실크 나노 입자의 제조 및 약물 전달 응용 프로그램

이 절차의 전반적인 목표는 리버스 엔지니어링된 수성 실크 용액에서 실크 나노 입자를 제조한 다음 이러한 실크 나노 입자를 약물 전달 응용 분야에 사용하는 것입니다. 따라서 이 방법은 나노 침전을 활용하여 약물 전달과 같은 광범위한 응용 분야에 사용할 수 있는 실크 기반 입자를 생성했습니다. 이 기술의 주요 장점은 안정적이고 좁은 쪽 분포의 균일한 실크 나노 입자를 전달할 수 있는 단순성과 재현성입니다.

이 절차를 시작하려면 증류수 2리터를 끓입니다. 그런 다음 탄산나트륨 4.24g을 조심스럽게 넣는다. 다음으로, 가위를 사용하여 말린 고치 5g을 5mm x 5mm 크기로 자른다.

누에 고치 조각을 탄산나트륨 용액에 넣고 60분 동안 끓여 실크 섬유의 검을 제거하고 가끔 저어줍니다. 끓는 것이 완료되면 고무가 제거된 실크를 제거합니다. 증류수 1리터로 20분, 3회 세척합니다.

그런 다음 씻은 실크를 짜서 여분의 액체를 제거하고 실크를 손으로 풀고 흄 후드에 넣어 밤새 자연 건조시킵니다. 건조가 완료되면 50ml 비커 바닥에 공기 건조된 실크 섬유 5g을 단단히 포장합니다. 그런 다음 새로운 9.3몰 브롬화 리튬 용액을 준비합니다.

실크 1g당 4ml의 리튬 브로마이드를 첨가하여 실크를 리튬 브로마이드에 녹입니다. 증발을 방지하기 위해 비커를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 실크를 섭씨 60도에서 4시간 동안 녹이면서 가끔 저어줍니다.

용해가 완료되면 투석 카세트를 물에 5분 동안 적십니다. 그런 다음 실크-리튬 브로마이드 용액 15ml를 투석 카세트로 옮깁니다. 바늘과 주사기를 사용하여 기포를 제거합니다.

증류수 1리터에 대해 투석하십시오. 1시간, 3시간, 6시간마다 물을 갈아줍니다. 다음 날 아침과 저녁에 비커를 새 물로 교체하고 셋째 날 아침에 마지막으로 한 번 더

투석이 완료된 후에, 9, 5 섭씨 온도에 20 분 동안 500 시간 g에 카세트 및 분리기에서 실크 해결책을 모으십시오. 상층액을 회수하고 원심분리를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실크 용액의 총 건조 중량과 농도를 제거, 건조 및 결정합니다.

다음으로, 아세톤에 5% 중량/부피 실크 용액을 적하 방향으로 첨가하여 아세톤 부피당 부피 농도를 75 이상으로 유지합니다. 원심분리 중에 튜브가 무너지지 않도록 튜브를 완전히 채웁니다. 48, 4 섭씨 온도에 2 시간 동안 g 48, 000 시간에 침전물을 원심 분리하십시오.

주걱으로 펠릿을 제거하고 증류수 20ml를 넣으십시오. 피펫 팁을 사용하여 주걱에서 펠릿을 제거하고 20초 동안 와류로 가열합니다. 그런 다음 30% 진폭의 초음파 프로브를 사용하여 펠릿을 30초 동안 두 번 초음파 처리합니다.

초음파 처리가 완료되면 증류수로 원심분리기 튜브를 최대로 채웁니다. 원심분리와 재현탁을 최소 2회 이상 반복합니다. 그런 다음 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Doxorubicin 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 2밀리리터의 0.2마이크로몰 독소루비신 용액을 2밀리리터 튜브에 10, 30 또는 50밀리그램의 실크 나노입자 200마이크로리터와 혼합합니다. 실크-독소루비신 현탁액을 회전 믹서에서 실온에서 밤새 배양합니다.

약 선적이 완료된 후에, 194, 30 분 동안 000 시간 g에 현탁액을 분리기. 독소루비신이 함유된 실크 나노 입자를 증류수로 세척하고 원심분리를 두 번 반복합니다. 다음으로 상등액을 당기고 총 부피를 기록하십시오.

200 마이크로 리터의 상등액을 검은 마이크로 타이터 플레이트에 피펫팅합니다. 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 여기 파장을 485나노미터로, 방출 파장을 590나노미터로 설정하고 형광 값을 기록합니다. MDA-MB-231 세포를 배양하고 파종한 후 자유롭게 확산되는 독소루비신, 실크 나노입자 및 독소루비신이 로드된 실크 나노입자를 각각의 96웰 플레이트에 첨가합니다.

그런 다음 72시간에 MTT를 첨가하여 세포 생존율과 절반 최대 억제 농도를 측정합니다. 5시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 피펫으로 우물을 조심스럽게 배수하십시오.

100 마이크로 리터의 디메틸 설폭 사이드를 첨가하여 포르마잔을 용해시킵니다. 흡광도 마이크로플레이트 리더를 사용하여 560나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 세 가지 독립적인 실험을 위해 이 데이터를 수집합니다.

이 절차에서 실크 나노 입자는 Bombyx mori 고치에서 제조됩니다. 독소루비신은 약물 로딩 및 체외 세포독성 연구를 위한 임상적으로 관련된 화학요법 모델 약물로 사용됩니다. 2, 6 및 10 밀리그램의 실크 나노 입자에 대한 독소루비신 캡슐화 효율에 대한 대표적인 결과는 여기에서 볼 수 있습니다.

약물이 적재된 실크 나노 입자가 독소루비신을 전달하고 암세포를 죽이는 능력은 인간 유방암 MDA-MB-231 세포를 대상으로 시험관 내에서 평가되었습니다. 0.1마이크로그램의 동등한 약물 용량에서 자유롭게 확산되는 독소루비신과 독소루비신이 적재된 실크 입자는 세포 생존율을 현저히 감소시킵니다. 자유롭게 확산되는 독소루비신(Doxorubicin)은 세포 흡수의 차이로 인해 적재된 실크 나노입자보다 더 큰 세포 독성을 보여줍니다.

정량적 측정은 정성적 주사-전자-현미경 이미징에 의해 확증됩니다. 대조군 배양은 더 높은 세포 밀도와 우세한 중간엽 표현형을 보여줍니다. 실크 나노 입자에 노출 된 배양물에서도 유사한 결과가 나타납니다.

비신에 노출된 배양은 광범위하고 퍼져 있는 형태를 가진 현저하게 다른 표현형을 보여줍니다. 자유롭게 확산되는 독소루비신 또는 독소루비신이 적재된 실크 나노 입자에 노출되면 세포 수가 크게 감소합니다. 따라서 한 명의 마스터가 엔지니어링 실크 솔루션을 제공하고 3일 이내에 배송할 수 있습니다.

그리고 실크 나노 입자는 하루 이내에 제조 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 경우 나노 침전 및 시료 정밀 검사를 보장하기 위해 아세톤 내성 원심 분리기를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 원심분리 중에 무너지지 않도록 원심분리기 튜브가 완전히 채워졌는지 확인하십시오.

이 비디오를 시청한 후에는 리버스 엔지니어링 실크 용액을 제조하고 이를 사용하여 좁은 분포를 가진 균일한 실크 나노 입자를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.