Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Immunology and Infection

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Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (120), e54756, doi:10.3791/54756 (2017).

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Abstract

correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica potente per studiare la diffusione delle molecole all'interno delle membrane biologiche con elevata risoluzione spaziale e temporale. FCS può quantificare la concentrazione e diffusione molecolare coefficiente di molecole marcate fluorescenza nella membrana cellulare. Questa tecnica ha la capacità di esplorare le caratteristiche di diffusione molecolare delle molecole nella membrana plasmatica di cellule immunitarie in stato stazionario (cioè, senza processi che influenzano il risultato durante il tempo di misurazione effettiva). FCS è adatto per studiare la diffusione di proteine ​​che vengono espresse a livelli tipici per proteine ​​più endogene. Qui, un metodo semplice e robusto per determinare la velocità di diffusione delle proteine ​​di membrana cellulare sui linfociti primari è dimostrata. Un modo efficace per eseguire misure su cellule vive colorate con anticorpo e osservazioni comuni che si verificano dopo l'acquisizione sono descritti. I progressi recentinello sviluppo di coloranti fluorescenti fotostabili può essere utilizzato coniugando anticorpi di interesse appropriarsi coloranti che non candeggiare ampiamente durante le misurazioni. Inoltre, questo permette la rilevazione di entità diffondenti lentamente, che è una caratteristica comune di proteine ​​espresse nelle membrane cellulari. La procedura di analisi per estrarre i parametri di concentrazione e di diffusione molecolare dalle curve di autocorrelazione generate viene evidenziato. In sintesi, viene fornito un protocollo di base per misurazioni FCS; può essere seguito da immunologi con una comprensione della microscopia confocale ma nessun'altra esperienza precedente di tecniche per la misurazione di parametri dinamici, come i tassi di diffusione molecolare.

Introduction

Molte funzioni cellule immunitarie si affidano a diffusione molecolare e interazioni all'interno delle membrane. Membrane biologiche sono complesse, e molti fattori che possono essere importanti per la funzione delle cellule immunitarie possono influenzare la velocità di diffusione traslazionale delle proteine all'interno delle membrane cellulari 1. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule natural killer (NK), i linfociti appartenenti al sistema immunitario innato, mostrano la diffusione differenziale delle due proteine studiate a livello della membrana cellulare a seconda dello stato di attivazione delle cellule NK 2.

correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica che è in grado di quantificare le velocità di diffusione molecolare all'interno delle membrane biologiche. Riporta la velocità di diffusione media di fluorescente molecole in un volume fisso, in genere al centro di un microscopio confocale. Si basa sulla misura delle fluttuazioni della fluorescenza che si verificano al movimento molecolareun sistema in stato stazionario. FCS è stato ampiamente utilizzato per studiare la diffusione di coloranti fluorescenti e proteine, sia in soluzione che all'interno delle membrane lipidiche. Altri parametri di output che influenzano la velocità di diffusione può anche essere studiati indirettamente in questo modo (ad esempio, i cambiamenti conformazionali di proteine o interazioni delle molecole sulle membrane delle cellule) 3, 4. FCS distingue rispetto ad altre tecniche grazie alla sua elevata sensibilità, consentendo la possibilità per il rilevamento singola molecola. Funziona bene per concentrazioni molecolari nel nanomolari alla gamma millimolare, che è tipico per livelli di espressione endogeni di maggior parte delle proteine 5. Inoltre, FCS può dare un'approssimazione del numero assoluto delle proteine ​​all'interno del volume studiati, mentre la maggior parte altre tecniche solo dare informazione relativa livelli di espressione della proteina. Altri metodi per misurare i tassi di diffusione molecolare all'interno delle membrane includono fluorecupero rescence dopo photobleaching (FRAP), singola particella di monitoraggio (SPT), multipla pinhole FCS, e di correlazione immagine metodi. FRAP e correlazione immagine metodi sono tecniche di ensemble, che in genere non danno informazioni sul numero assoluto di molecole 10. Rispetto al SPT, il throughput di FCS è maggiore per quanto riguarda caratterizzare la media della popolazione. L'analisi è anche meno impegnativa in quanto il tasso medio di diffusione delle molecole presenti nel fuoco del laser viene misurata, piuttosto che il tasso di singole molecole. Inoltre, a meno microscopi specializzati sono disponibili 11, SPT non può fornire alcuna informazione circa concentrazioni, poiché etichettatura serie SPT deve essere molto bassa per consentire l'identificazione di molecole singole. D'altra parte, FCS richiede le molecole sotto studio per essere mobili. E 'semplicemente non rilevare eventuali frazioni immobile putativi o molecole si muovono molto lentamente. La velocità di diffusione delle molecole cherisiede nel fuoco più di circa un decimo del tempo di acquisizione non verrà rappresentata correttamente misurazioni FCS 3, 12. Pertanto, coefficienti di diffusione registrati da FCS tendono ad essere più veloce di velocità di diffusione riportati da tecniche come FRAP e SPT, dove le frazioni close-to-immobile e molto lenti sono presi in considerazione pure. SPT darà anche una descrizione più dettagliata della variabilità dei tassi di diffusione nella popolazione molecolare di FCS sarà.

FCS quantifica la fluttuazione di intensità di fluorescenza nel tempo all'interno del volume eccitato. Nel caso di misure di membrana, questo si traduce in zona illuminata della membrana. In questo lavoro, utilizziamo il fatto che tali fluttuazioni sono indotti da molecole espongono diffusione browniano e si muovono quindi in e fuori del volume di eccitazione. Ci sono anche diverse altre possibili fonti per il fluctuazioni nel segnale di fluorescenza, come lampeggiante o la presenza di uno stato di tripletto nei fluorofori, effetti ambientali, vincolante unbinding del ligando, o movimento di tutta la membrana cellulare. Queste fonti di errore putativi devono essere presi in considerazione quando si progetta un esperimento FCS al fine di interpretare con precisione i risultati di 12, 13. In genere, i tassi di diffusione laterale nelle membrane biologiche sono bassi a causa di affollamento e le interazioni, sia tra proteine ​​di membrana e tra le proteine ​​e il citoscheletro. Storicamente, l'uso di FCS in membrane è pertanto stata ostacolata dalla mancanza di fluorofori fotostabili, che sono necessari per evitare sbiancamento durante i tempi di transito estesi attraverso la messa a fuoco di eccitazione 14. Tuttavia, oggi, ci sono molte opzioni per adatti coloranti foto-stabile. Miglioramenti significativi nella rilevatori e altro hardware consentono anche l'individuazione di prote fluorescenteins e coloranti di luminosità inferiore. Qui, un protocollo di base per l'applicazione di FCS utilizzando linfociti primari murini, dove la proteina di interesse è etichettato con una fluorescente contrassegnati anticorpi, è descritto. Un approccio per adattarsi alle curve di autocorrelazione per estrarre il coefficiente di diffusione e la densità molecolare è anche mostrato. Il protocollo si propone di essere facilmente seguita da immunologi con nessuna esperienza precedente di tecniche per studiare la diffusione delle molecole. Tuttavia, si prevede una conoscenza di base di microscopia confocale (per ottenere questa conoscenza di base, vedi riferimento 15). Questo protocollo può abbastanza facilmente essere adattato ad altre cellule in sospensione, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Per gli utenti più esperti FCS, esistono più raffinati metodi di analisi, alcuni dei quali sono descritti nella discussione.

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Protocol

1. La colorazione per FCS

  1. Isolare le cellule NK murine da linfociti di milza con etichettatura tallone magnetico, come da protocollo 16 del produttore. Utilizzare 2-3 x 10 5 cellule per esempio per le seguenti operazioni.
    NOTA: Utilizzare la selezione negativa per arricchire la popolazione di cellule bersaglio, lasciando intatta, in modo che le cellule possono essere etichettati con anticorpi primari sola. Vedi di riferimento 2 per informazioni più dettagliate su isolamento delle cellule da topi 2.
  2. Per le cellule murine esprimono recettori Fc, bloccare i recettori Fc con l'anticorpo clone 2.4G2 a 5 mg / mL in 25 ml di tampone fosfato salino (PBS) e siero fetale bovino 1% (FBS) per campione. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  3. Preparazione della miscela di anticorpi.
    1. Usare gli anticorpi coniugati direttamente a una foto-stabile fluoroforo. Se due anticorpi contro due proteine ​​diversesono utilizzati, fluorofori uso che hanno spettri di emissione ben separati, per ridurre al minimo il cross-talk (ad esempio, eccitato dai 488 e 633 laser 2, poi nel protocollo denominato "verde" e "rosso" laser e fluorofori, rispettivamente, ).
      NOTA: Se gli anticorpi commerciali marcati con fluorofori foto-stabile non sono disponibili per i biomarcatori selezionati, coniugati anticorpi senza etichetta ai fluorofori in base alle istruzioni del produttore. Vedi Materiali Tavolo per gli anticorpi utilizzati in questo studio.
    2. Preparare una miscela di anticorpi diluendo gli anticorpi fluorescente contro la proteina o proteine ​​di interesse in PBS + 1% FBS. Aggiungere la miscela anticorpale a ciascun campione ad un volume finale di 50 microlitri per campione. Incubare in ghiaccio per 45 minuti al buio.
      NOTA: ottimizzare la concentrazione degli anticorpi in anticipo per garantire che l'anticorpo è utilizzato ad una concentrazione saturante, tipicamente1-10 ug / ml.
  4. Dopo l'incubazione, lavare le cellule aggiungendo 250 ml di PBS e centrifugare a 150 xg per 3 min. Eliminare il surnatante.
  5. Ripetere il punto 1.4.
  6. Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS + 1% FBS. Tenere su ghiaccio e al buio fino all'acquisizione.
    NOTA: cellule murine NK possono essere tenuti in ghiaccio per un massimo di 10 ore.

2. Preparazione del microscopio Chambered coprioggetti diapositive

NOTA: Utilizzare le diapositive di coperture vetrose camerata o piatti con lo spessore del vetro di copertura che il microscopio è stato ottimizzato per, sia # 1 o # 1.5. Se il microscopio non è allineato per un certo spessore, o se non è noto, l'anello collare microscopio deve essere ottimizzato per lo spessore coprioggetti corrente 17.

  1. Diluire poli-L-lisina con acqua distillata in un rapporto 1:10. Aggiungere 200 ml di diluito poli-L-lisina alle camere e incubare per 20 min.
  2. Rimuovi ilpoli-L-lisina mediante aspirazione e lasciare la camera d'aria secca lasciandolo senza coperchio a temperatura ambiente per almeno 20-30 min.

3. Avvio del sistema FCS

NOTA: Questo protocollo si riferisce ad un sistema di microscopia e software specifici (vedi Materiali / reagenti Table), sebbene altre configurazioni microscopia e pacchetti software possono essere utilizzati anche.

  1. Accendere il microscopio confocale a scansione laser con il correlatore FCS. Aprire il software in modalità "Expert". Selezionare la lente immersione in acqua 40X.
  2. Nella scheda "Acquisire", premere i pulsanti "Scan" "Config" e per aprire il "Controllo Configurazione" e le finestre "Scan Control" (finestre A e B nella figura 1, rispettivamente). Nella scheda "ConfoCor", premere "Misura" per aprire la finestra "Misura" (finestra C nella figura 1).
  3. Creare una cartella per salvare il FCSmisurazioni. Avviare un nuovo database di immagini facendo clic su "Nuovo" nella scheda "File".
  4. Con il tasto "Laser", accendere la lampada alogena e i laser rilevanti per emozionanti i fluorofori (per esempio, 488 nm per il laser di eccitazione "verde" e 633 nm di eccitazione per il laser di eccitazione "rosso").
  5. Selezionare opportuni filtri di eccitazione e di emissione e attivare i rivelatori corrispondenti.
    1. Specificare le impostazioni per la cattura delle immagini, tra cui i filtri laser di eccitazione, di eccitazione e di emissione, percorso della luce, e rivelatori da utilizzare, nella finestra "Controllo Configurazione".
    2. Allo stesso modo, specificare le impostazioni corrispondenti per le misure FCS nella finestra "Misura", nella scheda "Configurazione del sistema". Utilizzare le impostazioni più simile possibile per l'imaging e FCS.
    3. Attivare i canali di rilevamento per le registrazioni FCS selezionando la casella "Ch1" per la channe verdel e "Ch2" per il canale rosso nella finestra "Measurement".
      NOTA: Le impostazioni devono essere ottimizzate per il fluoroforo (s) utilizzato, come in un esperimento di imaging confocale standard. In esperimenti successivi, le stesse impostazioni FCS possono essere riutilizzati con l'apertura di un vecchio file FCS, utilizzando il menu a tendina "ConfoCor" nella parte superiore dell'interfaccia utente, e scegliendo "Apri file". Premere il tasto "riutilizzo" nella finestra di acquisizione emergente. Allo stesso modo, le impostazioni di acquisizione delle immagini possono essere caricate con l'apertura di un'immagine salvata e premendo "riutilizzo".
  6. Attendere che il laser è stabile prima di effettuare misurazioni FCS. Questo può richiedere fino a 30 minuti per i laser a gas, mentre laser a diodi stabilizzano più veloce. Regolare il foro stenopeico durante l'attesa.

4. Regolazione Pinhole

  1. Preparare 0,2-0,5 mM soluzioni di fluorofori o coloranti fluorescenti corrispondenti alla eccitazione ed emissione spettri delle etichette sugli anticorpi. Ilfluorofori devono aver conosciuto coefficienti di diffusione 18, 19.
  2. Mettere una goccia 50 ml di soluzione con il fluoroforo eccitato dal laser verde al centro di un pozzo in un vetrino coprioggetti incamerata. Mettere una goccia di acqua distillata sull'obiettivo acqua 40X e posizionare la diapositiva. Premere il pulsante "Vis" per avviare la luce visibile e utilizzare il oculari per trovare e mettere a fuoco il calo fluoroforo.
    NOTA: utilizzare la stessa diapositiva come per le misure di cellule successive, dal momento che putativi lievi variazioni di spessore del vetro tra le diapositive possono influenzare l'allineamento microscopio.
  3. Posizionare il focus ben all'interno della goccia di liquido (10-100 micron dal basso).
  4. Nella finestra "Misura", selezionare la scheda "Acquisizione". Premere il tasto "Posizione attuale" sotto le "posizioni" (finestra C nella figura 1).
  5. Ritorna alla scheda "Configurazione del sistema" nella stessa finestra. Impostare un alto power per il laser verde.
    NOTA: Un laser di potenza elevata si riferisce al potere saturante (cioè, il segnale fluorescente non aumenta linearmente se la potenza del laser è ulteriormente aumentata). Circa 1 MW di sistema impostazioni di risparmio energia, o il 5-10% della potenza del laser massima, è in genere sufficiente.
  6. Verificare la stabilità del segnale premendo "Start". Si aprirà una finestra separata che visualizza la traccia temporale e la curva di autocorrelazione per la misura della corrente. Verificare che il segnale fluorescente è alto, stabile nel tempo, e che mostrano fluttuazioni nel kHz anziché Hz.
  7. Selezionare il pulsante "O Adjust" nella finestra "Measurement". Controllare se si seleziona il canale di rilevamento destro (Ch1 o Ch2). Premere il tasto "AutoAdjust X." Se la curva risultante non mostra un massimo chiaro, o il massimo è ai margini, selezionare l'opzione "grossolano" e premere "AutoAdjust X" di nuovo. Quando lo schermo con conseguente direzione x è finito, fare lo same per Y premendo il tasto "AutoAdjust Y."
  8. De-selezionare "grossolano" e si alternano tra la regolazione X e Y premendo il tasto "AutoAdjust" fino a quando entrambi hanno massimi chiaro e i valori non stanno cambiando tra le misurazioni.
  9. Se le cellule sono etichettati con due fluorofori diversi, passare a una camera dove è stata aggiunta soluzione fluoroforo rosso. Selezionare un alto potere del laser per il laser rosso e ripetere i passaggi 4,6-4,8 per l'eccitazione e la rilevazione del canale rosso.
    NOTA: Se i valori X e Y si discostano tra i canali in sistemi in cui un solo foro stenopeico è utilizzato per entrambi i canali di rilevamento, selezionare i valori intermedi e premere OK per accettare le modifiche. Qui, per il laser 488 nm con massimi a X = 79 e Y = 189 e il laser 633 nm con massimi a X = 80 e Y = 188, i valori X = 80 e Y = 189 sono stati selezionati. La combinazione dei 488 nm e 633 nm laser per eccitazione dei due anticorpi marcati con fluorofori eccitati da 488 nm o 633 nm è una buona scelta, poiché larischio di cross-talk è ridotto al minimo se gli spettri di emissione non si sovrappongono 2.

5. Misurare il tempo di transito del fluoroforo libero

NOTA: Per determinare il tempo di transito attraverso la messa a fuoco (TAUD) di un fluoroforo con un coefficiente di diffusione noto, la dimensione del volume di rilevamento, e quindi l'area della membrana cellulare che è all'interno del fuoco, può essere calcolato. Il calcolo dei TAUD è descritto nel passo 7.2.

  1. Utilizzando le stesse soluzioni utilizzate per la regolazione del foro stenopeico, impostare il tempo di acquisizione per 30 sec x 2 ripete nella scheda "Acquisizione" nella finestra "Misura" (Figura 1, la finestra C).
  2. Inizia una misura cliccando su "Start" nella finestra "Misura" (Figura 1, finestra B).
    1. Eseguire una serie di potenze laser per ogni laser di eccitazione e la corrispondente fluoroforo in soluzione, a partire ao vicinosaturando potenza e diminuzione della metà per ogni misurazione. Modificare la potenza del laser nella scheda "Configurazione di sistema" della finestra "Misura" (Figura 1, la finestra C). Premere il pulsante "Start" per avviare una misurazione.
      NOTA: inserire la potenza del laser per le prossime misure di cella nel range inferiore (ad esempio, misurare in 16, di potenza 8, 4 e 2? W, prima che l'obiettivo) 20. impostazioni laser sistema sono generalmente superiori eccitazione uscita e possono variare ampiamente a seconda del microscopio e la qualità dell'allineamento. In questo sistema, la gamma di potenza sopra corrisponde a circa 60-500? W di impostazioni del sistema di alimentazione. Si consiglia di utilizzare un misuratore di potenza per misurare la potenza di uscita prima l'obiettivo per la prima volta un nuovo microscopio viene utilizzato. L'attuale potenza massima del laser si trova sotto il pulsante "Info" della finestra "Misura".
    2. Annotare i conteggi per molecule (CPM, Unità: kHz) da ogni misura della potenza del laser.
    3. Se si utilizzano due canali di rilevamento, controllare la finestra che visualizza la curva di autocorrelazione per il cross-talk. Utilizzare una soluzione contenente solo fluorofori verdi per misurare rilevato autocorrelazione FCS nel canale di rilevamento rosso e una soluzione con soli fluorofori rossi per valutare rilevazione nel canale di rilevamento verde. Come regola generale, mantenere il CPM rilevato dal fluoroforo "sbagliato" di sotto del 5% del segnale specifico dalla corretta fluoroforo.
    4. Controllare che i valori della scala linearmente con la potenza del laser utilizzato. La saturazione del CPM alla massima potenza del laser (ad esempio, valori leggermente inferiori rispetto al previsto da una relazione lineare) è accettabile.
      NOTA: CPM dovrebbe essere ben al di sopra 10 per la più alta potenza del laser per quasi tutti i sistemi microscopio e fluorofori comuni e può essere significativamente più alto per i sistemi sensibili. La prima volta che un anticorpo fluorescente appena coniugato viene utilizzato, eseguire unmisura FCS dell'anticorpo liberamente diffondente in soluzione per quantificare il CPM previsto. Prima della misurazione, rivestire la camera di misura con 200 ml di poli-L-lisina innestate con polietilenglicole (diluito a 0,5 mg / ml in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido con una pipetta e lasciare la camera di aria secca. Salvare la soluzione di riserva in frigorifero (fino a 2 settimane) e la polvere stock nel congelatore. Al microscopio, diluire l'anticorpo per 1-10 ug / ml in PBS. Seguire i passaggi 4,2-4,4 e 6,7 in questo protocollo. Se la superficie non è rivestita con una soluzione antiaderente, anticorpi interagire con la superficie di vetro ed essere rapidamente impoverito dalla soluzione.

6. Misure cellulari

  1. Aggiungere 125 ml di cellule in PBS + 1% FCS dalla sospensione di anticorpi marcati con cellule (passo 1.5) e 150 ml di trasparente Roswell Park Memorial Institute medio 1640 (RPMI) in un pozzetto di una sagoma coprioggetti 8 pozzetti incamerata. Leave le cellule al buio a temperatura di misura per almeno 20 minuti prima di iniziare le misurazioni FCS.
    NOTA: Questo per permettere alle cellule di stabilirsi e attaccare al fondo dei pozzetti e per equilibrare le cellule e la soluzione alla temperatura di misurazione.
  2. Nella finestra "Scan Control" (Figura 1, finestra B), impostare lo zoom 1 e avviare una scansione XY veloce premendo il tasto "Fast XY". Modificare la potenza del laser in modo che sia il più basso possibile, mentre le cellule sono ancora chiaramente visibili. Centrare l'immagine su una cella giro di luminosità media, in cui la membrana è chiaramente definito e non c'è segnale fluorescente nel citoplasma. Zoom in fino a quando la cellula copre la maggior parte delle immagini.
  3. Selezionare una nuova cella se la cella corrente è in movimento o visualizza viticci, estrusi, o punti molto luminosi. Mantenere la stessa zoom e potenza del laser per tutte le celle catturati durante lo stesso esperimento.
    NOTA: Una membrana arruffato può anche essere un segno di imminente apoptosi.
  4. Focus sulla parte superiore della membrana cellulare. Nella scheda "Acquisizione" della finestra "Misura" (Figura 1, la finestra C), selezionare una posizione per la misura FCS attivando "Crosshair". In alternativa, selezionare la scheda "LSM Immagine", segnare il punto di misura voluto l'immagine LSM, e premere il pulsante "Aggiungi posizione."
    NOTA: La parte superiore della membrana cellulare non verrà influenzato da anticorpi fluorescenti o fluorofori aspecifico legati alla poli-L-lisina. Tuttavia, è importante accertarsi che la cella non si muovono durante la misurazione (vedere i risultati).
  5. Nella scheda "Acquisizione" della finestra "Misura" (Figura 1, la finestra C), impostare il numero di ripetizioni di 6-10, con il "misurare il tempo" fissato al 10 sec per ripetizione.
  6. Ritorna alla scheda "Configurazione di sistema" della finestra "Misura". Regolare la potenza del laser per la misurazione FCS sotto la "LPulsante Aser ". Prima l'obiettivo, utilizzare bassa potenza per le misure di cella, nell'intervallo compreso tra 1 e 10? W 20.
    NOTA: I valori consigliati sono un compromesso tra il rilevamento del segnale e fotodanneggiamento alle cellule. Vedere il punto 5.2.1 nota la percentuale di potenza del laser questi valori corrispondono a.
  7. Inizia una misurazione FCS premendo il tasto "Start" nella "misura" finestra (finestra C). Se i candeggianti cellulari significativamente l'inizio della misurazione, rilevate da un calo nella traccia intensità di oltre il 30% durante il primo 10 sec (un esempio è mostrato in Figura 3A, pannello inferiore), spostarsi in un'altra cella e inferiori la potenza del laser per misurazioni future.
    1. Se il segnale è perso, regolare la messa a fuoco nella direzione Z. Dopo la misurazione, utilizzare la finestra "Scan Control" (Figura 1, finestra B) per controllare che la cella è ancora centrata e che la membrana cellulare è stata misurata. Se esimoe cellule è spostato, scartare la misurazione.
    2. Nella finestra di autocorrelazione in cui viene visualizzata la misura, eliminare manualmente i singoli ripete che contengono le manovre di zoom, il candeggio, cluster di grandi dimensioni, o di altri manufatti (vedere esempi in figura 3). A tale scopo, contrassegnandoli, tasto destro del mouse e scegliendo "Delete". Salvare il file finale in formato .fcs. Risparmi almeno quattro ripetizioni per cella.
  8. Facoltativamente, acquisire un'immagine della cella alla sezione centrale (con l'intera circonferenza della membrana visibile) utilizzando la finestra "Scan Control". Catturare l'immagine dopo la misurazione FCS per evitare lo sbiancamento. Premere il tasto "Single" per avviare la cattura delle immagini.
  9. Se si utilizza "Aggiungi posizione" per il posizionamento di messa a fuoco FCS, cliccare su "Rimuovi posizione" prima di passare alla cella successiva.
  10. Passare a una nuova aliquota di sospensione cellulare dopo un massimo di 2 ore di misura per mantenere le cellule vitali throughout dell'esperimento.

7. Analisi FCS

  1. Aprire i file .fcs in un software con la curva capacità di raccordo (vedi Materiali / Reagenti Tavolo per il software utilizzato in questo protocollo).
    NOTA: Il software FCS che viene fornito con il microscopio è un buon posto per prendere confidenza con il montaggio di base, ma il software aggiuntivo è necessario montare diffusione membrana bidimensionale.
  2. Innanzitutto, determinare la dimensione del volume di eccitazione analizzando le misurazioni fluoroforo libero. Montare una curva a 3 dimensioni diffusione gratuita alle curve di autocorrelazione 21.
    Equazione (Eq. 1)
    NOTA: Definizione di parametri: N: Il numero medio di entità fluorescenti nel volume focale, τ (Tau): tempo di correlazione, τ D (TAUD): tempo medio di permanenza nel volume focale, T 1: probabilità per i fluorofori di essere in lo stato di tripletto, τ <sub> T: tempo di rilassamento per le transizioni di stato singoletto-tripletto, S: il rapporto tra altezza e larghezza di diametro per il volume focale.
    1. Estrarre TAUD, il tempo di transito per le molecole di trasferire la messa a fuoco.
    2. Utilizzare i coefficienti di diffusione osservati TAUD e pubblicate (D) di fluorofori utilizzati per la calibrazione 18, 19 per calcolare il raggio pinhole (ω).
      Equazione (Eq. 2)
  3. Analisi delle curve di autocorrelazione sulle membrane cellulari.
    1. Per visualizzare la parte della curva che rappresenta diffusione molecolare, seleziona il periodo di tempo a partire prima della ripida pendenza della curva autocorrelazione e termina dopo le convergenze curva a 1 (ad esempio 0,001 a 5 sec per recettori di superficie murini; vedi Figura 4).
    2. Generare una curva media di autocorrelazione dei singoli ripete ho salvaton passo 6.7.2.
    3. Montare una curva di diffusione membrana 2-dimensionale ad ogni curva in media autocorrelazione usando Equazione 3 3.
      Equazione (Eq. 3)
      NOTA: Parametri importanti di uscita sono i seguenti: N è il numero medio di molecole che risiedono all'interno della zona della membrana eccitato. Ricalcola a densità (N / micron 2). τ D (TAUD): tempo medio di permanenza nella zona focale, limitato dalla bidimensionalità della membrana (s). Ricalcolare il tempo medio di permanenza di un coefficiente di diffusione (micron 2 / sec) tramite il raggio determinato foro stenopeico (ω) e Equazione 2. T1 è la probabilità per fluorofori di essere in stato di tripletto. La luminosità (CPM) è calcolata dividendo l'intensità media complessiva della misura di N.
    4. Se un buon adattamento non viene raggiunta al primo tentativo, modificare i valori iniziali e / o dei limiti superiore e inferiore per le variabili fino this è raggiunto.
      NOTA: tipici limiti superiori-inferiori di proteine ​​velocità di diffusione nelle membrane cellulari primarie sono 10-500 msec per TAUD, 0-100% per T1, e 0,1-5 msec per TauT1. Selezionare valori iniziali per il montaggio al centro di questi intervalli. La parte della curva che rappresenta fluttuazioni fluorescenza derivati dalla diffusione si trova di solito tra 1 msec e 1 sec (vedi Figura 4). A seconda del fluoroforo, ci può essere a volte una seconda presente processo, dando luogo a autocorrelazione su scale temporali più brevi rispetto al parametro di diffusione. Questo è causato da uno stato transitorio scuro (tripletta) o lampeggiante (come spesso avviene per le proteine ​​fluorescenti). Uno stato tripletta è contabilizzata in Equazione 3, e il modello presentato dovrebbe quindi fornire anche una buona forma in queste situazioni.

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Representative Results

Un tipico risultato genera una curva di autocorrelazione con un tempo di transito nella gamma da 10 msec a 400 msec per le proteine ​​di membrana. Il numero di molecole può variare tra 0,5 e circa 200 per micron 2 per proteine endogenamente espressi. Controllare attentamente che il CPM non è inferiore al previsto. Questo può significare che vi è una influenza del segnale di fondo. Come regola generale, il segnale CPM sulle cellule che viene accettato per analisi non deve essere inferiore al 33% del CPM per diffondere liberamente anticorpi a parità di potenza del laser. Il CPM dovrebbe scalare linearmente con la potenza del laser. La curva di autocorrelazione per immunitarie recettori di superficie delle cellule primario dovrebbe essere liscia, con la parte più ripida tra il 0,001 e 1 sec. Vedere la Figura 2 per una curva di autocorrelazione rappresentativa e la sua traccia del tempo.

Come accennato nell'introduzione, lare sono diversi casi in cui FCS non è adatto per la misura di diffusione molecolare a causa dell'influenza di altre fonti di fluttuazioni di fluorescenza, che contribuiscono a confondere il segnale. La figura 3 mostra esempi di casi in cui un particolare ripetizione cellula o di misura deve essere eliminata. Si è già detto che un segnale estremamente bassa (molto basso CPM) è motivo di scartare la cella. Un'altra ragione per scartare la singola cella è che la cellula è in movimento (Figura 3A). Nel caso di sbianca (Figura 3B) o se grandi cluster sono presenti (Figura 3C), le misurazioni devono essere scartati se l'effetto è notevole o presente in tutta la misura. Se questa funzione è presente solo in uno o due ripetizioni, queste singole ripetizioni possono essere scartati, ma le ripetizioni restanti possono essere ancora utilizzati.

E 'importante sia per utilizzare il correttomodello per adattare i dati e anche di controllare con attenzione che la misura si sovrappone a stretto contatto con la curva di autocorrelazione. Nella Figura 4, vengono mostrati esempi di buoni e cattivi si adatta curva. Prestare particolare attenzione alla parte della curva che rappresenta diffusione (la parte più forte pendenza). E 'anche importante accertarsi che sia l'inizio e la fine della parte inclinata della curva sono ben montati dal modello. Se l'adattamento è male, senza problemi apparenti, come movimento, candeggio, o cluster, modificare i valori di partenza e / o dei limiti superiori e inferiori (in un intervallo ragionevole) prima di prendere una decisione finale di scartare il cellulare.

Figura 1
Figura 1: interfaccia software FCS. visualizzati sono le principali finestre necessarie per operare il software per l'acquisizione FCS e di imaging, come descritto nel protocollo. Finestra A, "Configurazione Control "finestra è la finestra di controllo per il percorso del fascio, i canali laser e filtri per l'imaging. finestra B è la" Scan Control "finestra per l'imaging e mostra le impostazioni di scansione. Finestra C è la" finestra di misurazione ", la finestra per la configurazione delle impostazioni di misura FCS. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: traccia Rappresentante e autocorrelazione curve di diffusione H-2D d classe maggiore di istocompatibilità mi superficie molecole nelle cellule NK fresco isolato murini. Il pannello superiore della figura mostra la fluttuazione di fluorescenza in funzione del tempo durante tutto il tempo della traccia 7x 10 misurazioni sec. Il pannello inferiore rappresentanos la curva autocorrelazione media da questi sette ripetizioni. L'altezza della curva di autocorrelazione è inversamente proporzionale alla concentrazione di fluorescenza cellulare marcata H-2D d entità all'interno del volume focale. Il valore di x in corrispondenza della parte più ripida della pendenza della curva, la metà dell'ampiezza, rappresenta il tempo medio di permanenza di fluorescente H-2D d molecole all'interno del volume focale. La misura è presentato un parte del set di dati pubblicati nel riferimento 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Esempi di tracce cellulari problematici. (A) Una cella in movimento, come esemplificato dalla traccia non avendo una stabile basale level. Il pannello superiore mostra un esempio in cui tutta la cella è spostato fuori fuoco dopo circa 35 sec, come rappresentato dal segnale molto bassa dopo questo punto di tempo. Nel pannello inferiore, l'effetto è più sottile, con ondulazioni apparenti ad un intervallo di alcuni secondi. (B) Cell visualizzazione sbianca, l'altezza della traccia diminuisce con il tempo. Confrontare l'altezza della traccia all'inizio di misurazione che al termine della misurazione. (C) La presenza di grandi cluster, rappresentata da picchi nella traccia. Nel pannello superiore, una grande cluster a 20-25 sec è presente. Nel pannello inferiore, diversi cluster sono presenti in tutta la misura. Le misure presentate sono una parte del set di dati pubblicati nel riferimento 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 4: curve di autocorrelazione rappresentativi con curva-montaggio e residui. Le linee verticali rosse e blu rappresentano i limiti della finestra temporale utilizzata per il montaggio. (A) Esempio di una forma rappresentativa di un modello di diffusione 2-dimensionale a una curva campione autocorrelazione. Nel pannello superiore, la curva verde (modello) si sovrappone alla curva blu (autocorrelazione acquisita), indicando una buona misura. Il pannello inferiore mostra la residua dalla curva raccordo. Le fluttuazioni circa 1 sec, che non sono dotati bene, sono tipici per le misure di celle e sono tollerabili. (B) Esempio di un cattivo adattamento di diffusione 2-dimensionale per la stessa curva autocorrelazione. Il modello adattato non si sovrapponga alla curva di autocorrelazione, e non converge a 1. I pannelli inferiori (A e B) mostrano i residui dalla curva raccordo. I residuisono significativamente più grandi per il cattivo misura, in particolare per la parte diffusione della curva. La misura è presentato un parte del set di dati pubblicati nel riferimento 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo per FCS può essere utilizzato per la valutazione delle dinamiche molecolari di molecole di superficie su tutti i tipi di cellule immunitarie (murina, umana, o altre specie). Misure FCS spazio-temporali dinamica molecolare fino a risoluzione di una singola molecola in cellule vive. La densità molecolare, nonché le dinamiche dei tassi di diffusione e di clustering delle proteine ​​di interesse, possono essere estratte dalle curve di autocorrelazione.

L'etichettatura fluorescente è di fondamentale importanza per gli esperimenti FCS successo. Proteine ​​di interesse sulla membrana cellulare sono tradizionalmente etichettati utilizzando anticorpi e gli anticorpi sono spesso più conveniente per l'uso su proteine ​​di superficie nelle cellule immunitarie naive. Gli anticorpi non etichettati devono essere direttamente coniugati a coloranti fluorescenti foto-stabile con una luminosità molecolare. La selezione del fluoroforo per l'anticorpo coniugazione è importante per la qualità delle misurazioni. etichette standard per citometria a flusso,come la fluoresceina e coloranti ficoeritrina-based, non sono raccomandati a causa della rapida sbiancamento. Foto-stabile coloranti per coniugazione diretta di anticorpi sono attualmente forniti da diverse società. I produttori di solito forniscono protocolli soddisfacenti per coniugazione e purificazione dell'anticorpo coniugato risultante, e questo può essere fatto in poche ore. È anche possibile eseguire FCS utilizzando proteine ​​fluorescenti, ma particolare attenzione deve essere presa per minimizzare la potenza del laser, poiché le proteine ​​fluorescenti sono in generale più inclini allo sbiancamento del più fotostabili fluorofori chimici. Secondo l'esperienza precedente, sovra-espressione di proteine ​​spesso porta ad una notevole diminuzione della velocità di diffusione a causa di affollamento, il che rende l'uso di proteine ​​fluorescenti non idoneo.

taratura Pinhole prima delle misure è anche un passo fondamentale. I fluorofori utilizzati per determinare la dimensione del volume focale dovevano sapere coefficiente di diffusiones (vedi Equazione 2). Utilizzare fluorofori liberi corrispondenti strettamente alla spettri di emissione delle etichette anticorpi per determinare la dimensione del volume focale. Questo deve essere fatto per assicurare l'efficienza ottimale del segnale e la corretta rilevazione dei potenziali correlazioni incrociate tra canali di colore. Eseguire una serie di potenze laser FCS dei fluorofori liberamente diffusori per garantire che il sistema dà il segnale di output previsto su una gamma di potenze. Confrontare il CPM a parità di potenza del laser tra esperimenti per garantire la coerenza tra esperimenti.

Nella fase di analisi, è essenziale mettere intervalli ragionevoli e valori iniziali per le variabili durante il montaggio dei modelli. Utilizzare conoscenze precedentemente pubblicato da sistemi cellulari simili a trovare buoni punti di partenza. Teoricamente, FCS è una tecnica quantitativa, ma dal momento che le condizioni ottimali si verificano raramente, un certo grado di cautela deve essere presa quando si interpretano i risultati. saranno registrati tutti i tipi di fluttuazioni,indipendentemente dall'origine di tali fluttuazioni. Pertanto, è utile disporre di quante più informazioni possibili sul sistema sperimentale per escludere possibili fonti di errore. Per esempio, movimento dell'intera membrana cellulare darà luogo a fluttuazioni con più TAUD (Figura 3A), considerando che i contaminanti putativi dei fluorofori liberi nella soluzione diffonderanno con almeno dieci volte più breve TAUD.

Questo protocollo di base può essere modificata in diversi modi. Se due proteine ​​sono etichettati con differenti fluorofori, co-diffusione (una misura indiretta di interazione) può essere valutata espandendo la metodologia per rilevare la correlazione incrociata. La misura in cui queste proteine ​​si legano l'uno all'altro nella membrana cellulare è rappresentata dall'altezza della cross-correlazione curva relativa all'altezza delle curve di autocorrelazione dei singoli canali di colore. Correlazione incrociata è indicata come Ch1 Ch2-in software di misura. il preanalisi CISE di cross-correlazione richiede controlli per cross-talk ed è quindi un po 'più complicato del protocollo presentato qui. Una descrizione dettagliata di come procedere, come un'estensione questo protocollo di base, può essere trovato in Strömqvist et al. 13. Per ottimizzare il posizionamento nella direzione z, z-scansione FCS possono essere utilizzati 22. Secondo l'esperienza precedente, è stato soddisfacente per farlo manualmente. È anche possibile montare più coefficienti di diffusione ad una curva di autocorrelazione FCS 23. Ciò richiede precedente conoscenza del numero di sottopopolazioni con differenti velocità di diffusione e delle velocità di diffusione approssimativo di almeno una delle sottopopolazioni. In caso contrario, ci saranno troppe variabili liberi, che renderanno l'inaffidabile raccordo. Un esempio tipico è una proteina di superficie la cui velocità di diffusione è sensibilmente rallentato dal legame di un ligando. Infine, depurazng la traccia di valori anomali senza interamente rimozione ripete è possibile 24.

La mancanza di un segnale fluorescente è un problema comune per risolvere. Per diffondere liberamente fluorofori, utilizzare la lampada alogena per verificare se il calo è fluorescente. Se la caduta non è fluorescente, mescolare un nuovo lotto di fluorofori con un lieve aumento della concentrazione (all'interno della gamma nM) e riprovare. Verificare che la messa a fuoco è all'interno della goccia fluorescente, i laser sono accesi nel software, la potenza del laser è sufficiente, i filtri e rilevatori di emissione corretti vengono scelti, ed i canali destro nella finestra "FCS misura" sono attivati ​​(vedere il passaggio 3.6). Avviare il laser e guardare dal lato per confermare visivamente che la luce laser raggiunge il campione. Evitare di guardare direttamente nella sorgente laser. Se il filtro di emissione selezionato comprende la lunghezza d'onda del laser, un otturatore blocca automaticamente il percorso della luce per evitare danni al rivelatore. iof tutte le impostazioni vanno bene, ma arriva nessuna luce, riavviare il laser, il sistema FCS, e il computer. Chiedi un esperto se la mancanza di un segnale fluorescente persiste. Una procedura semplificata si applica se le cellule etichettate non vengono visualizzati fluorescenza. Confermare la presenza della fluorescenza con la lampada alogena; attivare i laser, selezionare i canali laser, e regolare la potenza del laser. Selezionare una posizione sulla membrana cellulare, sia utilizzando l'opzione "Aggiungi posizione" (vedi punto 6.4) "Crosshair" o. Passare al campione successivo se il segnale è ancora troppo basso.

Un aspetto importante della base fluttuazione della tecnica è che le molecole devono essere ragionevolmente mobili da rilevare. frazioni di molecole o molecole intrappolate all'interno di aree più piccole del fuoco durante tutto il tempo di misura molto lentamente movimento non può quindi essere misurata. Questo porta ad una possibile sottostima della densità di superficie e una sovrastima del tasso di diffusione. candeggiopossono anche contribuire ad una sottostima putativo sia della densità e TAUD, poiché le molecole avrà una maggiore probabilità di essere sbiancato il tempo più lungo trascorso nel volume focale laser illuminata. Influenza dallo sfondo (fluorescenza dall'esterno del piano focale) avrebbe, invece, artificialmente aumentare il numero di molecole identificati e diminuire il CPM misurata. In precedenza, l'errore massimo totale nella determinazione della densità assoluta è stata stimata essere circa il 40% 20. Tuttavia, di solito è possibile confrontare diversi campioni biologici tra loro, dal momento che le fonti di errore sono, nella maggior parte dei casi, uguali in tutto gli esperimenti. Un'altra potenziale fonte di errore è che gli anticorpi sono bivalenti, che significa che ogni anticorpo può potenzialmente legarsi a due molecole bersaglio. Gli autori non hanno osservato questo fenomeno, ma non possono essere garantite che questa è una caratteristica globale per altri anticorpi. Il potenziale influenza della bivalenza devepertanto essere testato singolarmente per ciascun anticorpo. La combinazione di specifici anticorpi primari e secondari etichettati non deve mai essere utilizzato a causa dell'elevato rischio di indurre cluster artificiali da due successive etichette bivalenti. Se le cellule sono state trasfettate con invece versioni fluorescenti proteina marcata della proteina di interesse, ogni proteina avrà una sola etichetta. Tuttavia, ciò richiede trasfezione, che non è sempre desiderabile e potrebbe anche non essere possibile (ad esempio, se si utilizza cellule immunitarie isolate direttamente da sangue umano). Infine, un unico punto FCS non registra le immagini. Se sono immagini per la pubblicazione o per altri scopi, questi devono essere catturate separatamente utilizzando la parte di imaging del software. catturare sempre immagini dopo misurazioni FCS al fine di evitare inutili sbiancamento della superficie cellulare.

A differenza di FCS, la microscopia confocale tradizionale a base, come ad esempio FRAP, e le metodologie di correlazione immagine non può quantificare le fluttuazioni di fluorescenzaa livello di singola molecola 6. Metodologie correlazione Immagine misurano il numero di molecole indirettamente e con una risoluzione inferiore, ma possono valutare la variabilità di diffusione molecolare e clustering sull'intera area immagini stampate 25. Standard SPT misurata mediante microscopia confocale ha un livello ideale di etichettatura, ordini di grandezza inferiore rispetto FCS 7. Pertanto, la densità di proteine ​​marcate non può essere misurata dalla norma SPT. La combinazione di SPT con altre tecniche di microscopia (ad esempio, stocastico microscopia ottica ricostruzione o fotoattivazione localizzazione microscopia) permette la densità e il movimento da valutare, ma richiede coloranti molto specializzati o proteine 11. tecniche di Super-risoluzione, come ad esempio i campioni spesso richiedono fisse strutturato illuminazione microscopia e di emissione stimolata esaurita la microscopia, e una combinazione di primaria e anticorpi secondari per labeling 26. La localizzazione è quindi molto precisa, mentre la dinamica del sistema non possono spesso essere valutati. Rispetto a SPT e tecniche di super-risoluzione, FCS richiede anche molto meno potenza di calcolo e tempo per l'analisi e l'estrazione dei risultati. Citometria a flusso è il cavallo di battaglia di Immunologia e può essere favorevolmente combinato con FCS. Cell sorting può, per esempio, essere seguita da successive misure su popolazioni di cellule selezionate se coloranti fotostabili erano stati utilizzati prima della cernita. FCS è quindi una metodologia che può essere utilizzato da solo o in combinazione con altri metodi stabiliti.

Questo protocollo può essere utilizzato per identificare le caratteristiche attualmente sconosciuti della dinamica delle cellule immunitarie e interazioni all'interno della membrana cellulare a livello di singola molecola. Inoltre, le caratteristiche di intere popolazioni contro sottoinsiemi selezionati possono essere confrontati. Essa ha anche un ruolo potenziale come un passo di selezione per la terapia delle cellule immunitarie. Dal momento che le misure fannoNon consumare il cellulare, a differenza di molti altri metodi di analisi della funzionalità delle cellule immunitarie, le singole cellule possono potenzialmente essere recuperati e colto. Così, dopo l'analisi delle curve FCS, cellule promettenti possono essere estratte ed espanse per ulteriori applicazioni, tra cui applicazioni cliniche putativi.

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Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Vladana Vukojević, Centro di Medicina Molecolare, Karolinska Institutet per la manutenzione dello strumento Zeiss ConfoCor 3 e per suggerimenti utili per quanto riguarda le misure di cella. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal Vetenskapsrådet (concessione numero 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, e da Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II Miltenyi Biotec NordenAB 130-096-892 Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum Sigma-Adlrich F7524 Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline - - Made in house 
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 PAA The Cell Culture Company  E15-848 Transparent medium
Antibody clone 2.4G2 Thermo Fischer Scientific 553140 For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody  Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody  BD Pharmingen 558915 Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488 Mobiotech MFP-A2181 Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) SuSoS AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride Sigma-Aldrich 432202 Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A20006 Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope  Zeiss LSM510
Software: Confocor 3 Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox Matlab Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo-scientific  155411 8 wells, 1.0 borosilicate bottom

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References

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