, 1 mM MgCl 2 (conservato a -20 ° C)
fix Nucleus 125 ml 2 M di saccarosio, 12,5 ml 1 M HEPES pH 7.9, 250 ml 37% di formaldeide, 112 ml DDH 2 O, 0,5 ml 10 mg / ml Hoechst (conservato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane)
Modificato di Barth Saline (MBS), 10x 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3, pH 7.8
MBS di sale 1x MBS inclusa 0.7 mM CaCl 2 e 20 mM NaCl
tampone di lisi Uovo, ELB 250 mM di saccarosio, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7.8
tampone cuscino nucleare 1x XB, 0,2 M di saccarosio, 25% glicerolo (filtro sterilizzato e conservato a 4 ° C)

Tabella 1. Tamponi. Composizioni di tutti i buffer di cui al presente protocollo sono descritti in questa tabella.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

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