Plunge congelamento: uno strumento per l'ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

Published 5/05/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Questo manoscritto descrive un metodo facile da usare e cryofixation basso costo per la visualizzazione cellule in sospensione mediante microscopia elettronica a trasmissione.

Cite this Article

Copy Citation

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è uno straordinario strumento per studiare ultrastruttura delle cellule, al fine di localizzare le proteine ​​e visualizzare complessi macromolecolari ad altissima risoluzione. Tuttavia, per ottenere il più vicino possibile allo stato nativo, è necessaria la conservazione del campione perfetto. Convenzionale microscopia elettronica (EM) fissazione con aldeidi, per esempio, non fornisce una buona conservazione ultrastrutturali. La lenta penetrazione di fissativi induce riorganizzazione cellulare e la perdita di vari componenti cellulari. Pertanto, convenzionale fissazione EM non consente una stabilizzazione istantanea e preservare le strutture e antigenicità. La scelta migliore per l'esame di eventi intracellulari è utilizzare cryofixation seguito dal metodo di fissaggio freeze-sostituzione che mantiene le cellule nel loro stato nativo. Alta pressione congelamento / freeze-sostituzione, che preserva l'integrità della ultrastruttura cellulare, è il metodo più comunemente utilizzato, ma richiede expensive attrezzature. Qui, un metodo facile da usare ed economici freeze fissazione seguita da congelamento-sostituzione per colture cellulari La sospensione viene presentato.

Introduction

La preparazione del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi studio di microscopia elettronica. Convenzionale fissazione EM era il metodo primario per fissare tessuti o cellule per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 1. In primo luogo, aldeidi e osmio tetrossido sono utilizzati per fissare chimicamente il materiale a temperatura ambiente. Poi, il materiale viene disidratato con solventi organici, infiltrato, e incorporata in resina epossidica. Questo metodo dipende dal tasso di penetrazione del fissativi nella cellula. Di conseguenza, i manufatti ed estrazione dei contenuti cellulari sono generalmente osservati 2.

Cryofixation è chiaramente un'alternativa migliore per la conservazione di strutture cellulari 3, mantenendo intatte. La più alta qualità delle immagini TEM 4 in sezioni sottili di resina può essere ottenuta utilizzando il metodo di sostituzione cryofixation / congelamento. Lo scopo di questa tecnica è quello di ottenere bi vetrificatocampioni ological senza formazione di cristalli di ghiaccio o di cristalli di ghiaccio contenenti abbastanza piccolo da non danneggiare l'ultrastruttura delle cellule. Ad alta pressione di congelamento (HPF) e ultrarapido cryofixation, che è anche chiamato tuffo congelamento (PF), sono due metodi per cryofix campioni. HPF immobilizza molecole nella cellula istantaneamente ed evita danni causati dal convenzionale fissazione EM. Diversi tipi di macchine di congelamento e dispositivi automatici di sostituzione sono stati sviluppati 5. Le macchine e di consumo di congelamento (azoto liquido, dei campioni vettori, ecc) sono costosi, ma consentono di produrre micrografie elettroniche di alta qualità 6, 7. PF è una tecnica che è stata utilizzata nei primi anni 1950 ed è descritto in letteratura come semplice ed economico 8 .Durante la procedura PF, il campione preparato è congelato a un ritmo rapido per ottenere cristalli di ghiaccio dimensione inferiore 3 a 5 nm. A tal fine, il campione èImmerso in un criogenico liquido, come ad esempio etano, propano o una miscela di etano-propano. Fin dagli anni '50 sono stati apportati miglioramenti di PF per rendere disponibile questa tecnica ad un maggior numero di utenti. Il congelamento ad alta pressione è attualmente l'unico modo efficace per congelare una grande varietà di campioni di spessore superiore a 50 μm (fino a uno spessore di 200 μm per i campioni a forma di disco) 5 , mentre PF è ampiamente usato per rappresentare piccoli oggetti (<100 nm ), Come i complessi macromolecolari sospesi in un film sottile di ghiaccio amorfo 9 . Campioni più grandi, ad esempio le cellule eucariotiche, possono essere criosidite da PF, ma necessitano di detti campioni, come i tubi di rame capillari oi sistemi a sandwich 8 , 10 , 11 .

Qui viene presentata una tecnologia veloce, facile da usare e a basso costo di congelamento / congelamento a tuffo utilizzabile per diverse colture di cellule di sospensione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione di Formvar griglia Film

NOTA: Eseguire manipolazione cloroformio sotto una cappa utilizzando dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, occhiali). Utilizzare 400 mesh griglie di rame di microscopia elettronica. Con altri tipi di rete (in altre dimensioni delle maglie, oro e griglie di nichel), la qualità di congelamento è peggio.

  1. Preparare una soluzione di 100 mL di 0,3% formvar in cloroformio. Permettono di sciogliere durante la notte senza agitazione.
  2. Mettere 400 mesh (numero di fori per pollice quadrato) griglie microscopycopper elettroni (diametro 3,05 mm) in una fiala di vetro (altezza 3 cm e diametro di 2 cm) contenente acetone. Agitare la fiala con un movimento circolare della mano. Togliere l'acetone con una pipetta di trasferimento di plastica. Che il solvente evapori per 5 min. Trasferire le griglie da essi versando su una carta da filtro e lasciare asciugare per 5 min.
  3. Lucidare un vetrino 76 x 26 mm 2 strofinando con un panno privo di lanugine fino lucido / scivoloso.
  4. Prendere un cristallizzatore (diametro 15 cm, altezza: 7 cm e capacità di 1200 mi) e riempire fino all'orlo con acqua distillata. Pulire la superficie dell'acqua passando una barra di vetro sulla superficie due volte per rimuovere la polvere.
  5. Tenere il vetrino tra due dita ed immergerlo nella soluzione Formvar per alcuni secondi. Tenere in posizione verticale ad asciugare sotto un bicchiere capovolto per 5 min.
  6. Quando il film è asciutto, segnare i bordi del vetrino con una lama di rasoio affilata per definire i limiti del film da sloggiati dalla diapositiva.
  7. Prendere un respiro profondo ed espirare pesantemente sul vetrino per ottenere uno strato di vapore acqueo sopra e sotto la pellicola per rendere la pellicola leggermente opaca e migliorare la sua visibilità.
    1. galleggiare immediatamente la pellicola sulla superficie dell'acqua cristallizzatore toccando il fondo del vetrino con un angolo di circa 30 °. Lasciare il rilascio pellicola dal vetrino e sfilarlo verso la superficie dell'acqua cristallizzatore. tirare delicatamente la pellicola via con lapinzette, se necessario.
  8. Delicatamente depongono le griglie a faccia in giù sul film galleggiante sulla superficie dell'acqua nelle regioni che sono di spessore adeguato (circa 10 nm) e senza grinze.
  9. Raccogliere il film coprendo le griglie con carta Joseph come galleggiare sulla superficie dell'acqua cristallizzatore.
    1. Tenendo la carta Joseph con una mano, toccare una delle estremità della carta Joseph ad un'estremità del film. Attendere che la carta Giuseppe è completamente bagnato. Rimuovere la carta Giuseppe con le griglie bloccato su.
  10. Posizionare le griglie per 24 ore in una capsula di Petri coperto per essiccamento finale e stoccaggio prima dell'uso a temperatura ambiente.

2. Preparazione di Freeze-sostituzione Piano

NOTA: tetrossido di osmio (OSO 4) e acetato di uranile sono sostanze chimiche pericolose. gestirli nella cappa indossando un'idonea attrezzatura di protezione individuale (DPI) includente un camice e guanti. Follow le avvertenze di sicurezza per la gestione (OSO 4) e acetato di uranile. Utilizzare cryovials O-ring per evitare la fuoriuscita di OsO 4.

  1. studi ultrastrutturali
    1. Mettere in vetro OsO 4 fiale in un pallone di vetro.
    2. Rompere la fiala agitando il pallone.
    3. Aggiungere un volume appropriato di acetone 100% per ottenere una concentrazione finale 4%.
    4. Mescolare e versare 1,5 aliquote mL in 1,8 cryovials mL.
  2. proteine immunomarcatura
    1. Posizionare 0,05 g di acetato di uranile in un pallone di vetro.
    2. Aggiungere 50 ml di 100% acetone.
    3. Agitare la soluzione con un agitatore magnetico. Quando la soluzione diventa limpida, filtrata usando un filtro da 0,2 um.
    4. Dispensare 1,5 mL aliquote in 1,8 cryovials mL.
      NOTA: Preparare i cryovials contenenti un mezzo di gelo e di sostituzione prima del processo di congelamento grande passo e tenerli in -84 ° C freezer. Invertire il fiasco di vetro di buttare via laOsO 4 ampolla nel rifiuti pericolosi.

3. Preparazione di cellule

NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il successo del metodo. Per tutti i tipi di cellule, crescere le cellule per ottenere il numero indicato di cellule. Centrifuga nel tubo indicato al momento e velocità specificata.

  1. Per ottenere la consistenza adeguata dei pellet di diversi tipi di cellule, le cellule crescono come segue:
    1. Per Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, inoculare lievito in 5 mL di terreno liquido minima o completa. Incubare una notte a 28 ° C, rotante (180 rpm). Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) della coltura durante la notte. Diluire le cellule di lievito ad una OD 600 di 0,2 in 50 ml di mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 28 ° C, rotante, per ottenere 1 x 10 9 cellule di lievito 7.
    2. Per Leishmania flagellum, inoparassiti culate in 5 ml di mezzo AM con 7,5% di FCS (siero fetale di vitello). Incubare una notte a 24 ° C, rotante (180 rpm). Misurare il diametro esterno 600 della cultura durante la notte. Diluire le cellule parassita ad un OD 600 di 0,2 in 50 ml di mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 24 ° C, rotante, per ottenere 5 x 10 8 cellule parassita 12.
    3. Per Trypanosoma brucei, inoculare parassiti in 5 mL di SDM-79 media con 10% FCS e 30 pg / mL igromicina. Incubare una notte a 27 ° C, rotante (180 rpm). Misurare il diametro esterno 600 della cultura durante la notte. Diluire le cellule parassita ad un OD 600 di 0,2 in 50 mL mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 27 ° C, rotante, per ottenere 5 x 10 8 cellule parassita 13.
    4. Per Escherichia coli, inoculare i batteri in 5 ml di terreno DYT con 100 ug / ml di ampicillina. Incubare per una notte a 37 ° C, rotante (180rpm). Misurare il diametro esterno 600 della cultura durante la notte. Diluire le cellule dei batteri ad una OD 600 di 0,2 in 50 ml di mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 37 ° C, rotante, per ottenere 5 x 10 10 batteri cellule 14.
      NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria. Molto lenta crescita ceppi cellulari possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente.
  2. Per tutti i tipi di cellule, trasferire il mezzo di coltura contenente le cellule a 50 ml provetta di polipropilene e centrifugare per 3 minuti a 1500 x g.
  3. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di tutti i tipi di cellule in 1 ml di mezzo di coltura cellulare pertinente.
  4. Centrifugare tutti i tipi cellulari in una provetta per 1 min a 3900 x g. Completamente rimuovere il surnatante.
  5. Mantenere le cellule in ghiaccio.

Nota: maneggiare azoto liquido con cura. Utilizzare dispositivi di protezione individuale compresi cryogloves e googles. Propano è potenzialmente esplosiva, in modo da eseguire la liquefazione in un ambiente ben ventilato o sotto una cappa aspirante. Non fiamme libere sono ammessi.

  1. Mettere circa 150 mL di azoto liquido in un vassoio di polistirolo. Collocare una tazza di ottone (altezza 3,6 cm, diametro 2 cm e spessore 1,5 mm) in azoto liquido per congelare esso. Non lasciate che l'azoto liquido penetri nella tazza in ottone.
  2. Attendere fino a quando le bolle scompaiono per essere sicuri che la coppa di ottone è congelato.
  3. Mettere il tubo collegato alla bombola di propano in contatto con la parete coppa in ottone.
  4. tenere aperta la valvola della bombola di propano.
    NOTA: A questo punto, il propano liquefa nella tazza di ottone.
  5. Interrompere la liquefazione chiudendo la valvola della bombola di propano e rapida rimozione del tubo del gas.
  6. Riempire la vaschetta in polistirolo con ni liquidoTrogen fino a 5 mm dalla parte superiore della coppa di ottone. Non lasciate che l'azoto liquido penetri nella tazza in ottone.

5. Plunge congelamento del campione

  1. Mettere circa 200 mL di azoto liquido nel vassoio polistirolo. Congelare tazzine ottone (altezza 1,5 centimetri di diametro 2,5 cm e spessore di 1 mm) mettendoli in azoto liquido. Mettere una tazza per un campione di cellule in sospensione. Fare attenzione a non mescolare i campioni. A tal fine, mettere il campione 1 in tazza 1, campione 2 in tazza 2, ecc.
  2. Congelare le pinzette immergendo la punta in azoto liquido.
  3. Immergere un doppio ago bordo dissezione nel pellet ottenuto in 3.5.
  4. Con una pinzetta, prendere 400 mesh griglia microscopia rame rivestito con formvar preparata nella sezione 1.
  5. Utilizzando l'ago dissezione, una goccia del pellet ottenuto in 3.5 sulla griglia. Provare dimensioni diverse goccia (ad esempio 2, 5 e 10 mL).
  6. Molto rapidamente immergere la griglia in possesso delle pinzette nel gene propano liquidovalutazione nella sezione 4 e mescolare la griglia con movimento circolare per alcuni secondi.
  7. Rapidamente trasferire la griglia congelato con le pinzette alla tazzina piccolo ottone congelato nella sezione 5.1.
    NOTA: Per ogni campione, fare almeno 3 griglie. bloccare sempre le pinzette prima di prendere una griglia di rame.

6. Gelo-sostituzione

NOTA: tetrossido di osmio è potenzialmente volatile, in modo da utilizzare un respiratore purificazione dell'aria con filtri per vapori. Congelare il fissativo in azoto liquido prima immersione congelamento è anche una soluzione.

  1. Per gli studi ultrastruttura, aprire 1,8 ml provette contenenti esageratamente medio freeze-sostituzione preparata nella sezione 2.1. Per gli studi di immunolocalizzazione, aprire 1,8 ml provette contenenti esageratamente medio freeze-sostituzione preparata nella sezione 2.2. Mettere il coperchio sulle cryovials.
  2. Congelare le pinzette immergendo la punta in azoto liquido.
  3. Rapidamente rimuovere il tappo e trasferire le griglie congelati inPer cryovials utilizzando le pinzette.
  4. Mettere il tappo sul cryovials.
  5. Ripetere l'operazione per ogni griglia di ciascun campione.
  6. Chiudere tutti i tappi e mescolare i cryovials con un movimento circolare della mano per garantire i campioni sono nel mezzo freeze-sostituzione.
  7. Posizionare i cryovials in una scatola a chiusura ermetica per 3 giorni in un congelatore C -84 ° durante il processo di congelamento-sostituzione.

Warming 7. Campione

  1. studi Ultrastrutture
    1. Portare i cryovials in un vassoio di polistirolo (per evitare un improvviso aumento della temperatura) ad una C congelatore -30 °. Metterli in freezer a -30 ° C per 1 ora.
    2. Mettere le cryovials in un congelatore C -15 ° per 2 ore. Porre i campioni a 4 ° C per 2 ore e poi per 30 min a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere il supporto di sostituzione di congelamento con una pipetta di trasferimento di plastica. Aggiungere circa 500 ml di 100% acetone.
    4. Mescolare il 1,8 ml esageratamentecon un movimento circolare della mano e rapidamente versare l'acetone (1,5 ml) contenente le griglie in un flacone di vetro (altezza 3 cm e diametro 2 cm).
    5. Risciacquare la stessa esageratamente con 1 mL di acetone al 100% per essere certi di aver trasferito tutte le griglie. Mescolare l'esageratamente con un movimento circolare della mano e versare il contenuto della esageratamente in una fiala di vetro.
    6. Lavare ogni fiala con 3 mL di 100% acetone 3 volte per 10 min.
    7. Seguire le procedure incorporamento e inclusione come descritto nel riferimento 15. Impregnare il campione con concentrazioni crescenti di resina epossidica in acetone (25%, 50% e 75%) e incorporare il campione con 100% di resina epossidica in capsule di gelatina.
  2. immunomarcatura studi
    1. Trasportare 1,8 mL cryovials in un vassoio di polistirolo (per evitare un improvviso aumento della temperatura) alla -30 ° C freezer.
    2. Posizionare i cryovials per 2 ore in un congelatore C -30 °.
    3. In -30 ° C congelatore, mescolare la esageratamente con un movimento circolare della mano e rapidamente versare il mezzo sostituzione congelamento in una fiala di polipropilene (altezza 5 cm e diametro 1,5 cm).
    4. Sostituire il mezzo di sostituzione congelamento con 2 ml di terreno freeze-sostituzione fresca.
    5. Posizionare il flacone in polipropilene per 2 ore in un congelatore C -30 °.
    6. Risciacquare il flacone polipropilene per 1 h con 2 mL di 100% acetone e tre volte per 1 h con 2 mL di etanolo al 100%.
    7. Seguire le procedure incorporamento e inclusione come descritto nel riferimento 15. Impregnare il campione con concentrazioni crescenti di resina acrilica (25%, 50% e 75% in acetone) e incorporare il campione con resina acrilica 100% in capsule di gelatina.

8. Visualizzazione Campioni

  1. Dopo l'incorporazione, fare 80 nm sezioni ultra-sottili dei campioni con un ultramicrotomo. Contrastare le sezioni con 2% citrato di piombo a temperatura ambiente per 1 minass = "xref"> 15.
  2. Utilizzare un microscopio elettronico 80 kV o 120 kV ad osservare le sezioni 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In questo articolo, un metodo di congelamento facile da usare e tuffo basso costo per ultrastrutturali (figure 1 e Figura 2) e studi immunomarcatura (Figura 3) è presentato. Abbiamo dimostrato che non è necessario disporre di attrezzature speciali per la procedura di congelamento-sostituzione e che la procedura di riscaldamento richiede meno di 6 ore invece di 24 ore utilizzando un sistema dedicato.

Metodo / freeze-sostituzione PF portato alla migliore conservazione delle strutture intracellulari di Saccharomyces cerevisiae (Figura 1A e 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (Figura 1B e C), Leishmania flagello (Figura 2 A e B), Trypanosoma brucei (Figura 2 C e D) e Escherichia coli (figura 2E). Le strutture non sono rimpicciolita e il citoplasma appare denso. Inoltre, le membrane sono lisce, che è una prova di buona conservazione. Tutti gli organelli, come nucleo (Figura 1A, B D e la Figura 2A -D), mitocondri (Figura 1A -C, E ed H), e vacuoli (Figura 1A, C, F e H), può essere perfettamente identificato . Nel nucleo, una doppia membrana formante membrana nucleare, poro nucleare, corpo poli mandrino, e ribosomi attaccato sulla membrana esterna della membrana nucleare sono chiaramente visibile (Figura 1D e la Figura 2B, 2D). Nei mitocondri, le invaginazioni della membrana interna, chiamati creste (Figura 1E), sono chiaramente visibili. I vacuoli sono organelli critici perché i grandi cristalli di ghiaccio possono sviluppare facilmente al loro interno. Come illustrato in figura 1, vacuoli sono perfettamente conservati senza danni cristalli di ghiaccio (Figura 1A, C, F, e H). Infine, come ultrastruttura è ben conservata, diversi eventi biologici possono essere osservati e analizzati, come autophagy (Figura 1C, F e H), morfologia mitocondriale (Figura 1E), vescicole secretorie (figura 1G), e la divisione nucleare (Figura 1A , la figura 2 B, unND 2C).

Nella localizzazione situ di proteine ​​con anticorpi specifici è una delle tecniche più potenti e popolari di biologia cellulare. PF può essere utilizzato anche come un metodo per eseguire immunolocalizzazione proteine. Questa procedura conserva antigenicità delle proteine ​​e, come detto in precedenza, l'identità organello. Anticorpi differenti di targeting diverse proteine di lievito, come anti-ATP sintasi 7, 15 (figura 3A, 3C e 3D), anti-GFP (Figura 3B), anti-porine 16 (figura 3 E), e anti-FOX2 17 (Figura 3F), sono già stati testati. È anche possibile eseguire questi esperimenti su diversi organismi, come Leishmania 12.


Figura 1: immagini TEM di studi ultrastrutturali dei lieviti Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. (A) Presentazione di S. cerevisiae. (B) Presentazione di S. pombe. (C) Parte del S. pombe citoplasma. (D) Alto ingrandimento di un nucleo. (E) Particolare di un mitocondrio con creste chiaramente visibile. Morfologia (F) Vacuolar durante autofagia. (G) germoglio lievito con vescicole di secrezione all'interno. (H) Esempio di contatti intimi tra vacuoli e mitocondri durante il processo di autofagia. N, nucleo; V, vacuolo; m, mitocondrio; SV, Vesi secrezioneCles; r, ribosomi. Barre di scala = 200 nm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: immagini TEM di studi ultrastrutturali di Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei ed E. coli. (A) Panoramica di Leishmania. (B) Particolare della Leishmania citoplasma con poro nucleare e reticolo endoplasmatico. (C) Presentazione di T. brucei. (D) Alto ingrandimento T. brucei nucleo. (E) Presentazione di E. coli cellule. N: nucleo; V, vacuolo; m, mitochondrion; NP, poro nucleare; F, flagello; FP, tasca flagellare; K, kinetoplasto; r, ribosomi. Barre di scala = 200 nm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Esempi di etichettatura proteine utilizzando anticorpi monoclonali e policlonali. (A) Presentazione di S. cerevisiae. (B) immunomarcatura di amiloide-β con anticorpi anti-GFP. (CD) Esempio di etichettatura mitocondri con anticorpi anti-sintasi ATP. Localizzazione (E) Porin in membrana esterna di un mitocondrio. Proteina (F) FOX2 viene rilevato mitocondrio da immunomarcatura. (G) La localizzazione di Ld Flabarin inuna sezione longitudinale di un flagello Leishmania amazonesis. Tutti gli anticorpi vengono rilevati utilizzando 10 nm anticorpi policlonali oro. N, nucleo; V, vacuolo; m, mitocondrio. Barre di scala = 200 nm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TEM è un metodo efficace per l'osservazione ultrastrutturale di organelli, cellule e tessuti. Cryofixation / freeze-sostituzione è attualmente il metodo migliore per la conservazione di entrambi ultrastruttura e proteine ​​antigenicità. Fissativi chimici penetrano e si comportano molto lentamente consentendo in tal modo riarrangiamenti strutturali prima della completa stabilizzazione della ultrastruttura 2. Al contrario, cryofixation / freeze-sostituzione stabilizza immediatamente strutture cellulari 4. Tuttavia, le tecniche cryofixation / freeze-sostituzione includono un certo numero di vincoli e difficoltà limitando così il loro campo di applicazione. Si tratta di esempio, manufatti congelamento, realizzazione della tecnica, costo e attrezzature. La tecnica di congelamento / freeze-sostituzione ad alta pressione ha consentito un alto grado di conservazione di dati cellulari 6, 7. Al contrario, PF è già utilizzato per obsErving piccoli oggetti sospesi in film sottili di ghiaccio amorfo 9. Qui, il metodo / freeze-sostituzione PF per studi ultrastrutturali e immunomarcatura fornisce immagini di alta qualità di lieviti, parassiti e ultrastruttura batterica paragonabili a alta pressione immagini congelamento.

Qualità di fissaggio dipende dalla velocità di raffreddamento di 18. Alla velocità di raffreddamento elevati, l'acqua è nello stato vetroso e non mostra struttura cristallina visibile a livello microscopia elettronica. La vetrificazione avviene unicamente in uno strato superficiale molto sottile (200 um in generale) e, pertanto, buon spessore congelamento diminuirà gradualmente dalla superficie del campione alla strati interni 4. In cellule vegetali, rivestimento ceroso o spazi riempiti con gas può rallentare la velocità di raffreddamento. Con PF, a sorpresa, è stata osservata alcuna riduzione della qualità delle prestazioni di congelamento. In tutti gli esperimenti, la percentuale di cellule ben congelati è g reater del 50%. Questa percentuale varia tra il 50% a più del 90% e dipende da vari parametri (terreno di coltura, lo stato fisiologico delle cellule, temperatura esterna, e livello di umidità). Come detto sopra, la formazione di cristalli di ghiaccio distrugge la struttura cellulare e cristalli di ghiaccio sono particolarmente visibili in vacuoli. Nel processo di sostituzione / freeze PF, particolare attenzione deve essere prestata alla temperatura di congelamento. La fase di sostituzione di congelamento non deve essere eseguita sopra -82 ° C, in caso contrario, l'acqua vitreo sarà trasformato in acqua cristallina. Per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio danno, crioprotettore è attualmente utilizzato, ma che porta ad alterazioni della ultrastruttura delle cellule 19. Lievito, batteri, e cultura parassita medium potrebbe contenere un componente che è l'agente crioprotettiva. In questo contesto, si è deciso di non utilizzare ulteriore crioprotettore in modo da essere il più vicino possibile allo stato attuale cellulare.

ve_content "> Il successo di PF / sostituzione congelamento dipende da molti punti critici durante la fase di sviluppo del metodo. In primo luogo, un punto critico è quello di ottenere la consistenza adeguata del pellet. Il pellet ottenuto dopo centrifugazione deve essere sufficientemente compatto da laminare su una griglia microscopia elettronica. Se il pellet è troppo compatto, la soluzione di congelamento-sostituzione non può penetrare la goccia, e l'ultrastruttura non sarà ben conservato. al contrario, se il pellet non è abbastanza compatto, il terreno di coltura residuo può elaborare cristalli di ghiaccio e compromettere l'ultrastruttura cellulare. per ottenere la consistenza adeguata dei pellets di diversi tipi cellulari, è necessario rispettare le condizioni di coltura per ottenere il numero indicato di cellule e dei parametri di centrifugazione indicati nel protocollo (vedi sopra) per tutti tipi di cellule. Tuttavia, la quantità del materiale messo sulla griglia di rame non è critica. differenti dimensioni delle goccioline possono essere testati. in secondo luogo, il tipo di griglia that è usato come supporto è importante. Diversi oro, nichel, rame e griglie con diverse dimensioni di maglia sono stati testati. I migliori risultati sono stati ottenuti con un reticolo di rame 400 mesh con barre sottili. In terzo luogo, per quanto riguarda la fase di congelamento, una tazza di ottone è preferito per liquefare il propano. propano liquido in tazza di rame tende a congelare e, di conseguenza, complica l'esperimento. Infine, il manipolatore deve lavorare velocemente e in condizioni di freddo per evitare campione accidentale di warm-up. Se accade, il campione deve essere scartato. Ad esempio, per evitare il riscaldamento del campione, le pinzette devono essere pre-raffreddati prima di utilizzarli e il mezzo di sostituzione congelamento deve essere preparato con largo anticipo prima della procedura. pinzette refrigerati devono essere utilizzati anche durante il processo di congelamento tuffo becauseif il congelamento grande passo è realizzato senza congelare le pinzette, un sacco di fumo costituisce come le pinzette sono immersi nel propano (a causa del caldo / freddo di scambio). Questo ha inevitabilmente un impatto sui tassi di raffreddamento. Prove con SAMPLes congelati con una pinzetta non congelati non sembrano essere adeguatamente congelati.

Inoltre, l'uso di sostanze chimiche pericolose come O S O 4 e acetato di uranile nel medio freeze-sostituzione richiede, durante la preparazione di soluzioni e congelare-sostituzione di processo, di lavorare sotto cappa con adeguata PPE. Per evitare la fuoriuscita di OsO 4 e l'inalazione dei vapori, cryovials devono avere un O-ring duro per assicurare che i tubi rimangono sigillati durante il processo di congelamento-sostituzione. Per evitare l'inutile esposizione ai vapori di osmio durante la preparazione del mezzo freeze-sostituzione, la fiala OsO 4 può essere suddiviso in un pallone di vetro. La presenza di frammenti di vetro nel blocco di resina dopo inclusione può essere evitato utilizzando pipette fine-tip durante acetoni risciacqui e gradini di incorporamento. Eseguire la fase inserimento sotto un ciclo binoculare e la realizzazione di sezioni semi-sottili permette anche per verificare che non vi siano frammenti di vetro.Quando gli esperimenti non possono essere condotte sotto cappa aspirante (soprattutto nella prima fase del processo di sostituzione congelamento), utilizzare un respiratore purificazione dell'aria con filtri per vapori. Il manipolatore deve fare attenzione quando si lavora in condizioni di freddo con azoto liquido o durante fasi di congelamento. Si raccomanda l'uso di guanti e occhiali. Inoltre, il propano è potenzialmente esplosiva, così la liquefazione deve essere eseguita in un ambiente ben ventilato o sotto una cappa aspirante e fiamme libere sono ammessi.

Diversi articoli hanno mostrato che, su una vasta gamma di campioni come il tessuto cerebrale, foglia edera o apici radicali di A. thaliana e N. benthamiana, la conservazione della ultrastruttura è migliorata con la tecnica HPF rispetto al fissaggio chimico 20, 21. Con PF, gli esperimenti sono stati eseguiti su cellule in sospensione. Pertanto, non v'è alcuna indicazione del successo di questa tecnica sullarger campioni come tessuti. Ulteriori esperimenti devono essere condotti per affrontare questo punto. Tuttavia, il metodo è stato testato con successo con fungo filamentoso Podospora anserina che non è isolato cellule, ma è piuttosto della forma micelio 22.

Il metodo presentato in questo articolo rappresenta un significativo miglioramento rispetto ai metodi attuali di fissaggio chimico o HPF. Ad esempio, PF non richiede costose attrezzature o consumabili in contrasto HPF 23. Si deve anche essere presa perché la tecnica HPF utilizza una grande quantità di azoto liquido (circa 80 L per esperimento). Con la tecnica proposta, un importante vantaggio è che nessuna apparecchiatura importante è necessario 23. Così, il costo di un esperimento è molto più basso (circa cento volte più economico). Un altro vantaggio è che nessuna competenza particolare è necessaria perché la tecnica è facile da usare. Inoltre, il campione di trasformazione of PF / freeze-sostituzione è molto più breve HPF / freeze-sostituzione a causa del processo di riscaldamento che richiede meno di 6 ore invece di 24 ore 24. Non è più tempo di quanto la fissazione chimica convenzionale. Il vantaggio è che l'ultrastruttura cellulare è perfettamente conservato con artefatti minimi ed è molto più vicino alla stato originale delle cellule. L'applicazione di questa tecnologia sarà certamente utile per studiare diversi eventi biologici rapidi o per localizzare le proteine ad alta risoluzione per le cellule coltivate in sospensione e per campioni di spessore pochi micrometri, come ife fungine 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

Esprimiamo la nostra gratitudine a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, e A. Devin per il loro aiuto e commenti sul manoscritto. Siamo grati al polo di imaging elettronico di Bordeaux Imaging Center, dove sono state scattate le immagini. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centre National de la Recherche Scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100, (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168, (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130, (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203, (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4, (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3, (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3, (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58, (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235, (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8, (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48, (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21, (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9, (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47, (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51, (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195, (1), 41-48 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats