Hvordan studere basalmembran Stivhet som Biofysikalsk Trigger i prostatakreft og andre aldersrelaterte patologi eller metabolske sykdommer

Cancer Research
 

Summary

Her forklarer vi en protokoll for modellering av biofysiske mikromiljøet der kryssbinding og økt stivhet i basalmembran (BM) indusert av avanserte glycation sluttprodukter (aldre) har patologisk betydning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å studere de biofysiske mikromiljøet i forbindelse med øket tykkelse og stivhet i basalmembran (BM) under aldersrelaterte sykdommer og metabolske sykdommer (for eksempel kreft, diabetes, mikrovaskulær sykdom, retinopati, nefropati og neuropati) . Premisset for modellen er ikke-enzymatisk kryssbinding av rekonstituert BM (rbM) matrise ved behandling med glycolaldehyde (GLA) for å fremme avansert glycation sluttproduktet (AGE) generasjon via Maillard-reaksjonen. Eksempler på laboratorieteknikker som kan brukes for å bekrefte AGE generasjon, ikke-enzymatisk kryssbinding og økt stivhet i GLA behandlet rbM er skissert. Disse omfatter fremstilling av nativt rbM (behandlet med fosfat-bufret saltoppløsning, PBS) og stiv rbM (behandlet med GLA) for bestemmelse av: dets AGE innhold av fotometrisk analyse og immuno-mikroskopi, dens ikke-enzymatisk kryssbinding av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS PAGE), så vel som konfokal mikroskopi, og dens stivhet øket ved hjelp av rheometri. Fremgangsmåten beskrevet her kan brukes til å øke stivhet (elastisitetsmoduler, E) av rbM opp til 3,2-fold, i samsvar med målinger foretatt på sunne versus sykt humant prostatavev. For å gjenskape den biofysiske mikromiljøet knyttet til aldring og syke prostatakjertelen tre prostata celletyper ble introdusert på mors rbM og stiv rbM: RWPE-en, prostata epitelceller (PEC) avledet fra en normal prostatakjertel; BPH-1, Pecs avledet fra en prostatakjertelen påvirkes av benign prostatahyperplasi (BPH); og PC3, metastatiske celler avledet fra en sekundær bein svulst stammer fra prostatakreft. Flere parametre kan måles, inkludert størrelse, form og invasive egenskaper av 3D kjertel acini dannet av RWPE-1 og BPH-1 på mors versus stiv rbM, og gjennomsnittlig cellelengde, vandringshastighet og varighet av celle bevegelse av 3D spherOIDer dannet av PC3 celler under samme forhold. Cell signalveier og subcellulære lokalisering av proteiner kan også bli vurdert.

Protocol

1. Induksjon av BM Stivhet indusert av GLA Treatment (Non-enzymatisk Kryssbinding)

  1. Tine en frossen ampulle av BM matrise (10 ml) ved inkubering ved 4 ° C (stående på is i et kjølerom eller kjøleskap) inntil innholdet av ampullen er blitt flytende (8-16 timer).
    Forsiktig: Hvis et kaldt rom / kjøleskap ikke brukes, dekke hele flasken med is. Dette vil hindre at stamløsning av BM fra størkne.
  2. For fremtidige eksperimenter og for å unngå gjentatte fryse tine sykluser, forberede 25 x 0,4 ml porsjoner fra hver nye 10 ml hetteglass med BM matrise. Oppbevar hetteglass ved -80 ° C til utløpsdatoen som er angitt av produsenten. Ved behov, tine ampuller ved 4 ° C som står på is i 2 timer.
  3. Forbered en jevn overflate av is. Plassere en 8-brønners kammerobjektglass oppå isen for å opprettholde en temperatur på 4 ° C i løpet av beleggprosedyren. Tine en ampulle med BM matrise ved 4 ° C.
    Merk: En 0,4 ml hetteglass med BM matrise er tilstrekkelig til å coat en hel 1 x 8-brønn kammer lysbilde. Oppbevar hetteglasset dekket av is under behandling for å hindre at BM matrisen fra størkne.
  4. Skjær av utleverings enden av en 200 mL pipette med saks. Avkjøl butt-ended 200 mL pipette til 4 ° C og legg den på en 200 mL kapasitet pipetteringshjelpemiddel. Ta opp 40 mL av kulde BM matriseløsning i pipettespissen og overføre den til en brønn på kjølt 8-brønn kammer glass lysbilde.
    Merk: 40 ul BM løsning er nok til å dekke et overflateareal på 0,8 cm2. Hold pipettespissene kjølt under beleggingsprosessen prosedyren for å unngå størkning av det BM løsning. Ikke innføre luftbobler inn i BM matriseoppløsningen og sikre brønnen blir jevnt belagt uten dannelse av en synlig menisk i kantene.
  5. Gjenta trinn 1.4 i henhold til antall brønner og kamre som kreves.
  6. Etter belegging plasserer 8-brønners kammer lysbilde ved 37 ° C i 30 minutter for å fremme polymeriseringenav BM. Lukk inkubator døren meget forsiktig for å unngå uønsket forstyrrelse av væske rbM. Ikke overskrid 30 min inkubasjonstid for å unngå dehydrering av RBM gel.
    Merk: Den resulterende gel er mors rekonstituert BM (rbM). 37 ° C inkuberingstrinn ikke krever 5% CO2. Imidlertid, for enkelhets skyld å utføre dette trinn i en vevskultur-inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO2 (med fukting).
  7. Fremstille 50 mM glycolaldehyde (GLA) fortynnet i 0,2 M fosfatbuffer (pH 7,8). Steriliser oppløsningen ved å føre den gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter ved bruk av en 50 ml sprøyte.
    1. For en tverrbindingsreaksjon i et sluttvolum på 250 pl av 50 mM GLA, tilsett 25 ul av 0,5 M natriumcyanoborhydrid eller 2,5 M aminoguanidin til 125 ul av 100 mM GLA (2x lager) og 100 ul 0,2 M fosfatbuffer (pH 7.8 ). Sterilisere stamløsninger ved å føre dem gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter ved hjelp av en 50 ml sprøyte.
      Forsiktig: Håndter natriumcyanoborhydrid iført en frakk, hansker, ansiktsvern og åndedrettsvern mens du arbeider i en avtrekkshette.
  8. Tilsett 250 ul av GLA løsning for å dekke den polymeriserte rbM gelen og inkuber ved 37 ° C i 6 timer for å fremstille en semi-stiv rbM gel eller 14 timer for å fremstille en stiv rbM gel.
    Merk: Volumet av GLA lagt må dekke den polymeriserte rbM gel og bør justeres tilsvarende. Hvis forskjellige GLA inkubasjonstider er brukt, bør RBM gels bli analysert for å bestemme fold-økning i rbM stivhet (se trinn 2.4).
    1. Fremstille en negativ kontroll ved inkubering av en innfødt rbM gel i 250 mikroliter sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) i 14 timer ved 37 ° C.
    2. Fremstille to ytterligere kontroller hvor dannelsen av Schiff-basen eller Amadori-addukt omleiring under tverrbindingsreaksjonen blir hemmet ved tilsetning av 50 mM natrium-cyanborhydrid eller 250 mM aminoguanidin.
  9. Forbered en M glysin eetyl ester (GEE) fortynnet i PBS. Steriliser oppløsningen ved å føre den gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter ved bruk av en 50 ml sprøyte.
  10. Etter den angitte inkubasjonstid, forsiktig fjerne GLA løsning fra de tverrbundne RBM gels, GLA løsning som inneholder hemmere fra kontroll RBM gels og PBS fra kontroll innfødte RBM gels. Tilsett 250 ul av GEE løsning til alle de RBM geler og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
    Merk: Dette trinnet slukker tverrbindingsreaksjonen.
  11. Vask alle RBM gels 10 ganger i 500 mL PBS for å fjerne alle spor av GLA og GEE. Inkuber RBM gelene over natten ved 37 ° C i 400 ul PBS for å hindre deres dehydrering.
    1. Analyser RBM geler og AGE akkumulering, ikke-enzymatisk tverrbindings og viskoelastiske egenskaper (trinn 2,1-2,4). For Rheometric analyse av sine viskoelastiske egenskaper forberede RBM gels i kloningsringene (trinn 2.4).
    2. For cellekultur, skyll RBM gels 2 ganger med 500 mL kultur megdia før såing cellene (trinn 5 og 6). Utfør vasker skånsomt uten pipettespissen berøre gel overflaten.

2. Kvantifisering av ikke-enzymatisk Kryssbinding og Stivhet i rbM Behandlet med GLA

  1. Fotometrisk analyse
    1. Mål AGE akkumulering i GLA-behandlede og kontroll RBM geler ved bruk av fotometrisk analyse for å bestemme omfanget av Maillard-reaksjonen.
      1. Etter trinn 1.11, fjerne PBS fra RBM gels i 8-brønner kammer lysbilder og legge 250 mL iskald dobbelt destillert vann. Inkuber ved 4 ° C i 16-24 timer for å sikre at matriksen er fullstendig flytende.
        Merk: RBM peptider i denne løsningen inneholde aldre med auto-fluorescerende egenskaper.
      2. Overfør den flytendegjorte BM løsningen til et 1,5 ml rør og måle fluorescensemisjonen fra oppløsningen ved hjelp av et spektrofotometer (eksitasjons bølgelengde = 370 nm; emisjonsbølgelengde = 440 nm).
  2. SDS-PAGE analyse av cyanogenbromid Peptider
    1. Løse GLA-behandlede og kontroll RBM gels på en polyakrylamidgel for å bekrefte at GLA har indusert kryssbinding og dannelse av makrofibre.
      1. Sentrifuger den flytende BM oppløsningen oppsamlet i trinn 2.1.1.2 ved 10.000 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
      2. Fremstille en stamløsning inneholdende 2 g / ml cyanbromid fortynnet i acetonitril.
        Advarsel: Alltid håndtere cyanogenbromid i en avtrekkshette mens iført en frakk, hansker, ansiktsvern og åndedrettsvern.
      3. Fjern supernatanten, re-suspendere gelen BM pelleten i 500 pl av 20 mg / ml cyanbromid + 70% volum / volum maursyre og inkuber over natten ved RT.
      4. Bruke en 1 ml engangssprøyte for å overføre den resuspenderte pellet BM gelen inn i en dialyse kassett med en molekylvekt cut off 3,5 kDa.
      5. Senk kassetten inn i et 500 ml begerglass inneholdende 500 ml dobbeltdestillert vann og en magnetisk rørestav.Plasser denne på en magnetrører og dialyser over natten (16 timer) ved 4 ° C (i et kaldt rom) for å fjerne alle spor av cyanogenbromid og maursyre.
      6. Bruke en 1 ml engangssprøyte for å overføre den dialyserte BM oppløsning fra kassetten inn i et 1,5 ml rør.
      7. Analyse 25 ul av hver BM prøve på en 12% volum / volum polyakrylamidgel 10,11. Etter SDS-PAGE, utføre sølvfarging av polyakrylamidgelen 12 for å visualisere den elektroforetiske mønster av cyanogenbromid-matriks-peptider 13.
  3. Immunofluorescent Mikros Analysis
    1. Utfør immunfluorescens farging av GLA behandlet og kontrollere RBM geler med anti-age / pentosidine, anti-kollagen IV og anti-laminin antistoffer etterfulgt av konfokalmikroskopi å visualisere akkumulert aldre og kollagen IV / laminin fiber strukturelle rearrangements i krysskoblet rbM gels 13.
      Merk: Bruk alltid et tilstrekkelig volum til å dekke entire rbM gel under inkubering og vasker uten å berøre rbM overflaten med pipettespissen. For detaljer om å analysere 3D acini kulturer ved immunfluorescens se referanse 6 og for konfokalmikroskopi av 3D acini se referanse 14.
      1. Vask GLA behandlet og kontroll RBM geler i 8-brønner kammers objektglass 2 ganger med 300 ul PBS + (PBS inneholdende 0,1 mM CaCl2 og 0,5 mM MgCl2) i 5 min ved RT.
      2. Fjern PBS + deretter legge til 300 pl av 4% vekt / volum paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS + for å dekke hver rbM gel. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur for å feste RBM komponentene.
      3. Fjern den 4% w / v løsning PFA. Legg til 300 ul 75 mM NH4CI + 0,5 mM MgCl2-løsning og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur (gjentar 5x) for å stanse fiksering.
      4. Forbered Immunofluorescensanalyse buffer (IF buffer) ved å gjøre følgende løsning i sterilt vann: 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN3, 0,1% w / v bovint serumalbumin, 0,5% volum / volum polyetylenglykol-tert-oktylfenyl-eter og 0,05% volum / volum polyetylenglykol sorbitanmonolaurat.
      5. Forbered IF blokkering buffer ved å supplere IF buffer med 20% v / v geit serum.
      6. Fjern leskende løsning og tilsett 300 ul IF blokkeringsbuffer til RBM gels for å hindre uspesifikke reaksjoner. Inkuber i 2 timer ved RT på en risteplattform.
      7. Fjern IF blokkeringsbuffer og inkuber RBM geler og 16 timer ved 4 ° C med 300 ul av primær antistoff fortynnet i IF blokkeringsbuffer (1: 500 mus anti-pentosidine mAb; 1/250 kanin anti-kollagen IV pAb; 1 / 250 kanin-anti-laminin A / C-pAb).
        Merk: Inkubasjoner for lenger enn 20 timer ved 4 ° C kan liquidize RBM.
      8. Fjern det primære antistoff og vask 3 ganger (10 min hver) med 300 ul av IF-buffer ved romtemperatur på en risteplattform.
      9. Fjern IF buffer ogTilsett 300 ul av sekundært antistoff (geite-anti-kanin eller anti-mus IgG [H + L]) konjugert til et fluorokrom fortynnet 1: 500 i blokkeringsbuffer IF. Inkuber i 2 timer ved RT på en risteplattform.
      10. Fjern det sekundære antistoff og inkubert i 300 ul av IF-buffer i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern IF buffer og vaskes 3 x 10 min i 300 ul PBS + ved romtemperatur.
      11. Fest og slukke en gang, som beskrevet ovenfor (trinn 2.3.1.2 og 2.3.1.3).
      12. Monter farget RBM gels i monterings media og analysere dannelsen av tette bunter av hovedkomponentene som bruker epifluorescent eller konfokal mikroskopi.
        Merk: For detaljer om å analysere 3D acini kulturer ved immunfluorescens se referanse 6 og for epifluorescent og konfokalmikroskopi av 3D acini se referanse 14.
  4. reologiske Analysis
    1. Utføre Rheometric analyse av GLA behandlet og kontroll RBM geler for å måle deres viscoelasticity (stivhet).
      1. Sett opp RBM geler som er 1 mm tykk i en sirkulær form med en diameter på 8 mm. For å gjøre dette, plasserer en kloning ring (8 mm diameter) i en brønn i en 24-brønn kultur plate og legge BM matrix løsning fremstilt som beskrevet i trinn 1.3-1.6.
        Merk: For nøyaktig gjentagelse av RBM gels som brukes til eksperimenter, RBM gels forberedt for Rheometric analyse må ha samme areal og tykkelse som RBM gels satt opp i åtte-brønns kamre. RBM Gelene analyseres i figur 3 var 1 mm tykke og 8 mm i diameter.
      2. Unn RBM gels satt opp i kloning ringer med PBS, GLA i 6 timer og GLA i 14 timer som beskrevet ovenfor (trinn 1,8 til 1,11).
      3. Måle elastisitetsmodulen (E) av 8 mm diameter RBM geler på et reometer med en 8 mm parallell plategeometri taggete, over et område på 1-3% belastning, ved en fast frekvens oscillasjon av 1 Hz og temperatur på 21 ° C. For ytterligere informasjon omRheometric analyse av ECM gels se referanser se referanse 13,15,16.
        Merk: E blir bestemt fra den resulterende skjærlagringsmodul (G ') ved bruk av den følgende ligningen E = 2 * G' * (1 + v) hvor v er Poissons forhold på 0,5, som beskrevet i referanse 13,15 , 16.

3. Kultur og håndtering av Normal PEC linje, RWPE-en

  1. Grow RWPE-1 celler i keratinocytt-serum-fritt media (KSFM) supplert med 5 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF), 50 pg / ml bovint hypofyseekstrakt (BPE) og 50 U / ml penicillin med 50 ug / ml streptomycin ( full KSFM).
    Merk: For å unngå induksjon av epitelial til mesenchymale do (EMT) -lignende overgangen ikke utsettes RWPE-1 celler til serum. Tillate total KSFM å nå romtemperatur i 30 minutter etter fjerning fra lagring ved 4 ° C og ikke varm i et 37 ° C vannbad, da dette vil inaktivere EGF og BPE.
  2. Aspirer komplettKSFM fra en konfluent 10 cm2 plate av RWPE-1-celler, skylles med 5 ml forvarmet PBS og tilsett 5 ml 0,05% volum / volum trypsin å sikre at alle cellene er dekket med løsningen.
    1. Plassere cellene i en vevskultur-inkubator innstilt ved standardbetingelser på 37 ° C og 5% CO2 (med fukting) i 5 til 10 min. Sjekk omfanget av trypsinering etter 5 min og banke forsiktig på kultur plate å løsne cellene.
      Merk: RWPE-1 celler ikke tåler lange perioder med trypsinering så det anbefales ikke å håndtere mer enn to plater samtidig. Det er også viktig å skille alle celler fra platen for å unngå klonal seleksjon.
  3. Når alle RWPE-1-celler har fjernet tilknytningen, tilsett 5 ml varm PBS inneholdende 2% volum / volum føtalt kalveserum (FCS) for å stanse trypsin. Forsiktig pipettere opp og ned for å bryte opp celleaggregater før overføring av cellene til et sentrifugerør.
  4. Sentrifuger dissosierte cellene ved 125-150 xg i 5 min ved 25 ° C, supernatanten kastes og re-suspendere pelleten av celler i 5 ml fullstendig KSFM til en suspensjon av enkeltceller blir oppnådd.
  5. Transfer 1 ml re-suspendert celler i et nytt rør og legge 9 ml komplett KSFM å forplante cellene på en 1: 5 passasje fortynning for påfølgende eksperimentell bruk. Telle resten av cellene ved hjelp av en hemocytometer for å sette opp acini (se avsnitt 5.1).
    Merk: Ikke kultur RWPE-1 celler for mer enn 10 passeringer siden etter lengre perioder med kultur de ikke danner acini med riktig arkitektur.
  6. Endre kulturen media hver 48 time for å sikre EGF og BPE forblir aktive.
    Merk: Ta med dette mediet endring for noen behandlinger som strekker seg utover 48 timer.

4. Kultur og håndtering av BPH Cell Line, BPH-en

  1. Kultur BPH-1-celler i RPMI 1640 media supplert med 5% volum / volum FCS, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin. varmkulturmedia, PBS og 0,25% vekt / volum trypsin-0,53 M EDTA-løsning til 37 ° C før bruk.
    Merk: Celler kan også dyrkes i media med 2,5% volum / volum FCS 8.
  2. Aspirer kulturen media fra en konfluent 10 cm 2 plate av BPH-1 celler og vaske cellene 2 x med 3 ml PBS for å fjerne alle spor av kultur media med serum som kan slukke den trypsin reaksjon.
  3. Aspirer PBS og tilsett 3 ml trypsin-EDTA-oppløsning for å dekke cellene. Sett platen i en inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO2 (med fukting) i 5 minutter. Ta av trypsin-EDTA løsning når cellene er runde, men fortsatt festet til parabolen. Vask cellene med 5 ml PBS.
  4. Etter fjerning av PBS, tilsett 5 ml kulturmedium og forsiktig pipettere opp og ned for å fremstille en suspensjon av enkeltceller. Overfør cellene til et 15 ml rør.
  5. Ta 2 ml av cellesuspensjonen i et nytt sentrifugerør med 8 ml komplett medium og platen BPH-1 celler onto en 10 cm to kulturplate i en 1: 5 fortynning passasje for påfølgende eksperimentell bruk. Telle resten av cellene ved hjelp av en hemocytometer for å sette opp acini (se punkt 5.2).
    Merk: Hold oversikt over passasjen nummer, som eldre BPH-1 celler danner ikke acini med en skikkelig arkitektur. En passasje nummer mer enn 10 ikke er ønsket.
  6. Endre kulturen media hver 72 time.

5. 3D Culture of prostatakjertel acini på Native og Stiff rbM

  1. Hvis RWPE-1-celler blir brukt til å danne acini, fortynn 5.000 celler fremstilt i trinn 3.5 i 300 pl av komplett KSFM supplert med 2% volum / volum av BM løsning.
  2. Hvis BPH-1-celler blir brukt til å danne acini, fortynn 2500 celler fremstilt i trinn 4.5 i 300 ul av RPMI 1640 kulturmedium supplert med 2% volum / volum av BM løsning.
    Merk: BPH-1 celler er større enn RWPE-1-celler slik at lavere antall BPH-1 celler blir anvendt for å oppnå en tilsvarende fordeling av acini etter 6 dager med Culture.
  3. Forsiktig frø cellene på de innfødte og AGE-stivnet rbM og nøye plassere kulturer i en inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO 2 (med luftfukting) for å sikre en jevn fordeling av økende acini i brønnen og at hver celle deler seg å produsere en acina.
  4. Hver 2 dager erstatte kulturmediet med friskt kulturmedium inneholdende 2% volum / volum BM løsning for å sikre at celler har vekstfaktorene som kreves for normal acina homeostase.
  5. Monitor acinar morfologi i voksende kulturer som bruker lysfelt mikros 13.
    Merk: Etter 3 dager i kultur individuelle celler vil danne en klynge av> 3-celler, og etter en uke prostatakjertel acini med en diameter på ~ 50 pm vil bli observert.
  6. Følg protokoll beskrevet i 2.3 til å utføre immunfluorescens bruker antistoffer som er spesifikke for markører for celle-matriks voksninger, celle-celle adhesjon, apico-basal polaritet og invasivitet 13.

6. 3D Culture av prostata Tumor Cell tilslag på Native og Stiff rbM

  1. Kultur PC3-celler i RPMI 1640 medium inneholdende 10% volum / volum FCS og 50 U / ml penicillin med 50 ug / ml streptomycin. Varm kulturmediet, PBS og 0,25% vekt / volum trypsin-0,53 M EDTA-løsning til 37 ° C før bruk.
  2. Aspirer kulturmedier fra en konfluent 10 cm2 dyrkningsskål på PC3-celler og vaske cellene 2x med 3 ml PBS for å fjerne alle spor av FCS som kan slukke den trypsin-reaksjonen.
  3. Aspirer PBS og tilsett 3 ml trypsin-EDTA-oppløsning for å dekke cellene og inkuberes i 1 min.
  4. Når cellene blir avrundet, men forblir festet til fatet, forsiktig suge trypsin-EDTA-oppløsning og vask med 3 ml PBS tilfjerne alle spor av trypsin.
  5. Etter fjerning av PBS, tilsett 5 ml kulturmedium og forsiktig pipettere opp og ned for å fremstille en suspensjon av enkeltceller. Overfør cellene til et 15 ml rør.
  6. Ta 1 ml av PC3 cellesuspensjonen inn i et nytt sentrifugerør og tilsett 9 ml kulturmedium. Plate cellene på en 10 cm 2 kultur tallerken (1:10 fortynning) for påfølgende eksperimentell bruk. Telle de resterende celler ved hjelp av en hemocytometer.
  7. Fortynn 2500 PC3-celler fremstilt i trinn 6.6 i 300 ul av RPMI 1640 kulturmedium supplert med 2% volum / volum av BM løsning for å tillate dannelsen av en gradient gel i kulturen.
  8. Forsiktig frø cellene på de innfødte og AGE-stivnet rbM og legg nøye kulturen inn i inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO 2 (med luftfukting) for å sikre jevn fordeling av voksende kuler i brønnen.
  9. Endre kulturen media hver 72 time.
  10. For å studere effekten av stive (AGE-rik) rbMpå prostata svulst celle migrasjon, bilde PC3 celler ved hjelp av lysfelt video time-lapse mikroskopi ved hjelp av temperatur / CO2 kontroll og en fuktet kammer 17.
    Merk: PC3 celler vokse i tråder på mors RBM og danner ikke acini med et lumen, men hvis venstre for å vokse mer enn 72 timer på mors rbM de vil danne 3D-kuler.
  11. Etter datainnsamling, manuelt spore PC3 celler og beregne deres migrasjon hastighet, form (forlengelse ratio) og utholdenhet av migrasjon 17-19.
    Merk: Bestandighet = forholdet D / T, D = avstand fra start til slutt av celle bane, T = total lengde av celle bane.

Representative Results

3D Prostata acini Cultured på Stiff rbM

Etter 6 dager i kultur, Pecs avledet fra normal prostata vev (RWPE-1) (figur 1A) og BPH vev (BPH-1) (figur 1B) form acini på mors (PBS behandlet) rbM som er organisert i uniform kuler av epitel celler. Disse acini har også karakteristikkene av høyt organiserte PEC med apikal-til-basal polaritet og en synlig luminal plass 13,20.

Den acini dannet av PEC stammer fra normal prostata vev (RWPE-1) (figur 1A) og BPH vev (BPH-1) (figur 1B) på stivnet (AGE-rik) rbM (behandlet med GLA) har en forstyrret arkitektur (skiftende fra sfæroidal til kantet i form og celler utstående / migrere fra acini inn i AGE-rik rbM) (figur 1A). Disse acini er også preget av svært uorganisert PEC som har mistet sin apikal-til-basal polaritet med en liten eller ikke-eksisterende luminal plass 13.

Figur 1
Figur 1:. Prostata Epitelceller vokst som 3D Glandular acini på Native og Stiff Rekonstituert basalmembran (rbM) (A) Lysfelt bilder av RWPE-1 celler dyrket i 12 timer opp til 6 dager på RBM gels behandlet med PBS (native) eller 50 mm glycolaldehyde i 14 timer (AGE-rik, stiv); Scale bar = 50 mikrometer. (B) BPH-1 celler, dyrket som beskrevet i panel A; Skala barer = 50 mikrometer; data er representativ for 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1 "src =" / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/>
Tabell 1:. Kjennetegn på prostata epithelial RWPE-en acini dyrket på Native, Semi-Stiv og Stiff Rekonstituert basalmembran (rbM) RWPE-1 acini ble dyrket på rbM forbehandles med PBS i 14 timer (native), glycolaldehyde (GLA ) i 6 timer (semi-stiv) eller GLA i 14 timer (stiv). For acinar form, prosentandel (%) ± standardavvik (SD) av runden, ble halvkantet og mangekantede acini beregnet ut fra 5 uavhengige eksperimenter (50 acini kvantifisert per tilstand). Relativ acinar størrelse ble beregnet (native rbM = 100%) fra 3 uavhengige eksperimenter. For invasivitet, ble% ± SD acini med en eller flere utstående celler beregnes fra 3 uavhengige eksperimenter. Gangers endring er beregnet ved å dividere den gjennomsnittlige verdien oppnådd under semi-stive eller stive betingelser ved den tilsvarende verdi for native betingelser. P-verdier beregnet med t-test (α = 0,05).

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> aldersavhengig økt rbM stivhet fremmer PC3 prostata svulst celle migrasjon

PC3 celler dyrket på mors rbM migrere ved å opprettholde kontinuerlig celle-celle kontakt, mens PC3 celler dyrket på AGE-rik (stiv) rbM flytte uavhengig av hverandre (figur 2A). Etter 72 timer i kultur PC3 cellene danner foci (kuler) på mors (PBS behandlet) rbM, mens PC3 celler på stiv (AGE-rik) rbM ikke fra kulene og migrere uavhengig (figur 2B). PC3 celler på stiv (AGE-rik) rbM er mer langstrakt enn PC3 celler dyrket på mors rbM (figur 2C). PC3 celler på stiv rbM migrere raskere enn PC3 celler dyrket på mors rbM (figur 2D). PC3 celler på stiv rbM vise en reduksjon i utholdenhet i forhold til PC3 celler dyrket på mors rbM (figur 2E).

"Figur Figur 2:. Prostata Tumor Cell Migrasjon på Native og Stiff Rekonstituert basalmembran (rbM) (A) Lysfelt bilder av PC3 celler dyrket på RBM gels behandlet med PBS (native) eller 50 mM glycolaldehyde i 14 timer (AGE-rik, stiv) . Celler ble fotografert ved hjelp av et lysfelt mikroskop (10X objektiv) og et oppkjøp rate på 1 bilde per time i 12 timer, etterfulgt av celle sporing for å generere baner. Bildene som er vist svarer til de tidspunkter etter 0, 3, 6, 9 og 12 timer. Baner av enkeltceller er vist for den 12 timers tidspunkt. Scale bar = 100 mikrometer. (B) PC3-celler dyrket på naturlige eller stiv rbM i 72 timer, og avbildes som beskrevet i panelet (A). Scale bar = 100 mikrometer. Detalj viser valgte området med 2X forstørrelse. (C) Mean ± SD cellelengden (nm); signifikant forskjell mellom innfødte rbM og stiv rbM (p = 1,2 x 10 -23). ( (E) Gjennomsnitt ± SD persistens av cellebevegelse (forholdet D / T, hvor D = avstand fra start til slutt av celle bane, T = total lengde av banen celle); signifikant forskjell mellom innfødte rbM og stiv rbM (p = 0,0007). For paneler CE> 10 celler ble analysert, er data som representerer 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En protokoll for generering av 3D-kjertel acini fra MECS i ren RBM gels 6 ble endret i en tidligere studie ved tilsetning av 4 mg / ml type I kollagen til RBM matrise. Tilsetningen av kollagen resulterte i elastisitetsmodulen av RBM gelen øker fra 175 ± 37 til 1589 ± 380 pascal. Denne 9,1-ganger økning i stivhet modulert vekst, overlevelse, migrasjon og differensiering av MECS 21. Protokollen ble endret på nytt ved å inkludere et behandlingstrinn med D - (-) - ribose for å fremme ikke-enzymatisk kryssbinding av type I kollagen som var blitt tilsatt til RBM gel. Den resulterende 15-dobling av stivhet ble funnet å samarbeide med onkogene transformasjon av mecs å fremme deres invasive atferd 22. Den eksperimentelle tilnærming for å legge til type I kollagen å RBM gels forenkler direkte interaksjon av mecs med kollagenfibre, som bare forekommer i menneskelig vev etter fysisk barriere mellom stromaog epitel levert av BM gjennomgår proteolytisk degradering. Ved å generere 3D kjertel acini fra PEC i ren RBM geler forbehandlet med GLA, åpnes den aktuelle protokoll den måten å studere hvordan BM stivhet i seg selv kan utløse deres invasive oppførsel (figur 3). Nivåene av BM stivhet indusert i denne protokollen har fysiologiske relevans. Inkubering med 50 mM GLA i 6 timer og 14 timer henholdsvis økt elastisitetsmodulene til den rene rbM gelen til 175 ± 90 og 322 ± 160 i forhold til 122 ± 55 Pascal i RBM geler behandlet med PBS (tabell 1). Dette 1.7 til 3.2 ganger økning i rbM stivhet rekapitulerer den 2,5 til 3,4 ganger høyere stivhet observert i ondartet forhold til normal prostata eller BPH vev 23-26. Som beskrevet i en nylig publikasjon 13 de morfologiske endringer indusert ved akkumulering av AGE og RBM stivhet i PEF acini kan kvantifiseres for en statistisk signifikant skifte fra arounded til mangekantet form, redusert luminal / total acinar området, og utstående celler migrerer fra acina inn i AGE rike rbM (figur 3). Immunoblotting kan også brukes til å vurdere markører for EMT (for eksempel tap av E-cadherin 13) og den kontraktile egenskaper (for eksempel fosforylert myosin lettkjede-2, pMLC2 13) i PEC dyrket i normal versus stiv rbM (figur 3). Ytterligere vurdering ved hjelp av immunfluorescens-fargingen og konfokal mikroskopi kan anvendes for å visualisere BM (f.eks laminin, kollagen IV og AGE akkumulering 13), cellulær apikale-til-basal polaritet (f.eks apikal lokalisering av EEA1: tidlig endosomale antigen 1; og GM130: 130 kDa cis-Golgi markør 13) og cellulære mønstre av adhesjonsmolekyler (f.eks E-cadherin lokalisering til celle-celle kryss 13) (figur 3).

"Figur Figur 3:. Oversikt over ulike protokoller som presenteres her Diagrammet viser hvordan å forberede og stive av rekonstituert basalmembran (rbM) med glycolaldehyde (Maillard-reaksjonen), hvordan å frø celler videre til stiv rbM, hvordan å analysere stiv rbM ( omfanget av Maillard reaksjon) og prosedyrer som kan brukes til å analysere de cellulære og molekylære endringer indusert av AGE-rik rbM. AGE, avanserte glycation sluttprodukter; BM, basalmembran; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol; EEA1, tidlig endosomal antigen 1; GAPDH, glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycin etylester; GM130, 130 kDa cis-Golgi markør; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosin lett kjede-2 fosforylert på steder treonin 18 og serin 19; rbM, rekonstituert basalmembran; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese. For RWPE1 acini Scale bar = 10 mikrometer; for PC3 tumorcellekuler Scale bar = 100 mikrometer. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Feilsøkings trinn vil være nødvendig hvis D - (-) - ribose velges som tverrbindingsmiddel for rbM. Under protokollen utvikling ble det funnet at behandling med en M D - (-) - ribose i 72 timer, som tidligere beskrevet for rbM / kollagen-geler 22, resulterte i dehydrering og krymping av RBM geler. Evalueringen av lavere konsentrasjoner av D - (-) - ribose og kortere behandlingstider kan bidra til å overvinne denne begrensningen.

En potensiell begrensning i fremtidige anvendelser av protokollen kunne være oppstått hvor høyere nivåer av rbM stivhet er ønskelig. Hvis lengre inkubasjonstider og høyere konsentrasjoner av GLA brukes for å indusere høye nivåer av rbM gel stivhet vil det være nødvendig å vurdere om disse behandlingsforhold har en innvirkning på celle overlevelse og spredning, som tidligere beskrevet 13. Det bør også legges merke til at inkubering av RWPE-1-celler med serum induserer en fenotypisk EMT-lignende overgang og eksponering for serum eller serumholdige materialer bør unngås. For eksempel, hvis eksperimenter involverer transfeksjon av kort interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider, prosedyren bør optimaliseres ved hjelp av RWPE-1 celler dyrket i KSFM, uten å skifte cellene til lav serum transfeksjon media. Denne ulempen kan kompromittere nivået av genet lyddemping oppnås ved bruk av forbigående siRNA tilnærminger i modellen. For noen protein mål ville det rådes til å ansette induserbare shRNA vektorer for fleksibel genet Slå og ønsket reduksjon i protein nivåer. Innretninger som innlemmer enzymatisk kryssbinding av stroma-celle eller tumor celleassosiert lysyl oksidase (LOX) 17 kan også bli innarbeidet i framtidige modeller.

jove_content "> Denne protokollen vil lette fremtidige studier av pro-invasive mekanismer som utløses av aldersavhengig BM stivhet i Pecs (RWPE-en, BPH-1) og evaluering av anti-metastatiske mål i invasive PTCs (PC3). Gitt at BPH anses å være en stoffskiftesykdom 27, denne protokollen åpner også mot vår bedre forståelse av sammenhengen mellom metabolske forstyrrelser og økt prostata kreftrisiko. Gitt at BM stivhet indusert av sin eksponering mot AGEs kan være en trigger for invasivitet i andre kreft typer, vil det være av interesse å bruke protokollen for å sette opp lignende modeller som inneholder normale epitel-celler og tumorceller fra andre organer (for eksempel bryst, kolon, eggstokkene, bukspyttkjertel).

Kritiske trinnene i protokollen, sammen med sine timings, er oppsummert i figur 4. Under det første trinnet er det viktig å opprettholde bestanden løsning av rbM ved 4 ° C, mens den tiner for å hindre at den polymerization. Pipettespisser bør ikke plasseres inn i RM stamløsning inntil de har blitt avkjølt til 4 ° C. For neste trinn er det også viktig å sikre kammeret lysbildene har likevekt til 4 ° C før de er belagt med RBM løsning. Så snart temperaturen i RBM oppløsningen økes til over 4 ° C, vil det gjennomgå irreversible polymerisasjon for å danne en gel. Det vesentlig at RBM ikke blir forstyrret under polymerisasjonstrinnet for å sikre at den danner en jevn overflate som passer for cellekultur og mikroskopisk analyse. Varigheten av inkubasjon med GLA med eller uten inhibitorer av Maillard-reaksjonen (natriumcyanborhydrid og amingoguanidine) vil bestemme hvor stiv RBM gelen blir. Det anbefales å bruke en 6 timers inkubasjon med GLA hvis semi-stiv vilkår kreves, og 14 timers inkubasjon hvis stive vilkår kreves (tabell 1). Alternativ inkubasjonstider eller konsentrasjoner av GLA kan anvendes dersom forskjellige nivåerav stivhet er ønskelig. I dette tilfelle reologiske analyse av de RBM gelene må innarbeides som et viktig trinn. Etter trinnet med avkjøling av Maillard-reaksjonen ved inkubasjon med GEE og de etterfølgende vasketrinn med PBS, kan RBM gelene skal brukes umiddelbart eller lagret ved 4 ° C i opptil 48 timer før deres anvendelse for cellekultur. Når cellekulturer er satt opp er det viktig å endre dyrkingsmediet (inkludert eventuelle behandlinger) annenhver dag. Det anbefales å opprettholde den 3D-cellekulturer i 3-12 dager i henhold til parameterne som skal undersøkes. For 3D PEC acini det anbefales å analysere kulturer etter 6 dager, og for 3D PTC kuler analyse anbefales etter 3 dager med kultur i første instans.

Figur 4
Figur 4:. Enkel Oversikt over protokollen med Kritiske trinn og Timing indikerte flow diagrammet viser hvordan du kan forberede og stive av rekonstituert basalmembran (rbM) med glycolaldehyde (Maillard reaksjon) med kritiske trinn og timings angitt. Punkter hvor protokollen kan stoppes, og RBM gels er lagret, er også indikert. rbM, rekonstituert basalmembran; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycin etylester; ON, overnatting; PBS, fosfatbufret saltoppløsning; RT, romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I - Material for monolayer culture
BPH-1 CaP Cell Line Database PCaCL-132 Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media  ThermoFisher Scientific 17005-075 Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum  First Link UK Ltd 02-00-850 Store at -20 ºC in aliquots
PC3  American Type Culture Collection CRL-1435
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets Oxoid BR0014G
RPMI 1640 medium  Sigma-Aldrich R5886 warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1  American Type Culture Collection CRL-11609
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049
Name Company Catalog Number Comments
II - Material for 3D culture
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Aminoguanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 396494 Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well  Thermo Scientific Nunc Lab-Tek TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract  AMS Biotechnology 3445-005-01 Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide  Sigma-Aldrich C91492 Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid Sigma-Aldrich 695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) Sigma-Aldrich 50060 Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA) Sigma-Aldrich G6805
Sodium cyanoborohydride  Sigma-Aldrich 71435 Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns Appleton Woods BC680
Name Company Catalog Number Comments
III - Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThemoFisher Scientific D3571 light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders Sigma-Aldrich C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11001 light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11034 light sensitive
Goat serum Abcam ab7481 Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media  Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb TransGenic Inc KH012
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich F8775 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody   Acris Antibodies R1041 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb Santa Cruz Biotechnology Inc sc-7292 Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) Sigma-Aldrich T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) Sigma-Aldrich P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer ThemoFisher Scientific 66333
Name Company Catalog Number Comments
IV - Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer T.A. Instruments
Axiovert S100 (20X magnification) microscope Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast  Olympus 
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer BMG Labtech
Name Company Catalog Number Comments
V - Software
Image J 1.47v National Institute of Health, USA
MetaXpress Molecular Divices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18, (2), 123-132 (1996).
  2. Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132, (2), 278-291 (1988).
  3. Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7, (1), 64-71 (2013).
  4. Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29, (5), 402-410 (2010).
  5. To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
  6. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  7. Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18, (6), 1215-1223 (1997).
  8. Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31, (1), 14-24 (1995).
  9. Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17, (1), 16-23 (1979).
  10. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  11. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  12. Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, (10), 785-794 (1990).
  13. Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235, (4), 581-592 (2015).
  14. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  15. Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52, (4), 1013-1025 (2008).
  16. Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32, (14), 1863-1868 (2013).
  17. Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3, (2), 151-165 (2016).
  18. Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162, (5), 789-794 (2003).
  19. Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175, (2), 337-347 (2006).
  20. Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13, (3), 538-547 (2015).
  21. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  22. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, (5), 891-906 (2009).
  23. Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33, (3), 302-309 (2011).
  24. Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4, (4-5), 213-225 (2008).
  25. Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20, (4), 260-274 (1998).
  26. Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34, (7), 1033-1042 (2008).
  27. Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. Article ID:329456 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics