Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

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Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

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Abstract

A incidência de doença inflamatória intestinal, ou seja, doença de Crohn e colite ulcerosa, aumentou significativamente ao longo da última década. A etiologia de IBD permanece desconhecida e estratégias terapêuticos actuais baseiam-se na supressão não específica do sistema imunitário. O desenvolvimento de tratamentos que visam especificamente a inflamação intestinal e a cicatrização de feridas epiteliais poderia melhorar significativamente a gestão da DII, no entanto, isto exige uma detecção precisa das alterações inflamatórias. Actualmente, os potenciais candidatos a fármacos são geralmente avaliada utilizando modelos animais in vivo ou com técnicas baseadas cultura de células in vitro. O exame histológico geralmente requer as células ou tecidos de interesse a serem manchadas, que podem alterar as características da amostra e, além disso, a interpretação dos resultados podem variar de acordo com especialização investigador. microscopia holográfica digital (DHM), com base na detecção de atraso comprimento do percurso óptico, permitemancha-livre imagem de contraste de fase quantitativa. Isso permite que os resultados sejam directamente correlacionada com parâmetros biofísicos absolutos. Demonstramos como a medição das mudanças na densidade do tecido com DHM, com base na medição do índice de refração, pode quantificar alterações inflamatórias, sem coloração, em diferentes camadas de amostras de tecido do cólon de ratos e seres humanos com colite. Além disso, demonstramos monitoramento livre-label multimodal contínuo de cicatrização de feridas epiteliais in vitro, possível usando DHM através da determinação automatizado simples da área ferida e determinação simultânea de parâmetros morfológicos, tais como a massa seca e espessura da camada de células que migram. Em conclusão, DHM representa um valioso, novos e ferramenta quantitativa para a avaliação da inflamação intestinal com valores absolutos de parâmetros possíveis, quantificação simplificado de cicatrização de feridas epiteliais, in vitro e, por conseguinte, tem um elevado potencial para o retorno de diagnóstico translacionalSE.

Introduction

Doença inflamatória do intestino (IBD), isto é, a colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (CD) são desordens inflamatórias idiopáticas do tracto gastrointestinal 1. A investigação sobre a fisiopatologia subjacente de IBD ea avaliação de potenciais novos medicamentos ou novas abordagens de diagnóstico é particularmente importante. Tanto na pesquisa básica e o manejo clínico de pacientes com DII, a mucosa intestinal tornou-se um foco de atenção 2,3. A mucosa representa um contorno anatómico, em que a interacção entre as bactérias comensais, células epiteliais e os vários componentes celulares do sistema imune do intestino intestino orquestrar homeostase 4,5. No entanto, em pacientes com DII, inflamação intestinal descontrolada e persistente conduz a danos da mucosa, detectável como ulcerações ou estenose, o que pode finalmente culminam na degradação da função de barreira epitelial, que se agrava a inflamação local 6.

7. Epitelial a cicatrização de feridas pode ser simulada in vitro Os ensaios de cura de feridas e em modelos de murídeo de inflamação intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo abordagens apresentam desvantagens, o que limita a precisão da avaliação experimental. Os ensaios in vitro, como ensaios clássicos de raspar, requerem procedimentos de coloração prolongadas ou transfecção com cromóforos fluorescentes. Eles são, muitas vezes limitada pela sua monitorização descontínua da proliferação e migração celular, que não pode ser automatizado 10. Modelos in vivo, tais como o sulfato de dextrano de sio (DSS) de colite induzida, carecem frequentemente robustos read-outs, em parte devido à variação significativa observada em marcadores laboratoriais, marei tais marcadores inadequados para avaliar a gravidade da colite 11,12. A análise histológica da mucosa inflamada ainda está a abordagem mais válida para determinar a gravidade da colite, mas isso, como ensaios in vitro de cicatrização de feridas epiteliais, requer coloração e depende de perícia do investigador 13.

Microscopia holográfica recentemente digitais (DHM), uma variante de microscopia de fase quantitativa 14, foi identificada como uma ferramenta útil para a avaliação da cicatrização do epitélio da ferida in vitro e in vivo 15. DHM permite a avaliação da densidade do tecido através da medição de atraso comprimento do trajecto óptico (OPD) , cujo diagnóstico perspectivas romance câncer de 16-18 e quantificação de inflamação relacionada alterações teciduais 19. Além disso, DHM permite o monitoramento da dinâmica da morfologia celular por determinar a espessura das células, células coberta área de superfície e intracelular (proteína) a quantidade de conteúdo in vitro, DHM também permite a análise de processos fisiológicos, por exemplo, permeabilidade à água celular por avaliar alterações no volume celular e espessura 21,22. Além disso, as medições DHM pode ser automatizado que evita viés de amostra associada ao investigador.

Aqui, demonstramos a utilização de DHM em um modelo murino de inflamação intestinal, e também se aplicam DHM para análise de amostras de tecidos humanos para monitorização quantitativa de cicatrização de feridas como um ensaio in vitro isento de etiqueta. Em primeiro lugar, avaliar as alterações inflamatórias de diferentes parede camadas do cólon em camundongos col�icos e cortes de tecidos de seres humanos com IBD. Depois de descrever o procedimento de imagiologia quantitativa fase DHM, que fornecem instruções detalhadas para a utilização dos componentes de microscópio, a preparação de secções de tecido e também descrevem a avaliação das imagens de fase quantitativa adquiridos.

Em seguida, mostramos que DHM pode ser utilizado para a monitoração contínua de multimodal epitelial cicatrização de feridas in vitro, e descrever a análise das características celulares como a espessura da camada de células, massa seca e volume celular dar dicas sobre as alterações induzidas por drogas e celulares fisiológico.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comité regional de ética (o Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Alemanha) de acordo com a Lei de Protecção dos Animais alemã. O comitê de ética local da Universidade de Münster aprovou o uso de tecidos humanos para análise histológica e microscópio.

1. Os animais e Materiais

  1. Use mulher ou ratos machos da estirpe DSS-suscetíveis exigia que pesam de 20 a 25 g, e casa de acordo com a legislação local cuidados com os animais. Forneça ração especial para roedores e autoclavado beber água ad libitum.
  2. Induzir a colite DSS aguda por administração de 3% w / v de sulfato de dextrano de sio (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) em água da torneira tratada em autoclave durante 5 dias.
    NOTA: A potência de DSS é altamente variável dependendo do fabricante e lote. Teste o seu DSS fornecidos pelo fornecedor primeira para a indução da atividade da doença, para a qual daily peso corporal é um indicador confiável e objetiva.
  3. Para a avaliação histológica de amostras de tecido do cólon, eutanásia ratos por insuflação de CO 2 (ou, conforme especificado pelas normas nacionais e institucionais) no final da experiência.

2. Configuração experimental para DSS-colite e In-vitro Wound Healing 'Ensaios

  1. Cultura de células e ensaio de estabelecimento de cicatrização de feridas.
    1. Crescer as células Caco-2 em uma humidade relativa de 95% e 5% de CO 2 ambiente a 37 ° C. Use meio RPMI com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Semente células Caco-2 a uma densidade de 4 x 10 5 células / cm2 em 35 mm pratos Petri com alta-cultura de inserção (ver Figura 4A).
      NOTA: O inserto gera duas áreas de células cobertas que são separados por um espaço livre de células definida que representa a área de ferida a ser analisado.
    3. Alterar meio de dois dias após seeding. Realizar por aspiração primeiro meio residual com restos de células, usando uma pipeta automática, lave com 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionar meio fresco ou meio RPMI privadas de soro.
    4. células de cultura durante 24 horas em meio privado de soro (0,1% FBS) suplementado com 20 ng de EGF / ml de soro ou 2 mg de mitomicina c / ml de soro para detectar alterações no comportamento cicatrização das feridas. Adicionar meio normal RPMI com células de controlo, durante 24 h.
    5. Após 24 h de cultura, remover e descartar inserções de cultura tal como descrito no passo 3.4 e executar DHM.
  2. A indução de colite DSS aguda
    1. Dissolve-se 3 g de DSS em 100 ml de água autoclavada para obter um 3% (w / v) de solução de DSS. Fornecer esta solução no lugar de água potável para ratos ad libitum durante 7 dias. Calcule 5 ml de DSS-solução por rato / dia. Fornecer água autoclavada sem DSS para os ratos de controlo ad libitum.
  3. Preparação de secções de criostato de murino e humano do cólon
    1. Eutanásia ratos por insuflação de CO 2 no final da experiência.
    2. Dissecar abdómen dos animais, de laparotomia 23. Remover todo o cólon cuidadosamente usando uma pinça e cortar o final ileal e rectal utilizando uma tesoura cirúrgica. Cortar o cólon com uma tesoura longitudinalmente a partir do ceco ao fim rectal e abrir o cólon. Remover todas as fezes a partir do espécime usando uma pinça seguido de lavagem com PBS 24.
    3. Prepare rolos suíços rolando acima de todo o cólon com um cotonete longitudinalmente a partir do ceco até o fim rectal com a mucosa curvado para dentro. Incorporar amostras de cólon em temperatura de corte óptima composto (OCT) e manter-se congeladas a -80 ° C até à sua utilização.
    4. Incorporar tecido do cólon humano da peça cirúrgica, em corte temperatura outubro composto ideal e manter congeladas a -80 ° C até à sua utilização.
    5. Os cortes histológicos de 7 um de espessura dos espécimes embebidos em OCT-compostos com a ajuda de um cryoto-me apenas antes do exame.
      NOTA: A espessura da amostra óptima depende da persistência e as propriedades de dispersão do tipo de tecido sob investigação. Para os experimentos descritos utilizando tecido do cólon, espessura de corte> 10 mm causa aumento significativo de ruído devido à dispersão da luz em imagens quantitativos de contraste de fase DHM, enquanto as amostras de espessura <5 mm mostrar um maior risco de danos induzidos artefatos do processo de corte de crio.
    6. Transferir seções para um slide transportadora objeto de vidro.

3. Equipamento Técnico, Software e Procedimentos de Aquisição e Avaliação de hologramas digitais

  1. microscópio holográfico digital para celular quantitativa e tecidual
    1. Usar um sistema de microscopia de fora do eixo de Mach-Zehnder, holográfico digitais para imagens de células vivas 25, como mostrado na Figura 1. Assegurar que o microscópio é equipado com uma10X lente do microscópio, um estágio de microscópio com um suporte para slides transportador de objectos de vidro e placas de Petri com um diâmetro de 35 mm, com uma câmara de aquecimento para preservar temperatura fisiológica a 37 ° C e software para imagiologia quantitativa de fase 25.
      NOTA: Por exemplo, tal como descrito em Kemper et al 26 e 27 de Langehanenberg et ai...
      NOTA: Como alternativa, use um sistema semelhante, que é capaz de realizar microscopia de campo brilhante e imagiologia fase quantitativa de células vivas e lâminas de tecidos dissecados.
    2. Lente de microscópio limpa e condensador com papel de limpeza de lentes e um agente de limpeza (por exemplo, etanol), como recomendado pelo fabricante do microscópio para remover a poeira ou outras contaminações.
    3. Inicie o software de aquisição de imagem do microscópio DHM, selecione o modo "brilhante campo" imaging and switch "on" iluminação de luz branca. Certifique-se de Köhler-iluminção da amostra, tal como recomendado pelo fabricante microscópio, enquanto observando a amostra na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagem (em alternativa, um software de aquisição de imagem padrão pode ser utilizado neste passo).
      NOTA: A intensidade da imagem devem ser homogeneamente distribuído no campo de visão e a posição da amostra não devem mover-se durante a reorientação óptico com a unidade de focagem do microscópio.
    4. Selecione o modo "DHM" imaging, vire "off" iluminação de luz branca e interruptor "on" a luz do laser. Verificar que a iluminação com luz laser é homogénea (isto é, que a intensidade da luz é homogeneamente distribuída na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagens do microscópio DHM) e observa-se que o transportador padrão de interferência franja fora do eixo aparece com contraste adequado na imagens capturadas (hologramas digitais).
  2. Preparação de secções de criostato para imagiologiacom DHM
    1. Aqui o (secção criostato num transportador objeto de vidro, espessura: 7 ^ M, tal como descrito em 2.3) da amostra para fora do congelador. Descongelar a amostra para cerca de 5 min a RT e atmosfera normal.
    2. Adicionar 50 - 100 ul de fosfato salina tamponada (PBS) como meio para incorporação da secção de tecido, utilizando uma pipeta até que esteja completamente coberto com tampão. Cobrir a amostra com uma lamela de vidro limpo (espessura de vidro de 170 mm).
      NOTA: Over-secagem pode induzir alterações significativas do índice de refracção e propriedades dispersivas da amostra.
    3. Certifique-se de que a parte inferior do suporte de vidro e a lamela de cobertura são limpos da poeira e outros contaminantes, que podem induzir a dispersão de luz. A amostra está pronta para a investigação com microscopia de campo brilhante e DHM.
  3. imaging fase quantitativa das secções de tecido com DHM
    1. Ligue o microscópio holográfico digitais, escolha a lente do microscópio 10X para a imagem latente. Inicie o isoftware de aquisição de mago do microscópio DHM e selecione o modo de imagem de arquivo brilhante.
    2. Coloque o slide tecido como descrito em 2) no suporte da lâmina de microscópio, com a lâmina de cobertura de frente para a objetiva do microscópio.
    3. Interruptor "on" a iluminação brilhante campo do microscópio DHM. Posicionar a amostra com o microscópio de fase e assegurar que a área de tecido de interesse é visível na janela de monitorização em directo. Melhorar a nitidez da imagem usando a unidade foco do microscópio.
      NOTA: Como bem como a área de interesse, uma área de corrediça sem tecido também deve estar presente no campo de visão.
    4. Capturar uma imagem de campo claro da amostra nitidamente focadas utilizando o software de aquisição de imagem.
    5. Selecione o modo "DHM" imaging, vire "off" a iluminação de luz branca e vire "on" a iluminação de luz laser. Selecione o "tempo de exposição" para a gravação holograma abaixo de 3 ms, observamos que holographic fora do eixo franjas de interferência aparecem com contraste adequado na janela de imagem ao vivo do programa de aquisição de imagens e capturar um holograma digital.
    6. Repita os passos 3.3.3 - 3.3.5 até que um número suficiente de imagens de campo brilhante e hologramas digitais de diferentes áreas de amostra foram registrados. aquisição holograma está concluída.
  4. Preparação de ensaios de cicatrização de feridas para imagiologia DHM
    1. Ligar a câmara de aquecimento placa de Petri com o microscópio sobre DHM 1-3 h antes do início da experiência para assegurar condições de temperatura estáveis ​​durante as medições DHM.
    2. Prepare bancada com o equipamento necessário (placa de Petri para o ensaio de cicatrização da ferida é descrito em 2.3): pipetas, pinças, tampa de vidro para uma placa de Petri, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tamponada com meio de cultura de células com soro fisiológico temperatura (37 ° C) durante a preparação da amostra em ambiente estéril.
      NOTA: de NaHCO3.
    3. Remover a tampa de plástico a partir da placa de Petri e remover o meio de cultura de células com uma pipeta. Remova a inserção da parte inferior placa de Petri, usando uma pinça.
    4. Lava-se a amostra com 1 - 2 vezes com 1 ml de tampão HEPES meio de cultura celular, a fim de remover as células mortas e as restantes componentes celulares (por exemplo, soro) na área da ferida. Adicione 2 ml de HEPES meio de cultura celular tamponado e tampar a placa de Petri com a tampa de vidro.
    5. Certifique-se de que a tampa de vidro e parte inferior placa de Petri foram limpos de poeira e outra contaminação. A amostra está pronto para observação de lapso de tempo com DHM.
  5. Monitorização contínua multimodal de cicatrização de feridas in vitro com DHM
    1. Ligar a câmara de aquecimento placa de Petri com o microscópio sobre DHM 1-3 h antespara o início da experiência para assegurar condições de temperatura estáveis ​​durante as medições DHM.
    2. Interruptor "on" o microscópio holográfico digital, seleccione a lente 10X microscópio para a imagem latente. Inicie o software de aquisição de imagem do microscópio DHM e selecione o modo de imagem "brilhante campo". Assegure-se que a câmara de aquecimento para a placa de Petri está a funcionar a uma temperatura fisiológica (37 ° C).
    3. Colocar a placa de Petri com o ensaio de cicatrização da ferida, preparado como descrito em 4), na câmara de aquecimento do microscópio DHM.
    4. Selecione o modo de imagem de campo claro e posicionar a amostra com o estágio do microscópio, observando-lo na janela de monitoramento ao vivo do software de aquisição de imagem do microscópio DHM. Observa-se que a área desejada da amostra aparece focalizada nitidamente sob iluminação de luz branca.
    5. Capturar imagens brilhantes de campo de diferentes áreas da amostra do (área ferida e áreas circundantes com células confluentes) sob brancoiluminação de luz com o software de aquisição de imagem e o aspecto do documento, a densidade celular e a homogeneidade.
    6. Selecione o modo de imagem "brilhante campo" do microscópio DHM. Escolha uma área ferida adequado sob iluminação de luz branca na janela de monitoramento ao vivo com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM. Verifique se a área da ferida está livre de células mortas e sem restos de soro, e garantir que ambos os lados incluem uma camada de células homogénea única, de preferência com bordas retas.
    7. Capturar uma imagem de luz branca da área da ferida inicial no modo de imagem de campo claro com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM.
    8. Turn "off" iluminação de luz branca, selecione o modo "DHM" e interruptor "on" iluminação laser. Escolha um tempo de exposição de abaixo de 3 ms para gravar holograma (observar que fora do eixo holográfica franjas de interferência aparecem com contraste adequado na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagens de tele DHM microscópio) e capturar um holograma digital.
    9. Capturar um holograma exemplo em modo DHM com o software de aquisição de imagem e reconstruir uma imagem quantitativa fase com o software de reconstrução do microscópio DHM, a fim de verificar a qualidade da imagem.
    10. Seleccionar um intervalo de tempo adequado (por exemplo, 3-5 minutos) para aquisição holograma lapso de tempo com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM.
    11. Selecione o modo de aquisição de lapso de tempo do software de aquisição de imagem em que a amostra só é iluminado com luz laser durante a aquisição de holograma.
    12. Comece a observação DHM lapso de tempo do ensaio a cicatrização de feridas.
    13. Parar a aquisição de lapso de tempo após o tempo pretendido, seleccionar o modo de imagem de campo claro e documentar a aparência final da amostra em imagens de luz branca.
  6. Reconstruir hologramas digitais de tecidos dissecados e determinar o índice de refracção médio como um parâmetro para a quantificaçãodensidade do tecido
    1. Reconstruir imagens fase quantitativa dos hologramas digitais de tecidos dissecados com o software do microscópio DHM, por exemplo, como descrito em Kemper et al. 26 e Langehanenberg et ai. 27.
    2. Determinar o contraste média fase Δφ em diferentes camadas de tecidos (epitélio, submucosa, estroma) em regiões adequadamente escolhidos de interesse (ROI) 19.
    3. Determinação do índice de refracção do meio de fixação por meio de um refractómetro ou, em alternativa, utilizando um valor adequado a partir da literatura. (valores de índice de refracção para a incorporação típica meios: água = 1,334 N 28, N tampão fosfato salino (PBS) 1,337 = 29, n = meio de cultura celular 1,337-1,339 29,30).
    4. Calcular os índices de refração de diferentes camadas de tecido a partir do contraste de fase média de valores 19
      equação 1 NOTA: Na Eq. 1 λ é o comprimento de onda da luz do laser (aqui: λ = 532 nm), d a espessura dos tecidos dissecados (aqui: 7 pm) e n forma é o índice de refracção do meio de fixação (aqui: N PBS médio = N = 1.337, determinado por um Abbe-Refractometer).
  7. Reconstruir e avaliar hologramas digitais do lapso de tempo de cicatrização de feridas observação série
    1. Reconstruir imagens fase quantitativa da série lapso holograma tempo obtido durante a observação cicatrização de feridas com o software microscópio DHM 26,27.
    2. Normalizar cada série de imagens fase quantitativa da imagem com contraste de fase máxima.
    3. Determinar a área S c que é coberta pelas células nas imagens quantitativos fase DHM por segmentação da imagem, que pode ser porformada utilizando o profiler celular software livre (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calcula-se a média de contraste de fase de células a célula Δφ na área S C.
    5. Recuperar o DM massa seca celular da célula Δφ contraste de fase média na área S c 15
      equação 2 (2)
      NOTA: Na Equação 2 DM indica a massa seca celular, S c apresenta a área que está ocupada pelas células e α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Determinar o integral de refracção celular índice n celular e o índice de refracção do meio de cultura de células médio n. Determinar celular n separadamente experimentalmente a partir de células em suspensão, como descrito no 30 e medir meio de n com um refratômetro. Alternavamente usar os valores da literatura para a célula n 30 e n média 29,30.
    7. Calcula-se a média de espessura d de células a partir de células λ, Δφ célula, célula N e n forma 26,32
      equação 3 (3)
      NOTA: Na Eq. 3 a célula parâmetro d é a espessura média das células, λ denota o comprimento de onda de luz da luz laser, de células Δφ indica o contraste de fase média, e n celular e n forma são o índice de refracção celular integral e o índice de refracção do meio circundante.

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Representative Results

Configuração típica para DHM Imaging for Digital Holographic Microscopy (DHM)

Para realizar imagem de campo brilhante e as imagens de contraste de fase quantitativa DHM, aplicou-se um microscópio invertido, como representado na Figura 1 B. O sistema foi modificado por fixação de um módulo de DHM, conforme descrito anteriormente 25. Hologramas digitais foram gerados pela iluminação da amostra com a luz de um laser de Nd-frequência duplicada: YAG laser de λ = 532 nm) na configuração de Mach-Zehnder (Figura 1 A). Tecidos dissecados foram analisadas ex vivo em lâminas de suporte de vidro. Culturas de células vivas foram observadas em pratos de Petri especiais para a observação de cicatrização de feridas, como mostrado na Fig. 1 C. As amostras foram fotografadas em iluminação de transmissão por meio de um mi 10Xlente croscope (NA = 0,3) e um tubo de lente. Uma câmara de dispositivo de carga acoplada foi utilizada para registrar os padrões de interferência (hologramas fora do eixo digitais) gerados pela sobreposição da imagem de amostra (onda objeto) com a onda de referência ligeiramente inclinada. Os hologramas digitalmente capturados foram reconstruídos pela fase espacial deslocando reconstrução em combinação com opcional holográfica focagem automática 26,33.

Avaliação da colite induzida por DSS Murino por DHM

colite aguda foi induzida em ratinhos por administração de 3% w / v de sulfato de sódio de dextrano (DSS) na água para beber durante 5 dias. A manifestação e curso da colite foi seguida por monitorização para perda de peso progressiva no grupo tratado com DSS em comparação com o grupo de controlo. (Figura 2 Um adaptada a partir de 19). Endoscopia, moderada a severa colitis foi observada como reflectido pelo espessamento da parede do cólon, alterações do padrão vascular (por exemplo, hemorragia espontânea, seta vermelha), exsudação de fibrina (seta branca) e granularidade da superfície da mucosa (Figura 2B). Avaliação histológica convencional de hematoxilina e eosina (HE) seções do cólon revelou edema acentuado na parede do cólon de DSS-tratados versos animais de controle, predominantemente localizadas na submucosa (Figura 2 C seta cinza). Correspondente imagens de contraste de fase quantitativos DHM e mapas de índices de refração relacionados recuperados pela Equação 1, também descreveu as alterações teciduais acima mencionados. Além disso, o índice de refracção, codificado para 256 níveis de cinzento, revelou diferenças na densidade em camadas de tecido, incluindo o epitélio (seta branca) e estroma (seta preta) em amostras de tecido nativo, não coradas (Figura 2 C). O índice de refracção foi significativamente reduzida no epitélio, bem como na submucosa e estroma dos ratinhos col�icos em comparação com os controlos saudáveis ​​(Figura 2E). Além disso, uma correlação significativa entre os parâmetros clínicos (perda relativa de peso corporal) e o parâmetro físico absoluto (índice de refracção) poderia ser observado (R2 linear = 0,64; Figura 2 D, adaptada a partir de 19).

Avaliação da doença de Crohn em humanos através de DHM

A doença de Crohn é frequentemente identificada por alterações inflamatórias notáveis ​​da parede intestinal, detectadas por endoscopia gastrointestinal. características macroscópicas característicos compõem de granularidade da superfície da mucosa, úlceras longitudinais com exudat de fibrinaiões (também referido como "fugas") e caracol espontânea hemorragia (Figura 3 A). A avaliação histológica pela coloração HE de amostras de tecido de pacientes com doença de Crohn ativa muitas vezes revelam parede do cólon, bem como edema submucoso. Correspondente imagens de contraste de fase quantitativos DHM e mapas de índices de refração relacionados recuperados pela Equação 1 também detectou inflamatória mediada realce / inchaço da parede do cólon, visto aqui no epitélio (Figura 3 B). Além disso, o índice de refracção como um parâmetro absoluto, foi também significativamente reduzida em todas as camadas da parede (epitélio, submucosa e do estroma) em amostras de tecido do cólon de doentes com CD activa versos aqueles em remissão (Figura 3 C).

Monitorização Multimodal de cicatrização da ferida in vitro

células de Caco-2 a cicatrização de feridas ensaios foram realizados utilizando um prato de Petri especial para proporcionar condições padronizadas. O prato está equipada com uma inserção de cultura de formar duas câmaras diferentes, que são separadas por um intervalo de 500 mm (Figura 4 A). Para simular ambientes fisiológicos diferentes, as células foram examinadas quer sem tratamento, estimuladas pelo factor de crescimento epidérmico (EGF) ou inibida com mitomicina C. A configuração DHM permite a monitorização contínua da ferida processo ao longo do tempo de cicatrização, aqui representado por imagens representativas quantitativos DHM contraste de fase (codificadas a 256 níveis de cinza) após 0, 22,5 e 45 horas após o início do experimento (Figura 4 B). Correspondente falsas com códigos de cores parcelas pseudo 3D na Figura 5 ilustram o desenvolvimento espacial da espessura da camada de células em três dimensões. Com base no atraso comprimento do percurso óptico, o índice de refracção celular e as equações 2 e 3, DHM permite a avaliação dinâmica simultânea da migração, proliferação e morfologia, pelo controlo temporal características celulares, tais como a área de célula superfície coberta, a espessura média de células e de massa seca celular ( Figura 4 C). Em resumo, os dados na Figura 4 ilustram que a simulação de EGF resulta em uma migração mais rápida de células para dentro da área da ferida, num aumento da espessura média de células e em uma massa seca superior no campo de visão em comparação com células de controlo. Em contraste, células inibidas mitomicina C diminuiu ligeiramente cobrir uma área de superfície do que as células controlo, durante o curso da experiência e mostram também um aumento ligeiramente mais baixo massa seca. No entanto, a espessura média de células claramente aparece diminuiu em comparação com ambos, e células de controlo estimuladas.


Figura 1. Utilizado Setup fora do eixo para Digital Holographic Microscopy (DHM). Configuração esquemática da estação de trabalho DHM (A). Correspondendo fotografia que representa a configuração do microscópio (monitor, imagem ao vivo e software de controlo (1), fora do eixo configuração microscópio digital (2), (B), o trajecto óptico do microscópio (linha pontilhada verde) e uma amostra (indicado pelo vermelho arrow; (C)). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Avaliação da colite induzida por DSS Murino por DHM. O curso de colite foi seguido por mim diariamenteasurement de peso corporal relativa e exame repetido seguimento endoscópico. Um enorme perda de peso corporal relativa de 4 dias após o início da administração de DSS (adaptado a partir de 19) (A) foi acompanhada por sinais endoscópicos de colite estabelecida incluindo ulcerações focais e vulnerabilidade da mucosa (B). Análise de seções criostato em HE convencionais revelou edema submucoso, espessamento da túnica muscular e infiltrado inflamatório da mucosa pronunciada na mucosa. Correspondente imagens de contraste de fase quantitativos DHM e mapas de índices de refração relacionados recuperados pela Equação 1 (codificadas a 256 níveis de cinza) confirmou as alterações edematosas da submucosa durante o processo inflamatório (seta branca indica epitélio, submucosa cinza e estroma preto) (C). A perda relativa de peso corporal (um parâmetro clínico) significativamente correlacionados com o índice de refracção (um parâmetro físico absoluto, R 2 = 0,6 linear4; (D), adaptado a partir de 19), o qual foi significativamente reduzida no epitélio bem como na submucosa e estroma dos ratinhos col�icos comparação com os controlos saudáveis ​​(média ± SEM, *** P <0,001;. E) Ao clicar aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Avaliação da Doença de Crohn em humanos por DHM. Amostras de tecido do cólon de doentes com doença de Crohn confirmada por via endoscópica e histologicamente examinados foram (A). HE-coloração exibidos alongamento das criptas mucosas e um infiltrado de células inflamatórias marcado. Além disso, foi detectado edema da submucosa e do alargamento da muscular própria. Análise de corrm resposta imagens de contraste de fase quantitativos DHM e mapas de índices de refração relacionados recuperados pela equação (1) (codificadas a 256 níveis de cinza) também revelou alterações edematosas (aqui indicados por uma estrela branca e preta) no epitélio (B). Diferenças significativas no índice de refração média foram detectados em amostras de pacientes CD com alargamento ativa (barras claras) ou remissão (barras pretas). Estas diferenças são vistos em cada tipo de tecido (média ± SEM, *** P <0,001; C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Acompanhamento das epitelial cicatrização de feridas por White Light Microscopia e DHM. As células cultivadas foram transferred em placas de Petri com inserções especiais (seta vermelha). Antes de inserções de cultura foram removidos, as células foram tratadas com EGF ou mitomicina C, durante 24 h, ou tratados com meio sozinho (controlo não estimulado) (A). Após a remoção de inserções de cultura, a cicatrização de feridas foi continuamente monitorizada por meio de imagens de contraste de fase pelo DHM ao longo do tempo. contornos de células pode ser claramente reconhecido. Imagens de contraste de fase representativos quantitativos DHM são mostrados no início da experiência, após 22,5 horas e no final da medição após 45 horas (B). Painel (C) mostra as correspondentes alterações temporais na superfície coberta de células (S c), a espessura média de células (células d) e da massa celular seca (MS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 5. Ilustração de celular Camada Morfologia Alterações por Pseudo 3 Lotes D-coded falsa da cor do Quantitative DHM de contraste de fase Images. Representativos falsas com códigos de cores parcelas pseudo 3D das imagens de contraste de fase quantitativos DHM em Figura 4B em t = 0, depois de 22,5 horas e no final da medição após 45 h, ilustram o desenvolvimento espacial da espessura das camadas de células de controle-, mitomicina C-inibidas e as células estimulada por EGF em 3D. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós demonstramos que DHM fornece uma avaliação precisa dos danos histológico em modelos de colite murina e amostras de tecido do cólon humanos ex vivo. Além disso, temos mostrado DHM pode monitorar continuamente a cicatrização de feridas epiteliais e proporcionar simultaneamente informação multimodal sobre alterações celulares. Em DHM, a reconstrução de hologramas captadas digitalmente é realizada numericamente 32. Portanto, em comparação com a microscopia de campo claro, contraste de fase Zernike e microscopia de contraste de interferência diferencial, DHM fornece contraste de fase quantitativa, com opcional subsequente numérica foco de correção (de imagem multi-foco) 27. imagiologia quantitativa fase baseia-se na determinação das alterações de comprimento de caminho óptico e assim é altamente independente do dispositivo de medição utilizado. Isso simplifica a comparação dos dados de medição que são adquiridos com diferentes instrumentos. Além disso, DHM requer apenas baixa intensidade de luz para objeiluminação ct. Isto permite uma análise minimamente invasiva de tecidos dissecados não coradas e minimiza a quantidade de interacção da amostra necessária durante as observações de lapso de tempo de longo prazo de células vivas.

O arsenal terapêutico para o IBD tem significativamente ampliado ao longo dos últimos dois décadas. Para além da introdução de terapias anti TNF-α, que são eficazes tanto em UC e CD e têm perfis de efeitos secundários aceitáveis, novo e anticorpos especificamente dirigidos integrinas foram recentemente introduzidos na prática clínica 34-37. Vários outros agentes promissores estão actualmente a ser avaliados quanto à sua eficácia terapêutica na DII 38-40. No entanto, antes de a utilização clínica em seres humanos, a eficácia e segurança destes terapias potenciais tem de ser comprovado em estudos com animais. A colite induzida por DSS é um dos modelos de colite murina utilizadas com mais frequência, devido à sua alta reprodutibilidade e baixo custo 23. Além disso, este modelo pode alassim ser aplicada a camundongos geneticamente modificados cepas 41. Enquanto que os marcadores sistémicos, por exemplo, PCR, são altamente variável em modelos animais, a avaliação histológica do cólon representa a abordagem mais válido para avaliar a gravidade da doença 42,43. No entanto, a avaliação quantitativa de inflamação histológica de acordo com os sistemas de pontuação é altamente dependente da perícia investigador e experiência. Avaliação automática e pontuação por parâmetros objetivos quanto possível, com DHM supera estas limitações, e, além disso, é também economia de tempo, evitando a necessidade de coloração 19. Além disso, DHM pode ser usado para examinar amostras de cólon cirúrgicos, bem como amostras de mucosa obtidas durante a endoscopia.

regeneração epitelial e cicatrização de feridas é um mecanismo fundamental durante diversos estados patológicos incluindo úlceras gastrointestinais ou deiscência de anastomose. Enquanto estava lá são promissoras abordagens para avaliar a cicatrização de feridas epiteliais em vivo 44, estas técnicas requerem ferramentas de exame sofisticados e estão atualmente não é amplamente disponível. Por conseguinte, actualmente cicatrização do epitélio é comumente investigada através de ensaios in vitro de raspar 9. Estes ensaios permitir o exame válida do fechamento da ferida, mas geralmente exigem, primeiro, a coloração de células, que então impede repetida avaliação 10,45. Além disso, não há dados de alteração celular pode ser adquirido em paralelo com esta configuração experimental. No entanto, esta informação pode ser de importância significativa, uma vez que pode ser utilizada para diferenciar entre a apoptose e necrose 46 e para avaliar a proliferação e migração celular 46. Portanto, a possibilidade de determinar a espessura das células, massa seca ou a densidade do tecido simultaneamente ao monitoramento do fechamento da ferida por exame DHM é de alto valor na investigação da mucosa.

Os objetivos do tratamento para pacientes com DII humanos foram mudando constantemente nas últimas décadas <sup> 47. Embora inicialmente o controle da inflamação foi considerado para ser de primordial importância, mais tarde remissão esteróide-free e agora cicatrização da mucosa são os objetivos primários do tratamento 48. Recentemente, foi levantada a hipótese de que a remissão histológica pode mesmo ser superior a cicatrização da mucosa sozinho 49. No entanto, enquanto há alguns sistemas de pontuação histológicos disponíveis para IBD humana, a variabilidade inter-observador permanece elevada 50. Por conseguinte, existe uma necessidade de um método padrão para a avaliação de amostras histológicas do cólon. DHM pode contribuir para este objectivo e deve ser ainda avaliada em um ensaio clínico prospectivo, com pacientes com DII humanos.

No processo experimental apresentado, as amostras são iluminadas e fotografada usando luz laser altamente coerente. Portanto, a resolução em DHM é limitado principalmente por efeitos de dispersão e difração de luz causadas por desalinhamento da iluminação da amostra, amostras de espessura, pó ououtras impurezas, tais como água condensada no caminho óptico. A fim de alcançar os dados de medição de alta precisão a partir de imagens quantitativas fase DHM contraste, uma preparação cuidadosa e alinhamento da configuração DHM e da amostra são as etapas mais importantes do protocolo. Cuidadosamente limpos elementos de imagem óptico, em especial o objectivo de condensador do microscópio e microscópio, são necessárias para minimizar o ruído. Também as lâminas de amostra portador, tampa placa de Petri e no fundo, bem como o meio de cultura celular utilizada deve estar livre de impurezas em partículas. Isto é conseguido limpando cuidadosamente todos os componentes e filtragem adequada dos produtos líquidos.

resolução de problemas dicas mais detalhadas são as seguintes: se o holograma digital e / ou os quantitativos imagens de fase DHM de tecidos dissecados são barulhentos, o transportador de vidro e tampa de deslizamento pode ser contaminado com a poeira. Se assim for, limpe o suporte de vidro e cobertura de vidro com álcool (por exemplo, etanol puro). Se a espessuraness de tecido dissecado é muito grande (> 10 mm) e, portanto, resulta em espalhamento de luz, tente usar cortes de tecidos mais finos. No caso em que a iluminação com luz de laser não é homogeneamente distribuída, alinhar o objecto iluminação através do condensador microscópios. Se condensado de água na parte inferior da tampa de vidro induz efeitos de espalhamento, verificar a temperatura da câmara de aquecimento e humidade ambiente. No caso de a densidade de células é demasiado elevada ou crescimento celular em mais de uma camada, reduzir a densidade celular durante a preparação de ensaios de cicatrização de feridas. Finalmente, como DHM é baseado no princípio de interferometria, o método é sensível a vibrações mecânicas ou outras perturbações, que variam de acordo com o ambiente de laboratório individual. No entanto, tais influências geralmente pode ser minimizado por tempos de exposição adequadamente escolhida (normalmente na gama de milisegundos ou menos) para gravação de holografia durante a preparação da montagem experimental.

Em suma, Nossos resultados demonstram que DHM detém grandes vantagens sobre o campo brilhante e técnicas de microscopia de contraste de fase de imagem existentes, como o contraste de fase Zernike e DIC devido à sua capacidade de avaliar quantitativamente a inflamação histológica ex vivo de forma quase automática. Além disso DHM permite a avaliação multimodal contínua livre de marcador de reparação epitelial in vitro com interacção minimizada com as amostras. Isso abre o caminho para exame histológico automatizado em termos de '' patologia digital ', e mais estudos prolongados para explorar o potencial translacional de DHM em pacientes com DII. Além disso, oferece DHM novel in vitro oportunidades para estudar quantitativamente a migração celular, a morfologia e proliferação.

A tradução de DHM em prática clínica tem o potencial para melhorar o diagnóstico de IBD. Como DHM permite a quantificação de diferentes graus de inflamação intestinal atravésparâmetros físicos como mudanças de densidade, uma avaliação objectiva e mais preciso da doença no sentido de um "patologia digital" parece possível. A avaliação objetiva pode ter um impacto importante no manejo clínico de pacientes com DII.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

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