सरल और कुशल उत्पादन और माउस Myelin Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन की शुद्धि प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis अध्ययन के लिए

Immunology and Infection

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Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

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Abstract

Introduction

एमएस एक मानव रोग जीर्ण सूजन और सीएनएस जो एक autoimmune प्रतिक्रिया माइलिन की ओर निर्देशित द्वारा संचालित होने लगा है की neurodegeneration के द्वारा होती है। समय के साथ माइलिन और एक्सोन के नुकसान संज्ञानात्मक और मोटर समारोह 1 की क्रमिक गिरावट में परिणाम। "प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis" सीएनएस माइलिन की ओर निर्देशित autoimmune रोग के पशु मॉडल के लिए एक छाता शब्द है। मानव एमएस की तरह, EAE आम तौर पर कुछ मामलों में सीएनएस की प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की विशेषता है और, माइलिन रहित 2। हालांकि, डिग्री है जो किसी भी EAE मॉडल हिस्से में जैसा दिखता है मानव एमएस प्रजाति या तनाव का इस्तेमाल किया पर और अंतर्निहित विरोधी माइलिन autoimmune प्रतिक्रिया की जटिलता पर निर्भर करता है।

एंटी माइलिन औतोइम्मुिनित प्रयोगात्मक कई मायनों में प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन आज सबसे आम विधि का इस्तेमाल किया immunodominant सीडी 4 नकल उतार अमीनो एसिड की एक छोटी पेप्टाइड के साथ चूहों का टीकाकरण करने के लिए है 35-55) माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन से प्राप्त होता है, जो C57BL / 6 चूहों 3 में EAE प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, कुछ प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए यह बड़ा प्रोटीन एंटीजन और वास्तव में वहाँ छोटे पेप्टाइड के साथ टीकाकरण पर इस के लिए कई फायदे हैं साथ टीकाकरण के लिए वांछनीय या भी आवश्यक है। सबसे पहले, एमएचसी प्रतिबंध के कारण, लघु पेप्टाइड्स आमतौर पर स्ट्रेन के एक बहुत ही सीमित दायरे में ही प्रभावी रहे हैं, जबकि बड़े प्रोटीन या तो पूरी प्रोटीन या एक विशिष्ट डोमेन का प्रतिनिधित्व एंटीजन विभिन्न प्रजातियों में कई जन्मजात माउस उपभेदों में प्रस्तुति के लिए सामान्य रूप से कार्रवाई की जा सकती है या भी 4। दूसरा, एक बड़ा प्रोटीन प्रतिजन एक अधिक जटिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, लिम्फोसाइट से अधिक प्रकार को शामिल प्रतिजन मान्यता में उत्प्रेरण के बजाय limitin करने में सक्षम हैसीडी 4+ टी कोशिकाओं को जी प्रतिजन मान्यता। उदाहरण के लिए, उनके बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) के माध्यम से बी कोशिकाओं पूरे बजाय संसाधित प्रोटीन के साथ सीधे बातचीत। हम और दूसरों है कि बी कोशिकाओं MOG 35-55 टीकाकरण से सक्रिय MOG प्रोटीन 5 पहचान नहीं दिखाई है। बी कोशिकाओं हाल ही में मानव एमएस 6 में एक रोगजनक भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया के बाद से, EAE मॉडल है कि स्व-प्रतिरक्षित विकृति में बी कोशिकाओं को शामिल तेजी से महत्वपूर्ण हैं।

EAE प्रेरित करने के लिए बड़ा प्रोटीन एंटीजन उपयोग कर के लाभ के बावजूद, वहाँ इस तरह के प्रोटीन के लिए कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों रहते हैं। दरअसल, जबकि MOG 35-55 की तरह कम पेप्टाइड्स बहुत जल्दी और एक अपेक्षाकृत कम लागत पर संश्लेषित किया जा सकता, MOG प्रोटीन के लिए वाणिज्यिक विकल्प सीमित है और लागत काफी अधिक खरीद करने के लिए कर रहे हैं। फिर भी, वहाँ कई अभिव्यक्ति MOG बाह्य डोमेन उत्पन्न करने के लिए अनुसंधान समूहों के लिए उपलब्ध वैक्टर (MOG 1-125) स्वयं कर रहे हैं। Howeveआर, अभिव्यक्ति प्रणाली है कि हम साहित्य में पहचान की है के सभी पुराने प्रौद्योगिकियों कि जब से अधिक कुशल अभिव्यक्ति सिस्टम 7 के साथ प्रतिस्थापित किया गया है पर आधारित हैं। इसके अलावा, सबसे चूहे या मानव MOG 8 पर आधारित हैं। चूहों में autoimmunity के कुछ जांच के लिए, माउस MOG स्वप्रतिजन के आधार पर एक प्रतिजन बेहतर है। अंत में, सभी MOG आधारित प्रोटीन है कि हम पहचान की है, या तो वाणिज्यिक या अभिव्यक्ति वैक्टर के रूप में, फ्यूजन MOG 1-125 आधार करने के लिए अतिरिक्त अमीनो एसिड से युक्त प्रोटीन होते हैं। इन के रूप में अच्छी शुद्धि और आमतौर पर अन्य दृश्यों के लिए एक टैग है, जो एक समारोह के साथ के कई हम पहचान करने में असमर्थ थे शामिल हैं।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम माउस MOG बाह्य डोमेन thioredoxin युक्त प्रोटीन MOG 5 के नाम से जाना जाता जटिलता से निपटने के लिए एक टैग के लिए जुड़े हुए पर आधारित एक उपन्यास संलयन प्रोटीन उत्पन्न। टैग अनुक्रम भी शुद्धि और एक TEV प्रोटीज CLE के लिए एक 6xHis अनुक्रम में शामिलavage साइट अगर वांछित कि, सभी टैग दृश्यों का पूरी तरह हटाने के लिए अनुमति देता है। यह एकमात्र तरीका है कि हम शुद्ध MOG 1-125 प्रोटीन उत्पन्न करने के बारे में पता कर रहे हैं। प्रोटीन की अधिक मात्रा के उत्पादन को सुविधाजनक बनाने के लिए, MOG 1-125 अनुक्रम बैक्टीरियल अभिव्यक्ति के लिए कोडोन अनुकूलित किया गया था और MOG टैग संलयन प्रोटीन पीईटी-32 अभिव्यक्ति प्रणाली में डाला गया था। यहाँ, हम प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन उत्पादन और शुद्ध MOG टैग प्रोटीन, और शुद्ध MOG 1-125, गैर विशेष उपकरणों की सबसे इम्यूनोलॉजी प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध का उपयोग कर।

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Protocol

1. प्रोटीन प्रेरण

नोट: निम्न चरणों में, BL21 कोलाई बैक्टीरिया एक पालतू जानवर-32 MOG टैग संलयन प्रोटीन के लिए अनुक्रम युक्त वेक्टर के साथ बदल (देखें संदर्भ 5 और चित्रा 1) उच्च घनत्व के लिए बड़े हो रहे हैं और उसके बाद MOG टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं । कुल मिलाकर समय के लिए चित्र 2 देखें - ध्यान दें कि दिन हैं अनुमानित और वैकल्पिक रोक अंकों के प्रोटोकॉल में विख्यात हैं। शुद्ध पीईटी-32 MOG टैग वेक्टर डीएनए के साथ शुरू करते हैं, तो यह रासायनिक सक्षम BL21 में बदलने के लिए आवश्यक हो जाएगा , एम्पीसिलीन चयन का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है 9 कोलाई बैक्टीरिया। सफल परिवर्तन एक मानक वाणिज्यिक किट, प्रतिबंध के साथ पाचन के द्वारा पीछा का उपयोग कर चुना बैक्टीरिया से डीएनए सफ़ाई से इसकी पुष्टि की जा सकती है Age1 और Sac1 एक agarose जेल में 10 पर एक 424 बीपी बैंड का उत्पादन करने के लिए एंजाइमों।

    टैग ग्लिसरॉल स्टॉक के साथ के 5 मिलीलीटर टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस, 200 rpm पर रात भर यह सेते हैं।
  1. दो 1 एल Erlenmeyer अगले दिन के लिए तैयार करने में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बाँझ लेग शोरबा के 500 मिलीलीटर युक्त बोतल रखें।
  2. 1.2 चरण (अंतिम एकाग्रता 0.1 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन) से 500 मिलीलीटर लेग युक्त बोतल से प्रत्येक के लिए 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के 500 μl जोड़ें। लेग शोरबा के दो बोतल से प्रत्येक के लिए 1.1 कदम से रातोंरात संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5 घंटे के लिए या 0.6 की एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए ऊपर 200 आरपीएम।
  3. बोतल में से एक से एक 1 मिलीलीटर विभाज्य ले लो और यह एक अलग 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में हस्तांतरण। 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। टी 0 (पूर्व प्रेरण) के रूप में ट्यूब लेबल और फिर में बैक्टीरिया गोली डाल एक -20 डिग्री भविष्य सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पीएजी के लिए सी फ्रीजरई) विश्लेषण (धारा 8 और चित्रा 3 देखें)।
  4. 1 एम इसोप्रोपाइल β-D-1-thiogalactopyranoside, प्रत्येक संस्कृति फ्लास्क इसोप्रोपाइल β-D-thiogalactoside (IPTG) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। बोतल रात भर 75 rpm पर कमरे के तापमान पर 37 डिग्री सेल्सियस, 4 घंटे के लिए 200 rpm पर सेते हैं, तो।

2. फसल काटने MOG टैग प्रोटीन

नोट: इस स्तर पर, बैक्टीरिया MOG टैग प्रोटीन की बड़ी मात्रा में उत्पादन किया जाएगा। MOG टैग फसल, बैक्टीरिया पहले एक ट्राइटन X-100 बफर sonication के द्वारा पीछा में lysed रहे हैं। MOG टैग तब समावेश शरीर से जारी है और imidazole और guanidine साथ विकृत किया जाए, MOG टैग प्रोटीन युक्त एक कच्चे प्रोटीन समाधान में जिसके परिणामस्वरूप।

  1. 1.5 कदम से रात भर संस्कृतियों में से एक से एक 1 मिलीलीटर विभाज्य ले लो और यह एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में हस्तांतरण। 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। टब लेबलई टी ओ / एन (पोस्ट-प्रेरण) तो एक -20 भविष्य एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए सेल्सियस फ्रीजर (चित्रा 3) में बैक्टीरिया गोली डाल दिया।
  2. संस्कृतियों उच्च गति centrifugation के साथ समान रूप से लोगों के बीच 250 मिलीलीटर की बोतल संगत बांटो और इस बिंदु से आगे बर्फ पर इन रहते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 22,000 XG पर बैक्टीरियल कोशिकाओं गोली।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। -20 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल छर्रों स्टोर या कदम करने के लिए 2.4 जारी है।
  4. lysis बफर तैयार (0.1 मिलीग्राम / एमएल मुर्गी अंडे लाइसोजाइम, 0.1% ट्राइटन X (वी / वी) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में) ट्राइटन X-100 के 60 μl और 50 मिलीग्राम के 120 μl जोड़कर / एमएल मुर्गी अंडे लाइसोजाइम पीबीएस के 60 एमएल शेयर समाधान।
  5. Resuspend और lysis बफर के 30 मिलीलीटर के कुल में 2.3 कदम से जीवाणु छर्रों के सभी गठबंधन। एक दौर नीचे 50 मिलीलीटर उच्च गति centrifugation में सक्षम ट्यूब को यह मात्रा स्थानांतरण। 30 मिनट के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इस ट्यूब रखें। ऊष्मायन समय के दौरान, ट्यूब हिलादो बार कोशिकाओं resuspend।
  6. ऊष्मायन के बाद, 20 किलोहर्ट्ज़, आयाम 70%, नाड़ी पर बर्फ पर ट्यूब हस्तांतरण और sonicate समाधान 3 सेकंड पर 3 सेकंड, और दौर प्रति पांच दालों बंद नाड़ी। छह राउंड के लिए कुल समाधान Sonicate और समाधान दौर के बीच बर्फ पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 24,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और दोहराने 2.5-2.7 कदम एक बार। -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर या कदम 2.8 जारी है।
  8. एक (500 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris एचसीएल, 5 मिमी imidazole, पीएच 7.9) बफर NaCl के 0.8766 जी, Tris एचसीएल के 0.09456 जी, और एक 100 मिलीलीटर बीकर imidazole के 0.01021 ग्राम जोड़कर तैयार करें। एच 2 ओ जोड़ें जब तक मात्रा 28 मिलीग्राम तक पहुँचता है तो 7.9 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित। फिर, एक 100 मिलीलीटर का हल हस्तांतरण सिलेंडर स्नातक और एच 2 ओ जोड़ने जब तक मात्रा 30 मिलीग्राम है।
  9. बफर के 30 मिलीलीटर में कदम 2.7 से गोली Resuspend और 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान सेते हैं। इस समय के दौरानguanidine एचसीएल का 17.2 ग्राम वजन।
  10. 2.6 कदम के रूप में ही सेटिंग्स का उपयोग कर बर्फ पर समाधान Sonicate। तो फिर समाधान के लिए guanidine एचसीएल का 17.2 ग्राम जोड़ें। MOG टैग प्रोटीन solubilize के लिए 1 घंटे के लिए बर्फ पर इस सेते हैं।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 24,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और प्रोटीन शुद्धि जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला की दुकान।

3. प्रोटीन शुद्धीकरण

नोट: निम्न चरणों में MOG टैग प्रोटीन और क्षालन (उनकी टैग के माध्यम से) का आरोप लगाया निकल राल पर अवशोषण के 4 राउंड के माध्यम से शुद्ध हो जाएगा।

  1. बाद बफ़र करें:
    1. बफर बी (500 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris एचसीएल, 5 मिमी imidazole, 6 एम guanidine एचसीएल, पीएच 7.9) तैयार करें। NaCl के 5.844 जी, Tris एचसीएल की .6304 जी, imidazole की .0681 जी, और 114.64 जी guanidine एचसीएल एक 500 मिलीलीटर बीकर में जोड़े। तब एच 2 ओ जोड़ने जब तक यह 190 मिलीलीटर तक पहुँचता है और 7.9 पीएच को समायोजित करें। सोल स्थानांतरणएक 250 मिलीलीटर के लिए संविधान सिलेंडर स्नातक और एच 2 ओ जोड़ने जब तक मात्रा 200 मिलीलीटर है।
    2. क्षालन बफर (500 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris एचसीएल, 0.5 एम imidazole, 6 एम guanidine एचसीएल, पीएच 7.9) तैयार करें। NaCl के 5.844 जी, Tris एचसीएल की .6304 जी, imidazole की 6.808 ग्राम, और 114.64 जी guanidine एचसीएल एक 500 मिलीलीटर बीकर में जोड़े। एच 2 ओ जोड़ने जब तक यह 190 मिलीलीटर तक पहुँचता है और 7.9 पीएच को समायोजित करें। स्थानांतरण एक 250 मिलीलीटर का हल सिलेंडर स्नातक और एच 2 हे जोड़ने जब तक मात्रा 200 मिलीलीटर है।
    3. पट्टी बफर (500 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris एचसीएल, 100 मिमी EDTA, पीएच 7.9) तैयार करें। NaCl के 5.844 जी, Tris एचसीएल की .6304 जी, 40 मिलीलीटर 500 मिमी EDTA एक ​​500 मिलीलीटर बीकर में जोड़े। एच 2 ओ जोड़ने जब तक यह 190 एमएल तक पहुँचता है और 7.9 पीएच को समायोजित करें। स्थानांतरण एक 250 मिलीलीटर का हल सिलेंडर स्नातक और एच 2 हे जोड़ने जब तक मात्रा 200 मिलीलीटर है।
    4. प्रभार बफर (0.1 एम निकल सल्फेट) तैयार करें। एक 500 मिलीलीटर बीकर 5.257 जी निकल सल्फेट जोड़ें और एच 2 ओ जोड़ने जब तक यह 190 मिलीलीटर तक पहुँच जाता है (सतर्कता, निकल संभाल नहीं हैनिकल सल्फेट जब तक एक धूआं हुड के बाहर सल्फेट में एच 2 ओ को भंग कर दिया गया है)। एक बार निकल सल्फेट भंग कर दिया है, हस्तांतरण एक 250 मिलीलीटर का हल सिलेंडर स्नातक और एच 2 हे जोड़ने जब तक मात्रा 200 मिलीलीटर तक पहुँचता है।
  2. दो शंक्वाकार 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज 4500 XG (प्रत्येक ट्यूब में 5 मिलीलीटर) पर केंद्रत्यागी बलों बर्दाश्त करने में सक्षम ट्यूबों के बीच निकल राल के 10 मिलीलीटर विभाजित।
  3. चार्ज और निकल राल संतुलित करना:
    1. 40 मिलीलीटर एच 2 ओ राल युक्त प्रत्येक ट्यूब जोड़कर राल धो लें। एक घुमाव पर क्षैतिज नलियों रखना और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए आंदोलन करते हैं। एक बार जब 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 4500 XG पर समाप्त हो गया, अपकेंद्रित्र ट्यूब।
    2. pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें गोली परेशान से बचने के लिए। प्रत्येक ट्यूब प्रभारी बफर के 40 मिलीलीटर जोड़ें। एक घुमाव पर ट्यूबों स्थानांतरण और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आंदोलन करते हैं। एक बार जब 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 4500 XG पर समाप्त हो गया, अपकेंद्रित्र ट्यूब।
  4. वैकल्पिक: solubilized प्रोटीन कदम 2.11 में एकत्र की 150 μl ले लो और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण। पूर्व ऊष्मायन के रूप में ट्यूब लेबल और भविष्य एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इस फ्रीज (चित्रा 3, क्रूड MOG टैग)।
  5. शुद्ध MOG टैग प्रोटीन:
    1. पहली ट्यूब (चित्रा 2, ट्यूब 1) 3.3 कदम से निकल राल युक्त करने के लिए (40 मिलीलीटर, शून्य से छोटा सा नमूना 3.4 कदम में हटाया ~) कदम 2.11 से solubilized प्रोटीन की पूरी मात्रा स्थानांतरण, मिश्रण, और एक घुमाव पर क्षैतिज जगह 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 4500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। समाप्त होने पर, दूसरी स्थानांतरण सतह पर तैरनेवालानिकल राल की ट्यूब (चित्रा 2, ट्यूब 2) और पिछले चरण में वर्णित के रूप में सेते हैं। इस बीच में, 3 नीचे से 6 कदम ट्यूब 1 के साथ साथ जारी है।
    3. क्षालन बफर के 40 एमएल में ट्यूब 1 में निकल राल Resuspend और ट्यूब 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर क्षैतिज जगह है। फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 4500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    4. लेबल 'शुद्ध MOG टैग प्रोटीन' एक 250 मिलीलीटर की बोतल में eluted MOG टैग प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर इस बोतल रखें। प्रत्येक क्षालन कदम के साथ, इस बोतल में जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला पूल।
    5. पट्टी बफर के 40 मिलीलीटर निकल राल में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक घुमाव पर क्षैतिज जगह है।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 4500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, तो निकल राल पुनर्भरण 3.3 कदम के रूप में सूचीबद्ध।
    7. समाप्त होने पर, दूसरी ट्यूब के साथ आगे बढ़ने के 3.5 चरण में सूचीबद्ध के रूप में। 4 दौर के कुलकदम 2.11 से चार्ज निकल राल और क्षालन हालांकि प्रोटीन का सबसे ठीक हो जाएगी पर solubilized प्रोटीन के अवशोषण की है, अगर वांछित, अतिरिक्त प्रोटीन के अवशोषण और क्षालन की अतिरिक्त फेरे में बरामद किया जा सकता है।
  6. एक बार जब अवशोषण और क्षालन के चार (या अधिक) दौर पूरा कर रहे हैं, रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा शुद्ध प्रोटीन की दुकान। निकल राल 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 20% इथेनॉल समाधान के 40 मिलीलीटर में संग्रहित किया जा सकता है जब तक यह फिर से की जरूरत है।

4. प्रोटीन एकाग्रता को मापने

नोट: आगे बढ़ने से पहले यह शुद्ध MOG टैग धारा 3 में उत्पन्न प्रोटीन की मात्रा ठहराना करने के लिए जरूरी है कि यह मान प्रोटोकॉल के अंत में करने के लिए प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने की अंतिम मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। हम एक मानक ब्रैडफोर्ड परख यहाँ का वर्णन है। शुद्ध MOG टैग प्रोटीन की एकाग्रता क्रमानुसार dilut के वर्णक्रम absorbance की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता हैएक ज्ञात एकाग्रता में गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) की एक मानक वक्र के लिए एड MOG टैग प्रोटीन।

  1. एक 3 एल बीकर में 23 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड 8.2 ग्राम के लिए सोडियम एसीटेट जोड़कर 10x एसीटेट बफर बनाने और उसके बाद सोडियम एसीटेट भंग करने के लिए एच 2 ओ की 1.9 एल जोड़ें। स्थानांतरण एक एल 2 के लिए इस समाधान सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त है और जब तक मात्रा में पहुंचता है 2 एल फिर कमरे के तापमान पर एक 2 एल बोतल में स्टोर एच 2 ओ जोड़ें। एच 2 ओ के 900 μl को 10x एसीटेट बफर के 100 μl जोड़कर 1x एसीटेट बफर के 1 मिलीलीटर बनाओ
  2. कुओं G2-8 और G9 के लिए 60 μl के लिए 1x एसीटेट बफर के 30 μl जोड़कर dilutions के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली सेट करें। H2 और H3 के लिए 1x एसीटेट बफर के 48 μl जोड़ें।
  3. 1x एसीटेट बफर के 216 μl और अच्छी तरह से G1 में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए मानक के 54 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से: पंक्ति जी में बीएसए मानक के रूप में निम्नानुसार की प्रारंभिक धारावाहिक कमजोर पड़ने सेट करें। , अच्छी तरह से G2 को अच्छी तरह से G1 से 210 μl जोड़े मिश्रण अच्छी तरह से,और फिर अच्छी तरह से जी 3 करने के लिए अच्छी तरह से G2 के 180 μl जोड़ें। अच्छी तरह से जी -4 के लिए अच्छी तरह से जी 3 के 150 μL जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, और 30 μl अच्छी तरह से जी -8 तक प्रत्येक बाद अच्छी तरह से करने के लिए कम उनका कहना है की इस प्रवृत्ति जारी है। (समकक्ष कमजोर पड़ने कारकों की सूची के लिए 1 टेबल देखें)।
  4. कुओं A1, B1, और सी 1, और कुओं ए 2, बी 2, और सी 2 के लिए अच्छी तरह से G2 के 10 μl, और इतने पर करने के लिए अच्छी तरह से G1 के 10 μl हस्तांतरण से प्रत्येक कमजोर पड़ने की तीन प्रतियों के नमूने सेट करें। एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
  5. MOG टैग की dilutions की स्थापना करने के लिए, अच्छी तरह से एच 1 करने के लिए कदम 3.6 से शुद्ध MOG टैग प्रोटीन के 60 μl जोड़ें। अच्छी तरह से एच 2 के लिए अच्छी तरह से एच 1 से 12 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, तो अच्छी तरह से H3 करने के लिए अच्छी तरह से एच 2 के 12 μl जोड़ने, मिश्रण अच्छी तरह से (इस H1 में एक 1x कमजोर पड़ने, एच ​​2 में 1/5 कमजोर पड़ने, और H3 में 1/25 कमजोर पड़ने का उत्पादन) ।
  6. तीन प्रतियों के नमूने कदम 4.4 में वर्णित के रूप में, H1-H3 पंक्तियों डी, ई, एफ और कुओं के 10 μl हस्तांतरण से MOG टैग dilutions के लिए सेट करें।
  7. प्रोटीन परख डाई के 2 मिलीलीटर मिक्सएच 2 ओ के 8 मिलीलीटर के साथ अभिकर्मक ध्यान केंद्रित , एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करता है, तो उपलब्ध पंक्तियों ए, बी, सी, डी, ई, एफ और सभी प्रीलोडेड वेल्स को इस मिश्रण के 200 μl जोड़ें। प्रोटीन एकाग्रता पढ़ने से पहले एक सुई का उपयोग कुओं में किसी भी बुलबुले पॉप।
  8. डाई अभिकर्मक जोड़ने के 10 मिनट के भीतर, पंक्तियों ए, बी, सी, डी, ई, एफ और सभी कुओं में से 595 एनएम absorbance को मापने
  9. जहां 1-9 अनुरूप पदों का उपयोग पंक्तियाँ ए, बी, और सी एक मानक वक्र स्थापित करने के लिए 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1, 0.05, और 0 मिलीग्राम / एमएल बीएसए। इस वक्र के आधार पर, MOG टैग प्रोटीन की एकाग्रता MOG टैग के कमजोर पड़ने का सबसे अच्छा मानक वक्र फिट बैठता है कि का उपयोग कर की गणना। आमतौर पर, वहाँ जीवाणु संस्कृति यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने का 1 एल से MOG टैग प्रोटीन की 200 से 250 मिलीग्राम होगा।
    नोट: MOG 1-125 वैकल्पिक धारा 7 के प्रोटोकॉल के अंत में सूचीबद्ध करने के लिए यहां से आगे बढ़ना बनाने के लिए। अन्यथा, धारा 5 के लिए जारी है।

नोट: डायलिसिस धीरे-धीरे समाधान प्रोटीन refold करने के लिए अनुमति देने के लिए शुद्ध, विकृत MOG टैग युक्त से guanidine दूर करने के लिए किया जाता है। देखभाल के इस कदम के दौरान लिया जाना चाहिए के रूप में MOG ही बहुत अघुलनशील है, और जब तक इस thioredoxin टैग की मौजूदगी से सुधार हुआ है, यह अभी भी समाधान से बाहर आने की संभावना है। इसलिए, refolding धीरे-धीरे किया जाना चाहिए और एक अपेक्षाकृत कम MOG टैग एकाग्रता में।

  1. डायलिसिस शुरू करने से पहले, बफर बी (बफर बी 3.1 कदम के रूप में सूचीबद्ध किया जा सकता है) के साथ शुद्ध MOG टैग प्रोटीन पतला तक एकाग्रता MOG टैग की मात्रा धारा 4 में गणना पर आधारित है, 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर या उससे कम है।
  2. केंचुल डायलिसिस टयूबिंग की लगभग 30 सेमी कट और तीन बार से अधिक सांप की त्वचा के अंत तह और hemostat के साथ जोड़कर अंत clamping द्वारा एक ताला लगा hemostat के साथ एक छोर सुरक्षित। पतला के साथ केंचुल भरेंMOG टैग प्रोटीन तो उन्हें खुले अंत के बाहर मजबूर द्वारा केंचुल से हवाई बुलबुले को दूर (ट्यूब प्रति MOG टैग प्रोटीन की 60 से 90 मिलीलीटर के बीच)। अंत में, ट्यूब एक दूसरे लॉकिंग hemostat का उपयोग कर के दूसरे छोर सील।
  3. जब तक सभी MOG टैग प्रोटीन केंचुल डायलिसिस ट्यूबिंग में स्थानांतरित किया गया है दोहराएँ कदम 5.2 डायलिसिस ट्यूबिंग के अतिरिक्त वर्गों को भरने के लिए। सुनिश्चित करें कोई लीक कर रहे हैं।
  4. guanidine एचसीएल के 382.12 ग्राम वजन और एक 2 एल बीकर 4.1 चरण में बनाया 10x एसीटेट बफर के 100 मिलीलीटर जोड़कर 4 एम guanidine के साथ 1x एसीटेट बनाओ। एच 2 ओ के 0.5 एल बीकर में जोड़ें और guanidine एचसीएल भंग करने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार भंग, एक 1 एल का हल हस्तांतरण सिलेंडर स्नातक और एच 2 हे जोड़ने जब तक मात्रा में पहुंचता है 1 एल हर 2 snakeskins कि आवश्यक हैं के लिए यह नुस्खा दोहराएँ।
  5. इस प्रकार के रूप डायलिसिस प्रदर्शन करना: कदम 5.4 से 4 एम guanidine के साथ 1x एसीटेट बफर के 1 एल के साथ एक बड़ी बाल्टी (कम से कम 10 एल) भरें। ऊपर टी रखेंओ डायलिसिस बाल्टी में MOG टैग युक्त ट्यूबिंग, एक चुंबकीय हलचल पट्टी के लिए कमरे में जा के 2 वर्गों के तल में निर्बाध स्पिन करने के लिए। एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर एक 4 डिग्री सेल्सियस के कमरे में बाल्टी में डाल दिया और (यानी, उच्च सिर्फ तरल पदार्थ ले जाने के लिए पर्याप्त नहीं है) एक धीमी गति रोटेशन दर करने के लिए यह मोड़ पर:
    नोट: निम्न चरणों में धीरे-धीरे बफर में guanidine की मात्रा को कम करने के लिए प्रदर्शन करना। हलचल बार न्यूनतम के रूप में दिया जाता है, लेकिन रात भर के लिए छोड़ दिया जा सकता है। डायलिसिस 3 दिनों की एक न्यूनतम ले जाएगा, लेकिन यदि चाहें तो इस बढ़ाया जा सकता है। नियमित रूप से सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग बरकरार है और वह समाप्त हो जाती है सुरक्षित रूप से बंद हो जाती हैं बनाने के लिए की जाँच करें।
    1. बाल्टी बैठते हैं और 4-5 घंटे के लिए हलचल करते हैं।
    2. 1x एसीटेट बफर के 1 एल (100 मिलीलीटर 10x एसीटेट बफर और एच 2 ओ की 900 मिलीलीटर) प्रत्येक बाल्टी में जोड़े।
    3. दोहराएँ 5.5.1 और 5.5.2 बाल्टी में बफर के 4 एल की कुल के लिए 3 बार की कुल कदम।
    4. बाल्टी में बफर का आधा त्यागें और 1x एसीटेट बफर के 1 एल के साथ फिर से भरना (100 मिलीलीटर 10x एसीटेट बफर और एच 2 ओ, कोई guanidine) और ट्यूबिंग और हलचल पट्टी की स्थापना के 900 मिलीलीटर।
    5. दोहराएँ 5.5.1 और 5.5.2 कदम एक बार (यानी जब तक वहाँ बाल्टी में बफर के 4 एल की कुल है)।
    6. अंत में, ताजा 1x एसीटेट बफर के 4 एल के साथ बाल्टी में पूरे 4 एल मात्रा की जगह है और 4-5 घंटे के लिए हलचल करते हैं। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रोटीन एकाग्रता के दिन इस कदम है।
    7. ध्यान से refolded MOG टैग के साथ डायलिसिस टयूबिंग हटाने और बाल्टी बफर त्यागें।

6. ध्यान दे MOG टैग प्रोटीन

नोट: अंतिम चरण में, refolded MOG टैग प्रोटीन भंडारण के लिए काम कर कमजोर पड़ने के लिए केंद्रित है। MOG टैग बहुत अघुलनशील है, यह 5 मिलीग्राम / एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए। 1 पूरा Freund के adjuv के साथ: यह एकाग्रता 0.4 मिलीग्राम / एमएल MOG 35-55 पेप्टाइड, जो आमतौर पर चूहों (मिश्रित 1 में EAE प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ लगभग equimolar हैचींटी (सीएफए))। एकाग्रता प्रक्रिया के दौरान यह असामान्य प्रोटीन की एक छोटी राशि सफेद वेग के रूप में समाधान से बाहर आने के लिए नहीं है। अत्यधिक वर्षा हालांकि एक समस्या है।

  1. 5 मिलीग्राम / एमएल के एक MOG टैग एकाग्रता, धारा 4 में मूल्य की गणना के आधार पर लक्ष्य को हासिल करने के लिए अंतिम वांछित मात्रा की गणना।
  2. 1 के अनुपात: रेखा एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक पैन और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) 3350 और खूंटी 8000 एक 1 के साथ एल्यूमीनियम पन्नी को कवर किया। खूंटी 3350 इस मिश्रण में शामिल किया है के रूप में यह मदद कर सकते हैं एकाग्रता के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने के लिए और एक प्रभावी cyropreservative 11 है।
  3. एल्यूमीनियम पन्नी के शीर्ष पर केंचुल ट्यूबिंग (MOG टैग प्रोटीन के अंदर के साथ) रख दिया और खूंटी 8000 के साथ कवर कमरे के तापमान पर इस बैठते हैं और मात्रा की जांच नियमित रूप से जब तक मात्रा करने के लिए या नीचे का अनुमान अंतिम मात्रा के बराबर है (कदम में गणना 6.1), वास्तविक मात्रा अगले चरण में मापा जाएगा। पैन हो जाता है, एकाग्रता की प्रक्रिया के दौरान पानी के साथ oversaturated एल्यूमीनियम पन्नी और खूंटी 3350 और खूंटी 8000 के साथ एक ताजा पैन की स्थापना की।
  4. एच 2 ओ के साथ snakeskins के बाहर धोने और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक अलग कांच की बोतल के लिए MOG टैग प्रोटीन हस्तांतरण। मात्रा का ध्यान रखें प्रोटीन के रूप में यह सुनिश्चित करने के लिए मात्रा सही है स्थानांतरित किया है।
    1. मात्रा का अनुमान अंतिम मात्रा नीचे कम हो गया है, तो 1x एसीटेट बफर जोड़ने जब तक वांछित मात्रा तक पहुँच जाता है। मात्रा का अनुमान अंतिम मात्रा से ऊपर है, डायलिसिस ट्यूबिंग में वापस MOG टैग प्रोटीन हस्तांतरण और एकाग्रता के लिए जारी (6.2-6.3 कदम)।
    2. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (ट्यूब प्रति 0.5 मिलीग्राम) के बीच MOG टैग प्रोटीन वितरित की जरूरत तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नलियों की दुकान। सीएफए के साथ 1: EAE के लिए प्रेरित करने के लिए, इस खंड 1 मिश्रण।
  5. MOG टैग प्रोटीन के नमूने चरण 1 में ले लिया का उपयोग करने की अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल चलाएँ।4, 2.1, 3.4, 6.4 और कदम से शुद्ध MOG प्रोटीन।

MOG टैग TEV प्रोटीज का उपयोग करने से उत्पन्न 7. MOG 1-125 (वैकल्पिक)

नोट: यह वैकल्पिक कदम कदम 4. MOG 1-125 किसी भी अतिरिक्त टैग दृश्यों के बिना आवश्यक है, टैग दृश्यों TEV प्रोटीज का उपयोग कर हटाया जा सकता है (चित्रा 4) के अंत से जारी है। जहां तक हम जानते हैं, वहाँ कोई अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली शुद्ध MOG 1-125 पैदा करने में सक्षम है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि thioredoxin टैग के बिना, MOG 1-125 अत्यधिक अघुलनशील है और इस शुद्धि और हैंडलिंग के दौरान समस्या पैदा हो सकती है, और इस कारण के लिए टैग अगर बिल्कुल प्रयोगात्मक कारणों के लिए आवश्यक हटा दें। कई कदम शुद्ध MOG 1-125 उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं। MOG टैग पहले TEV प्रोटीज दरार बफर में dialyzed है। TEV प्रोटीज साथ पाचन के बाद, मात्रा बाद में शुद्धि सेंट के साथ सहायता करने के लिए कम हो जाता हैईपीएस, तो बफर बी में dialyzed, और फिर अपने-टैग युक्त टैग अनुक्रम निकल राल का उपयोग कर हटा दिया है। अंत में, प्रोटीन मात्रा निर्धारित है और शुद्ध MOG 1-125 अंतिम एकाग्रता के लिए केंद्रित है।

  1. 1.861 ग्राम EDTA, 44.4 छ Tris एचसीएल, और एक 2 एल बीकर 26.5 छ Tris जोड़कर 10x TEV दरार बफर (500 मिमी Tris एचसीएल, 5 मिमी EDTA) के 1 एल बनाओ। एच 2 ओ जोड़ें जब तक मात्रा 990 मिलीग्राम तक पहुँचता है तो EDTA भंग करने के लिए 8 पीएच को समायोजित करें। स्थानांतरण एक 1 एल का हल सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त की मात्रा और एच 2 ओ का उपयोग कर 1 एल तक लाना
  2. 0.5 मिलीग्राम के लिए कदम 3.6 से MOG टैग प्रोटीन पतला / बफर बी (एक ही बफर 3.1 कदम में वर्णित), अनुभाग में गणना की प्रोटीन की मात्रा 4. स्थानांतरण केंचुल डायलिसिस ट्यूबिंग को पतला MOG टैग प्रोटीन की 120 मिलीलीटर के रूप में वर्णित पर आधारित का उपयोग कर मिलीलीटर कदम 5.3 करने के लिए 5.2 में। मात्रा को बढ़ाया जा सकता है हालांकि TEV प्रोटीज की राशि MOG टैग प्रोटीन के सभी फोड़ना के लिए आवश्यक substa होगीntial।
  3. सिवाय 10x TEV दरार कदम 7.1 में किए गए बफर के साथ 10x एसीटेट बफर की जगह है, 5.5 कदम में सूचीबद्ध डायलिसिस प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. TEV दरार बफर में MOG टैग स्थानांतरण, अब एक नई 250 मिलीलीटर कांच की बोतल के लिए और डायलिसिस से वृद्धि की मात्रा की निगरानी। हर 2.85 मिलीलीटर MOG के टैग प्रोटीन बोतल को जोड़ा प्रति β-mercapto-इथेनॉल के 1 μl जोड़ें। (TEV प्रोटीज 1:10 TEV अप करने के लिए जोड़ा जा सकता है: MOG प्रोटीन अनुपात) MOG टैग प्रोटीन के हर 50 मिलीग्राम के लिए (5 मिलीग्राम / एमएल शेयर TEV समाधान) TEV प्रोटीज के कम से कम 1 मिलीग्राम जोड़ें और कमरे के तापमान पर सेते हैं, कम से कम 72 घंटे के लिए प्रकाश से रक्षा की।
    नोट: TEV प्रोटीज ऊष्मायन के अंत में, सफेद अवक्षेप कांच की बोतल के तल पर देखा जाना चाहिए।
  5. डायलिसिस टयूबिंग के लिए प्रोटीन के हस्तांतरण से पहले, जब तक प्रोटीन प्रोटीन कांच की बोतल के लिए चिपके से precipitates को रोकने के लिए भंग समाधान के लिए guanidine एचसीएल जोड़ें। के 150 μl स्थानांतरणएक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए इस समाधान और "TEV साथ MOG" के रूप में ट्यूब लेबल। भविष्य एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।
  6. कदम 5.3 करने के लिए 5.2 में सूचीबद्ध के रूप में डायलिसिस ट्यूबिंग में कदम 7.5 से तरल पदार्थ के सभी स्थानांतरण। एच 2 ओ के 2 एल के साथ एक बड़ी बाल्टी भरें और बाल्टी में डायलिसिस ट्यूब जगह। प्रकाश रात भर सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इस सेते हैं। यह कदम guanidine बाहर कमजोर करने के लिए जल्दी से घटित करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता और समाधान है कि प्रोटीन शुद्धि के साथ हस्तक्षेप करेगा से EDTA हटाने शुरू करने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है।
  7. डायलिसिस ट्यूबिंग में प्रोटीन ध्यान चरणों में सूचीबद्ध के रूप में 6.2 6.3 करने के लिए (छोड़कर केवल खूंटी 8000 उपयोग) ऐसा है कि समाधान के अंतिम मात्रा ~ 40 मिलीलीटर है। साथ एच 2 ओ डायलिसिस ट्यूबिंग धो और हटाने के किसी भी अवशिष्ट खूंटी 8000 अभी भी ट्यूबिंग से जुड़ी। मात्रा में यह कमी यह संभव निकल पुन युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पच प्रोटीन के सभी फिट करने के लिए बनाता हैपाप, 3.5 चरण में वर्णित है।
  8. Dialyze बफर बी को पचा प्रोटीन:
    1. बफर बी के 1 एल (29.22 छ NaCl, 3.152 छ Tris एचसीएल, 0.3405 जी Imidazole, guanidine एचसीएल के 573.18 जी, पीएच 7.9) के साथ एक बड़ी बाल्टी भरें।
    2. एक हलचल चुंबक के साथ बाल्टी में कदम 7.7 से पच प्रोटीन युक्त (5.5 कदम में अधिक से अधिक विस्तार में वर्णित) snakeskins रखें। एक हलचल प्लेट एक धीमी गति से हलचल करने के लिए सेट पर एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में बाल्टी में डाल दिया और snakeskins 5 या उससे अधिक घंटे के लिए dialyze करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. बाल्टी खाली और बफर बी के एक और 1 एल के साथ इसे फिर से भरना है और इस हलचल प्लेट एक धीमी गति से हलचल करने के लिए सेट पर 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में बैठते हैं और snakeskins 5 या उससे अधिक घंटे के लिए dialyze करने की अनुमति दें।
  9. के रूप में धारा 3 में विस्तृत, महत्वपूर्ण अंतर यह है कि cleaved टैग दृश्यों निकल राल से बाध्य हो जाएगा, समाधान में MOG 1-125 1-125 छोड़ने के साथ MOG प्रोटीन की शुद्धि प्रदर्शन करना। फिर, शुद्धि के 4 दौर हो जाएगाएक ही वॉल्यूम पर प्रदर्शन किया, लेकिन इस मामले में लक्ष्य शुद्धता में सुधार करने के बजाय, जितना संभव हो उतना प्रोटीन ठीक करने के लिए है। चित्रा 4 देखें।
    1. प्रोटीन शुद्धि कदम 3.1 में सूचीबद्ध बफ़र्स बनाओ
    2. 3.3 कदम के रूप में वर्णित निकल राल के दोनों ट्यूबों चार्ज।
    3. MOG 1-125 शुद्ध प्रोटोकॉल, 3.5 चरण में विस्तृत आवश्यक अपवाद है कि निकल टैग युक्त राल से eluate खारिज कर दिया है साथ द्वारा (भविष्य एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में eluate के 150 μl रखने के लिए) है, जबकि समाधान MOG 1-125 युक्त अंतिम उत्पाद के रूप में बनाए रखा है।
  10. MOG 1-125 प्रोटीन की एकाग्रता उपाय के रूप में धारा 4 में वर्णित है:
    1. कदम 4.2 और 4.4 में वर्णित के रूप में बीएसए मानक वक्र dilutions सेट करें।
    2. कदम 4.5 और 4.6 में वर्णित के रूप में MOG 1-125 के dilutions सेट करें। वैकल्पिक रूप से, यह एक बड़ी रेंज उत्पन्न करने के लिए मूल्यवान हो सकता हैdilutions (1x, 1/2, 1/4, 1/8 और, उदाहरण के लिए) के। 1x एसीटेट बफर और MOG 1-125 तदनुसार की मात्रा समायोजित करें।
    3. 4.7 4.9 करने के लिए कदम के रूप में वर्णित ब्रैडफोर्ड परख प्रदर्शन और MOG 1-125 उत्पन्न की मात्रा की गणना। उम्मीद की उपज लगभग 4 मिलीग्राम या उससे अधिक प्रोटीन होता है।
  11. डायलिसिस के माध्यम से MOG 1-125 refold guanidine के क्रमिक हटाने के द्वारा, धारा 5 में वर्णित है।
  12. ध्यान लगाओ MOG 1-125 प्रोटीन धारा 6 अंतिम एकाग्रता में वर्णित के रूप में 2.24 मिलीग्राम / एमएल, जो 5 मिलीग्राम / एमएल MOG टैग करने के लिए equimolar है होना चाहिए।

8. एसडीएस पृष्ठ जेल MOG टैग उत्पादन और पवित्रता की पुष्टि करने के लिए

नोट: नमूने कदम 1.4, 2.1, 3.4 से लिया, और 6.4 MOG टैग उत्पादन और पवित्रता पुष्टि करने के लिए मानक एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण कर रहे हैं। यह कदम MOG टैग या MOG 1-125 या तो के अंतिम शुद्धि के बाद किया जाना चाहिए।

    <li> एच 2 ओ के 2 मिलीलीटर Tris एचसीएल की 1.576 ग्राम जोड़कर एक 2x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर बनाने और 6.8 पीएच को निर्धारित किया है। Tris एचसीएल समाधान में 0.4 ग्राम एसडीएस जोड़ें और फिर एच 2 ओ जोड़ने जब तक मात्रा 7 मिलीलीटर तक पहुँचता है।
  1. Bromophenol एच 2 ओ के 10 मिलीलीटर के लिए नीले रंग की 0.2 ग्राम तब कदम 8.1 में किए गए समाधान के लिए इस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। अंत में, 2x एसडीएस पृष्ठ लोडिंग बफर खत्म करने के लिए ग्लिसरॉल के 2 मिलीलीटर जोड़ें। जब इस समाधान भंडारण, 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए और अप करने के लिए 3 महीने के लिए प्रकाश से बचाने के लिए।
  2. कदम 1.4 और 2.1 के साथ-साथ कदम 3.4 और 6.4 कमरे के तापमान पर से solubilized MOG टैग प्रोटीन से बैक्टीरिया के जमे हुए aliquots गला लें।
  3. प्रोटीन desalting स्तंभों के लिए प्रत्येक के 60 μl जोड़कर कदम 3.4 और 6.4 में एकत्र समाधान से लवण निकालें। निर्माता के निर्देशों का पालन प्रोटीन शुद्ध।
  4. β-mercapto-इथेनॉल के 20 μL कदम 8.2 में किए गए समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। दो बीएसी को यह 40 μl जोड़ेterial कदम 8.3 से छर्रों और कदम 8.4 से desalted प्रोटीन के लिए 60 μl और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इन सेते हैं।
  5. Tris के 5 ग्राम, 28.8 छ ग्लाइसिन, और 1 ग्राम एसडीएस बाहर वजन द्वारा 1x एसडीएस पेज चल रहे बफर बनाओ। एक 1 एल बीकर करने के लिए इन जोड़ें और सब कुछ भंग करने के लिए 500 एमएल एच 2 ओ जोड़ें। एक बार भंग, एक 1 एल का हल सिलेंडर स्नातक हस्तांतरण और एच 2 ओ के साथ भरने जब तक मात्रा 1 एल पहुँचता है
  6. एक जेल तंत्र में एक 12% polyacrylamide जेल सेट अप तो जेल तंत्र के लिए 1x एसडीएस पृष्ठ चल बफर जोड़ने है कि इस तरह से चल रहा है बफर सिर्फ जेल में कुओं के ऊपर से ऊपर है। कुओं में बफर चल रहा पांच बार प्रत्येक के 50 μl pipetting द्वारा जेल के कुओं धो लें।
  7. लोड पहले अच्छी तरह से में प्रोटीन सीढ़ी के 10 μl और कदम 8.5 अलग कुओं से उबला हुआ समाधान के 10 μl जोड़ें। 60 मिनट के लिए 115 वी पर जेल चला।
  8. तंत्र से जेल निकालें और एक छोटे कंटेनर को हस्तांतरण। conta भरेंशुद्ध एच 2 ओ के 100 मिलीलीटर के साथ INER और 8 मिनट के लिए एक धीरे घूर्णन मंच करने के लिए कंटेनर हस्तांतरण। 8 मिनट के बाद, पानी डंप और एच 2 ओ के साथ दो बार और अधिक जेल धोने
  9. एच 2 ओ कंटेनर से डंप और कंटेनर के लिए तेजी से दाग अभिकर्मक की 100 मिलीलीटर जोड़ें। यह एक धीरे घूर्णन मंच पर रात भर बैठने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर की अनुमति दें।
  10. तेजी से दाग अभिकर्मक डंप और कंटेनर के लिए एच 2 ओ के लगभग 100 मिलीलीटर जोड़ें। इस 8 मिनट के लिए एक घूर्णन मंच पर बैठने के लिए अनुमति दें। एच 2 ओ डंप और दो बार दोहराने एच 2 ओ धोने।
  11. छवि जेल coomassie नीले दाग के लिए एक इमेजर का उपयोग कर। एक बैंड के चारों ओर 31.86 केडीए (MOG टैग प्रोटीन) और 63.72 केडीए (MOG टैग dimers) में हल्की बैंड के लिए देखो।

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Representative Results

एक बार शुद्धि पूरा हो गया है, नमूने कदम 1.4, 2.1, 3.4 में एकत्र, और कदम 6.4 से अंतिम उत्पाद एक प्रोटीन जेल (चित्रा 3 ए) पर चलाया जाना चाहिए। MOG टैग पहला टी ओ / एन नमूने में एक 31.86 केडीए बैंड के रूप में प्रकट करना चाहिए, लेकिन 0 नहीं टी, और अंतिम शुद्ध उत्पाद में केवल बैंड होना चाहिए। कि क्या MOG टैग प्रोटीन सही ढंग से मुड़ा गया है परीक्षण करने के लिए, MOG टैग प्रोटीन FACS द्वारा MOG प्रोटीन विशिष्ट बी कोशिकाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक 1 के साथ लेबलिंग माउस लिम्फोसाइट द्वारा: उनकी टैग और एक fluorescently लेबल तृतीयक विरोधी IgG1 एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ MOG टैग की 1,000 कमजोर पड़ने, MOG-विशिष्ट बी कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है (चित्रा 3 बी)। वैकल्पिक रूप से, MOG टैग सीधे fluorophores संयुग्मित जा सकती पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के रूप में (द्वितीयक और तृतीयक एंटीबॉडी के लिए बाध्य बी कोशिकाओं से उत्पन्न)संदर्भ 5 में वर्णित MOG-विशिष्ट बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। के रूप में इन कोशिकाओं को सामान्य रूप से बहुत ही दुर्लभ 5 कर रहे हैं, जंगली प्रकार चूहों में MOG बाध्यकारी बी कोशिकाओं की पहचान करने की कोशिश कर यह आवश्यक है। IGH MOG चूहों एक भारी श्रृंखला Knockin है कि, जब एक उपयुक्त कापा प्रकाश श्रृंखला के साथ रखा, MOG के लिए विशिष्टता प्रदान की है। MOG टैग के बंधन IGH MOG बी कोशिकाओं के बीच बढ़ाया है के रूप में, इस बात की पुष्टि करता है कि इस प्रोटोकॉल एक ठीक से मुड़ा हुआ प्रतिजन उत्पन्न करता है। महत्वपूर्ण बात है, IGH MOG बी कोशिकाओं MOG निर्देशित EAE 12 के मॉडल में स्व-प्रतिरक्षित विकृति के लिए योगदान, पुष्टि है कि MOG टैग लाती दोनों टी और बी सेल औतोइम्मुिनित।

धारा 5 में वर्णित के रूप में प्रोटीन refold करने के लिए डायलिसिस शुरू करने से पहले, यह खंड में वर्णित के रूप में तालिका 1 में 4. एक ब्रैडफोर्ड परख के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं, एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए आवश्यक है चित्रा 5 में संक्षेप।

के रूप में 6 चित्र में दिखाया शुद्ध MOG 1-125 की पीढ़ी MOG टैग प्रोटीन को TEV प्रोटीज के अलावा अंततः MOG 1-125 और टैग अनुक्रम में MOG टैग प्रोटीन की दरार में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा पूरा किया है। इसके बाद निकल राल शुद्धि MOG को हटा टैग, टैग अनुक्रम, और TEV प्रोटीज अशुद्धियों अंततः शुद्ध MOG 1-125, जिसके परिणामस्वरूप के रूप में 6 चित्र में दिखाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: MOG टैग प्रोटीन (डांग एट अल 5 से अनुमति के साथ यहाँ दोहराया।।)।। रैखिक संरचना, और एमिनो एसिड और MOG टैग संलयन प्रोटीन के डीएनए दृश्यों। माउस MOG के बाह्य डोमेन के लिए डीएनए अनुक्रम (MOG1-125, नीले रंग में कम अनुक्रम) अभिव्यक्ति के लिए में बैक्टीरिया (काला कोडोन-अनुकूलित किया गया था)। इस क्रम संश्लेषित और डाला एक वेक्टर में thioredoxin और एक एस टैग MOG प्रोटीन 13,14 के नाम से जाना जाता जटिलता प्रतिक्रिया करने के लिए युक्त एक टैग के लिए एक एन टर्मिनल संलयन, साथ ही शुद्धि 15 के लिए एक 6x उनकी टैग बनाने के लिए किया गया था। एक TEV प्रोटीज दरार साइट टैग दृश्यों से MOG 1-125 अलग करती है। TEV की मध्यस्थता glutamine-164 और ग्लाइसिन-165 के बीच दरार एक विकल्प के लिए आम सहमति TEV दरार साइट का उपयोग कर 16 परिणाम सभी गैर-MOG अमीनो एसिड को हटाने में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: शुद्ध MOG टैग प्रोटीन का निर्माण करने के लिए आवश्यक कदम का अवलोकन करने के लिए।MOG टैग प्रोटीन उत्पन्न, MOG टैग प्रोटीन व्यक्त बैक्टीरिया उच्च घनत्व तो खंड 1 में सूचीबद्ध के रूप में एक रात में संस्कृति के बाद MOG टैग IPTG का उपयोग करते हुए व्यक्त करने के लिए प्रेरित करने के लिए बड़े हो रहे हैं, बैक्टीरिया lysed और pelleting की एक श्रृंखला के माध्यम से कर रहे प्रोटीन युक्त अंश कदम समावेश शरीर है, जो MOG टैग है, खंड 3. एक हिस्से में सूचीबद्ध के रूप में आरोप लगाया निकल राल और MOG टैग प्रोटीन की क्षालन पर अवशोषण के चार चक्र के माध्यम से खंड 2. MOG टैग सूचीबद्ध के रूप में तो क्रूड प्रोटीन अंश से शुद्ध होता है निकाला जाता है धारा 4 में सूचीबद्ध है और 5. अंत में, प्रोटीन केंद्रित है के रूप में की जमा eluate तो MOG टैग प्रोटीन की उपज और eluate के बाकी निर्धारित करने के लिए एक ब्रैडफोर्ड परख के लिए लिया जाता है कई दिनों के पाठ्यक्रम पर एसीटेट बफर में dialyzed है 5 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए खूंटी 3350 और खूंटी 8000 का उपयोग कर / एमएल बी में चुना गया MOG टैग की उपज पर आधारितरेडफोर्ड परख धारा 6 में सूचीबद्ध के रूप में पूरी प्रक्रिया कोष्ठक में दिखाया गया है प्रत्येक चरण के लिए शुरू दिन से 10 दिनों की एक न्यूनतम ले सकते हैं। हालांकि, विकल्प बंद करो और शुरू अंक प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध हैं, और कदम समय अगर वांछित की एक बड़ी राशि में फैला हुआ जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। MOG टैग प्रोटीन और अपनी गतिविधि के आकलन के शोधन (ए) में दिखाया गया है कि प्रोटीन के नमूने प्रोटीन शोधन प्रक्रिया भर में विभिन्न बिंदुओं से एकत्र की है और एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर चलाए जा रहे थे कर रहे हैं। टी 0 = BL21 बैक्टीरिया प्रोटीन प्रेरण (1.4 चरण में एकत्र) के लिए पहले, टी ओ / एन = BL21 बैक्टीरिया प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद प्रेरण (एकत्र2.1 चरण) में, क्रूड MOG टैग = solubilized MOG टैग प्रोटीन प्रोटीन शुद्धि (3.4 कदम में एकत्र), शुद्ध MOG टैग = MOG टैग प्रोटीन शुद्धि (कदम 6.4 में एकत्र करने के बाद) से पहले। (बी) या तो जंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों या IGH MOG चूहों कि एक इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला MOG प्रोटीन 7,17 के लिए विशिष्ट एक्सप्रेस से लिम्फ नोड्स से CD19 पीओएस CD4 neg भोली बी कोशिकाओं को MOG टैग प्रोटीन के बंधन प्रवाह cytometry का उपयोग मूल्यांकन किया गया था । MOG टैग विशिष्ट बी कोशिकाओं MOG टैग एक माध्यमिक विरोधी उसकी टैग एंटीबॉडी और एक फ्लोरोसेंट तृतीयक विरोधी IgG1 एंटीबॉडी द्वारा पीछा के साथ लिम्फ नोड कोशिकाओं धुंधला द्वारा की पहचान की गई। C57BL / 6 या IGH MOG चूहों से कोशिकाओं के धुंधला हो जाना एक MOG टैग प्रतिदीप्ति शून्य से IGH MOG कोशिकाओं में से एक (FMO) नियंत्रण दाग के साथ दिखाया गया है। ग कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ चाटना।

चित्रा 4
चित्रा 4: कदम का अवलोकन MOG 1-125 उत्पन्न करने के लिए MOG टैग प्रोटीन से। प्रोटोकॉल का 3.5 चरण में वर्णित के रूप में MOG टैग eluate इकट्ठा करने के बाद, MOG टैग प्रोटीन TEV प्रोटीज दरार बफर में dialyzed है। एक बार डायलिसिस पूरा हो गया है, TEV प्रोटीज MOG टैग समाधान MOG 1-125 प्रोटीन में MOG टैग की दरार में जिसके परिणामस्वरूप में जोड़ा जाता है। दरार समाधान की मात्रा कम हो तो और बफर बी प्रोटीन शुद्धि करने से पहले में dialyzed है। दरार समाधान से अशुद्धियों का आरोप लगाया निकल राल और दोष शुद्ध अंततः MOG का एक समाधान है, जिसके परिणामस्वरूप का क्षालन पर अवशोषण के लगातार चार राउंड के माध्यम से निकाले जाते हैं < उप> 1-125। MOG 1-125 प्रोटीन की एकाग्रता एक ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से निर्धारित किया जाता है और प्रोटीन कई दिनों के पाठ्यक्रम डायलिसिस के माध्यम से जोड़ रहा है। / एमएल खूंटी 3350 और खूंटी 8000 इस प्रोटोकॉल धारा 7 में विस्तार से चर्चा की है का उपयोग कर एक बार डायलिसिस पूरा हो गया है, MOG 1-125 प्रोटीन 2.24 मिलीग्राम के लिए केंद्रित है कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: MOG टैग की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक ब्रैडफोर्ड परख मानक वक्र का उदाहरण प्रोटीन। बीएसए मानक रीडिंग तालिका 1 से लिया MOG टैग 595 एनएम ऑप्टिकल घनत्व के आधार पर एकाग्रता की गणना के लिए एक रेखीय प्रतिगमन सूत्र प्राप्त करने के लिए साजिश रची थे।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। MOG टैग प्रोटीन की TEV दरार और MOG 1-125 के बाद शुद्धि दिखाया प्रोटीन के नमूने MOG 1-125 की एक एसडीएस पृष्ठ जेल प्रदर्शन शुद्धि पर चलाए जा रहे शुद्ध MOG टैग = MOG टैग प्रोटीन दरार TeV करने से पहले (एकत्र। में कदम 6.4), MOG टैग w / TEV = प्रोटीन अंश कि TEV प्रोटीज साथ MOG टैग की ऊष्मायन के 72 घंटे के बाद एकत्र किया गया था (कदम 7.5), क्षालन = प्रोटीन अंश कि MOG 1- दौरान निकल राल के लिए बाध्य बनी में एकत्र 125 शुद्धि प्रोटोकॉल (कदम 7.9 में एकत्र), शुद्ध MOG 1-125 = MOGशुद्धि (कदम 7.12 में एकत्र) के बाद 1-125 प्रोटीन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बीएसए (मिलीग्राम / एमएल) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1.079 0.998 0.948 0.853 0.769 0.699 0.583 0.493 0.373
1.071 1.014 0.95 0.854 0.777 0.681 0.579 0.484 0.375
1.069 1.017 0.944 0.848 0.781 0.592 0.494 0.374
MOG टैग कमजोर पड़ने 1 1/5 1/25
1.327 1.013 0.493
1.332 1.063 0.491
1.367 1.088 0.488

तालिका 1: MOG टैग प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक ब्रैडफोर्ड परख से प्रतिनिधि मूल्यों बीएसए Dilu।ज्ञात सांद्रता में माहौल मानक वक्र चित्रा 5 में दिखाया गया MOG टैग प्रोटीन पोस्ट शुद्धि के dilutions अंतिम MOG टैग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है। पंक्तियाँ ऑप्टिकल 595nm पर मापा घनत्व होते हैं और प्रत्येक पंक्ति के प्रत्येक संकेत दिया एकाग्रता में 3 प्रतिकृति की कुल में से एक को दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है।

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Discussion

यहाँ, हम MOG टैग प्रोटीन और कैसे MOG टैग प्रोटीन से शुद्ध MOG 1-125 उत्पन्न करने के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल मानक उनकी टैग आधारित प्रोटीन शुद्धि के तरीकों, साथ ही एक पुराने MOG आधारित प्रोटीन 15 की पीढ़ी के लिए एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल पर दोनों आधारित है। हालांकि यह यहाँ वर्णित नहीं है, MOG टैग प्रोटीन का प्राथमिक उपयोग के प्रोटीन प्रतिजन के साथ टीकाकरण के माध्यम से EAE प्रेरित करने के लिए है। कैसे EAE चूहों, जो MOG टैग प्रोटीन के साथ संगत है में प्रेरित किया है वर्णन प्रोटोकॉल, संदर्भ 3 में पाया जा सकता है। हम पहले से दिखा दिया है कि MOG टैग या MOG 1-125 MOG टैग से व्युत्पन्न के साथ टीकाकरण न केवल लाती मानक MOG 35-55 पेप्टाइड की तुलना में अधिक से अधिक रीढ़ की हड्डी में सूजन और माइलिन रहित साथ सीएनएस ऑटोइम्यून रोग है, लेकिन यह भी कि रोगजनक IGH MOG बी कोशिकाओं Thaटी को पहचान MOG प्रोटीन MOG टैग या MOG 1-125 के जवाब में एक कीटाणु केंद्र प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए सक्रिय कर रहे हैं, लेकिन 35-55 5 MOG के लिए नहीं। इसलिए, MOG टैग के साथ टीकाकरण वास्तव में एक उचित विरोधी MOG बी सेल प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित करता है।

MOG टैग प्रोटीन का आरोप लगाया निकल राल पर अवशोषण (उनकी टैग के माध्यम से) और क्षालन के माध्यम से शुद्ध होता है। पिछले चरणों में उत्पन्न प्रोटीन की बड़ी मात्रा के कारण, अवशोषण और क्षालन के कई दौर प्रोटीन का सबसे इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हैं। हमने पाया है कि कम से कम 4 दौर प्रोटीन के बहुमत को अलग-थलग करने के लिए अगर 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए राल का एक उचित मात्रा का उपयोग आवश्यक हैं। अगर वांछित, प्रोटोकॉल अधिक या बड़ा ट्यूब और अधिक निकल राल का उपयोग करने के अवशोषण के दौर की संख्या को कम करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) निकल कॉलम के साथ प्रभावी ढंग से उनकी टैग प्रोटीन 18 <शुद्ध कर सकते हैं/ sup> और वास्तव में हमने पाया है कि एचपीएलसी कुशलता MOG टैग प्रोटीन (अप्रकाशित टिप्पणियों) को शुद्ध कर सकते हैं। एचपीएलसी कई मानक इम्यूनोलॉजी प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं है, यहाँ सूचीबद्ध प्रोटोकॉल आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग किया जा करने के लिए बनाया गया है। उसकी टैग शुद्धि के अलावा, MOG टैग प्रोटीन एक एस टैग है कि एस-टैग शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ संगत है को प्राथमिकता दी है, तो 14 को नियंत्रित करता है।

संयोजक MOG (ज्यादातर मानव या चूहा) पर आधारित प्रोटीन पहले 8 वर्णित किया गया है। इन पुराने अभिव्यक्ति प्रणाली है कि जब से मजबूत ट्रांसक्रिप्शनल कोलाई बैक्टीरिया में प्रोटीन की बड़ी मात्रा में उत्पादन में सक्षम प्रमोटरों द्वारा संचालित सिस्टम के द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है पर आधारित थे। हमारे MOG टैग अभिव्यक्ति प्रणाली पीईटी-32A (+) वेक्टर, जो MOG प्रोटीन 19 के घर में उत्पादन के लिए उपलब्ध प्रणालियों की तुलना में काफी अधिक कुशल है में कुशल T7 प्रमोटर उपयोग करता है। हालांकि, यह बातHould कि MOG टैग प्रोटीन यहाँ वर्णित माउस MOG पर आधारित है ध्यान दिया जाना। मानव MOG प्रोटीन के साथ टीकाकरण चूहों murine MOG 8 का उपयोग प्रेरित रोग की तुलना में अलग विशेषताएं है कि में EAE प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, चूहे MOG कुछ मामलों में 20 चूहों में माउस MOG की तुलना में अधिक immunogenic हो सकता है। इसलिए, कुछ प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए माउस-आधारित MOG टैग के लिए आदर्श नहीं हो सकता। बेहतर होगा कि हम कुछ प्रयोजनों के अनुरूप हो सकता से MOG टैग प्रोटीन के कई अलग अलग संस्करण पैदा करने की प्रक्रिया में हैं, और शुद्धि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इन सभी के लिए काम करेंगे। इस बीच में, यह है कि शुद्धि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य MOG अभिव्यक्ति प्रणाली, या यहां तक ​​कि अन्य प्रोटीन के लिए, के रूप में लंबे समय तक काम कर सकते हैं के रूप में वे निकल राल अवशोषण के लिए एक 6x उनकी टैग को शामिल संभव है। हालांकि, thioredoxin टैग के बिना, उच्च सांद्रता में MOG प्रोटीन की घुलनशीलता एक मुद्दा हो सकता है, और निश्चित रूप से यह जीई के लिए संभव नहीं होगा nerate इस रूप में शुद्ध MOG 1-125 MOG टैग प्रणाली के लिए अद्वितीय है।

प्रोटीन refolding करने से पहले MOG टैग प्रोटीन एकाग्रता डायलिसिस के माध्यम से मापने इस शुद्धि प्रोटोकॉल की सफलता के लिए आवश्यक है। एकाग्रता बहुत अधिक है, तो प्रोटीन समग्र और समाधान से बाहर व्यक्तिगत प्रोटीन में तह के बजाय गिर सकता है। यह सफेद वेग डायलिसिस टयूबिंग के नीचे के गठन के रूप में डायलिसिस प्रोटोकॉल के दौरान देखा जा सकता है। यदि यह हो रहा है, 6 एम guanidine के साथ फिर से MOG टैग प्रोटीन भंग करने और प्रोटीन एकाग्रता को मापने। 0.5 मिलीग्राम प्रोटीन पतला / तो डायलिसिस फिर से शुरू मिलीलीटर के रूप में कोई अवक्षेप / 0.5 मिलीग्राम पर फार्म चाहिए मिलीलीटर। MOG 1-125 के लिए, अवक्षेप प्रोटीन के रूप में अत्यधिक अघुलनशील है के रूप में करने की उम्मीद की जा सकती है। हमने पाया है कि इस बशर्ते कि प्रोटीन पर्याप्त रूप से डायलिसिस करने से पहले पतला था MOG 1-125 की तह को प्रभावित नहीं करेगा।

NT "> TEV प्रोटीज को प्रभावी ढंग से शुद्ध MOG 1-125 में MOG टैग प्रोटीन फोड़ना करने के लिए इसे TEV प्रोटीज की एक पर्याप्त राशि का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। TEV proteases के पुराने संस्करण आत्म दरार के माध्यम से निष्क्रिय कर रहे हैं 21 लेकिन अधिक आधुनिक संस्करण से पीड़ित जटिलता में 22 समस्याओं का इस प्रकार यह संदर्भ 22 में वर्णित के रूप में पहले TEV प्रोटीज निष्क्रियता MOG टैग प्रोटीन की पर्याप्त दरार को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त TEV प्रोटीज जोड़ने के लिए। के बाद से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TEV प्रोटीज महंगा हो सकता है, हम उत्पादन सलाह देते हैं और सफ़ाई TEV प्रोटीज महत्वपूर्ण है। उपयोग करते समय शुद्ध माउस MOG प्रयोगों के लिए 1-125 प्रोटीन, यह ध्यान दें कि प्रोटीन अत्यधिक अघुलनशील है और समाधान के बाहर वेग सकता है, और इसलिए बड़े पैमाने पर मिश्रित किया जाना चाहिए उपयोग करने से पहले जरूरी है।

सारांश में, यहाँ हम उत्पादन और MOG टैग प्रोटीन की बड़ी मात्रा में सफ़ाई के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। Furthermअयस्क, हमारे MOG टैग प्रोटीन के लिए एक TEV प्रोटीज दरार साइट के अलावा शुद्ध MOG 1-125 उत्पन्न करने के लिए अगर जरूरत अवसर प्रदान करता है। MOG टैग प्रोटीन मान्यता प्राप्त है और विरोधी माइलिन स्व-प्रतिरक्षित बी कोशिकाओं और MOG टैग प्रेरित EAE शामिल बी सेल की मध्यस्थता विकृति 5 से बाध्य है। इसलिए, MOG टैग प्रोटीन प्रोटीन प्रतिजन के व्यापक प्रसार उपयोग सीमित EAE प्रेरित करने के लिए प्रमुख बाधाओं पर काबू।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

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References

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