Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison
Published 2/19/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi har utformat en kontinuerlig odlingsapparat för användning med optogenetic system för att belysa kulturer av mikrober och regelbundet bildceller i utflödet med ett inverterat mikroskop. Odlingen, provtagning, bildbehandling och bildanalys är helt automatiserad så att dynamiska svar på belysning kan mätas under flera dagar.

Cite this Article

Copy Citation

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Optogenetic system utnyttjar genetiskt kodade proteiner som ändrar konforma som svar på specifika våglängder av ljus för att förändra cellulära processer. Det finns ett behov för odling och mätsystem som innehåller programmerade belysning och stimulering av optogenetic system. Vi presenterar ett protokoll för att bygga och använda en kontinuerlig odlingsapparat för att belysa mikrobiella celler med programmerade doser av ljus, och automatiskt förvärva och analysera bilder av celler i utflödet. Driften av denna apparat som kemostat tillåter tillväxttakten och den cellulära miljön att hårt kontrollerad. Utflödet av det kontinuerliga cellkulturen regelbundet samplas och cellerna avbildas av flerkanals mikroskopi. Odlingen, provtagning, bildbehandling och bildanalys är helt automatiserad så att dynamiska svar i fluorescensintensitet och cellulär morfologi av celler samplade från odlings utflöde mäts över flera dagarutan användarinmatning. Vi visar användbarheten av detta odlingsapparat genom att dynamiskt inducera proteinproduktion i en stam av Saccharomyces cerevisiae konstruerad med ett optogenetic system som aktiverar transkription.

Introduction

Optogenetic system använder ljus för att styra en växande lista av cellulära processer, inklusive genexpression, 1, 2, 3, 4, 5 proteinlokalisering, 6-proteinaktivitet, 6, 7, 8-protein-bindning, 8, 9, 10 och proteinnedbrytning. 11 En metod för odling av celler i en kontrollerad miljö med programmerad optisk stimulering och för att mäta deras svar över biologiskt relevanta tidsskalor är nödvändig för att utnyttja potentialen hos dessa verktyg för forskning inom cellbiologi och bioteknik. Vår metod drar fördel av chemostasis att bibehålla en konstant celltillväxthastighet i en välblandad, aeklassad, och temperaturreglerad glasodlingskärl 12, 13 som är utsatt för programmerad belysning. Vi avbilda enskilda cellerna i odlingen utflödet med ett inverterat mikroskop för att mäta svaret av kulturen till programmerad belysning. Odlingen, provtagning, avbildning, och bildanalys är helt automatiserade, så att fluorescensintensitet och cellulär morfologi i utflödet cellodling kan mätas över flera dagar utan användarinmatning.

Detta protokoll kan implementeras i de flesta labb bekanta med växande cellkultur och mikroskopi, och apparaten som används är billig och gjord av lätt tillgängliga komponenter. En transparent odlingskärl är placerat ovanför en matris av Ijusemitterande dioder (LED) som kan avge ett iW / cm 2 -10 mW / cm 2 av ljus. Mikrober odlas i odlingskärlet kontinuerligt; en peristaltisk pump används för att lägga till media iutspädningshastighet, en annan används för att dra tillbaka kulturen till en lägre hastighet till mikroskopet, och skillnaden försvinner genom ett bräddavlopp. En värmedyna upprätthåller temperaturen. Luft kontinuerligt pumpas in i odlingskärlet för att upprätthålla ett positivt tryck samt för att blanda och lufta kulturen. Med undantag för luftpumpen, är strömmen till dessa anordningar regleras av en mikrokontroller som också mottar insignaler från en termometer och en ansluten dator. Utflödet cellodling pumpas till en mikrofluidanordning på scenen av ett inverterat mikroskop. Icke-fluorescerande och fluorescerande bilder förvärvas automatiskt. Cellerna i bilderna kännetecknas av en algoritm som lokaliserar varje cell som ett område av intresse (ROI) och mäter egenskaperna för varje ROI.

För att demonstrera en tillämpning av detta protokoll, mätte vi svaret på varierande ljusintensitet av Saccharomyces cerevisiae-celler modifierade med en blåljus ansvave optogenetic system som kontrollerar transkriptionen av fluorescerande protein. S. cerevisiae, allmänt känd som bagerijäst, valdes på grund multipla optogenetic system för reglering genuttryck i detta system redan finns 14, 15, 16. Dessutom är denna modellorganism som vanligen används för studier i systembiologi 17 och som ett chassi för biotekniska tillämpningar 18, 19, 20. Våra representativa resultat visar att detta protokoll kan användas för att styra transkription av en kultur över flera dagar genom att variera inmatnings Ijusintensiteter och mätning av produktionen av ett fluorescerande reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1

Figur 1: Den kontinuerliga odlingsapparat. Detta förenklade diagram visar hur anordningen skall monteras när den används för att kulturen, belysa, och mäta optiska egenskaper hos mikroberna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Översikt av protokollet. Stegen i det skuggade området måste upprepas varje gång protokollet används. Sluten slinga är möjligt 34, men är inte implementerad i detta protokoll.

1. Montera Termometer till kretskortet


Figur 3: Anslutningar läsa termometer värden. Detta diagram visar hur den digitala termometern skall anslutas till kretskortet så att mikrostyrenheten kan få feedback för att kontrollera temperaturen i kulturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Löda Ground, data, och positiva spänningsledningar av den digitala termometern till deras respektive genomgående hål märkt "GD + V."
  2. Klippa av ett stift från en kvinnlig 3-stiftshuvud och trimma de återstående 2 stift med trådklippare, så att den kan passa in i de två genomgående hålen märkta "R2" och inte hindrar mikrokontroller. Löda detta på plats. Anslut de två lödda stift genom att sätta en 4,7 kW motstånd i stiftlist.

2. Anslut ström Controll Komponenter till kretskortet

figur 4
Figur 4: Anslutningar för att styra strömmen till värmedyna. Detta diagram visar hur PCB och tillbehörsdelar skall monteras för att styra effekten till värmedyna. Delarna för att styra de peristaltiska pumparna är anslutna på ett liknande sätt. Notera att komponenterna för termometern har avlägsnats för tydlighets skull. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Trimma bort 1 cm från stiften i fem kvinnliga 3-stiftlister. Löd dessa positioner på kretskortet (PCB) markerade som "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" och "CB E."
  2. Trimma bort 1 cm från stiften i en hona 6-pin och 8-pin header. Löda dessa sida vid sida för attkolonnen genomgående hål märkt K1 genom K14.
  3. Anslut värmedynan till kretskortet.
    1. För in ändarna av ett 100 kQ resistor i de genomgående hålen märkt K1 och K2 på kretskortet. Infoga en metall-oxid-halvledarfälteffekttransistor (MOSFET) in i läget markerat # 1 på kretskortet, med etiketten på MOSFET vänd mot K1 genom K14 genomgående hål så att käll stiftet är närmast den "# "etikett, och drain-stiftet är längst bort från" # "etikett.
    2. Skär jordledningen för 5 V likström (DC) elkabel och anslut den till J2. Anslut jordledningen av värmedynan till J1. Anslut K3 till stift 3 med en 1 kQ resistor. Ström ska nu bara strömma från J1 till J2 när stift 3 är inställd på + 5V.z
      OBS: motstånd / MOSFET set fungerar som en switch som tillåter ström att flyta från stift J1 till J2 när stift 3 i mikro sätts till 5 V.
  4. Anslutaden långsamma peristaltisk pump.
    1. Sätt ändarna av en 100 kW motstånd i de genomgående hålen märkt K4 och K5 på kretskortet. Infoga en MOSFET till läget märkt # 2 på kretskortet, med etiketten på MOSFET vänd mot K1 genom K14 genomgående hål så att käll stiftet är närmast den "#" etikett, och drain-stiftet är längst bort från "#" etikett.
    2. Skär jordledningen av 12 V DC elkabel för långsam peristaltisk pump. Anslut den peristaltiska pumpen inför slut på J3 och väggen vårtan inför slut på J4. Anslut K6 till stift 4 med en 1 kQ resistor. Ström ska nu bara strömma från J3 till J4 när stift 4 är satt till 5 V.
  5. Anslut snabbt peristaltisk pump
    1. Sätt ändarna av en 100 kW motstånd i de genomgående hålen märkta K7 och K9 på kretskortet. Sätt en MOSFET i positionen märkt # 3 på kretskortet, med etiketten på MOSFET vänd mot K1 genom K14 genomgående hål s o att källan stiftet är närmast den "#" etikett, och drain-stiftet är längst bort från "#" etikett.
    2. Skär jordledningen av 12 V DC strömkabeln av den snabba peristaltisk pump. Anslut den peristaltiska pumpen inför slut J5 och väggen vårtan inför slut på J6. Anslut K9 till stift 5 med en 1 kQ resistor. Ström ska nu bara strömma från J5 till J6 när stift 5 är satt till 5 V.

3. Anslut LED Matrix till kretskortet

figur 5
Figur 5: Anslutningar för att styra LED matrisen. Detta diagram visar hur LED matrisen bör vara ansluten till kretskortet. Det visar också att kretskortet kan staplas på mikroprocessorn. Notera att komponenterna för termometern och för att styra likströmseffekt till andra enheter har tagits bort för tydlighets skull.es / ftp_upload / 54.894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Löda 6-pin, 10-polig, och de två 8-stift kvinnliga stiftlister i genomgående hål på sidorna av PCB så att den kan staplas ovanpå mikrokontroller.
  2. Löda 100 nF och 10 iF kondensatorerna till sina rättade positioner på kretskortet, noterar att den negativa terminalen på 10 iF kondensator (kortare bly) ska anslutas till det genomgående hålet märkt med ett minustecken.
  3. Löda LED driver till 2 genom 12 uppsättning av genomgående hål, med inbuktningen på förar långt från de genomgående hålen som är reserverade för LED-matris.
  4. Löda 2 kolumner manliga stiftlister till genomgående hål markerade för LED matris, och trimma ändarna av dessa under bakbord så att de inte kommer att hindra mikro. Anslut dessa till två 8-tråd remsor av kvinnliga / kvinnliga hoppare ledningar. Ansluta en andra uppsättning av manligastiftlister till andra änden av bygeltrådar.
  5. Sätt LED matris över medianen av bakbord och sedan in den andra uppsättningen av stiftlister till kolumnerna på vardera sidan av matrisen. Se till att de elektriska anslutningarna är densamma som om LED matrisen hade i direkt anslutning till PCB med etikettsidan av matrisen som motsvarar den märkta kolonn av genomgående hål.
  6. Klippa av ett stift från en kvinnlig 3-stiftshuvud och trimma de återstående 2 stift med trådklippare, så att den kan passa in i de två genomgående hål som är märkta "R1" och inte hindrar mikrokontroller. Löda detta. Anslut de två lödda stift genom att sätta in en en kQ resistor i stiftlist.
    Obs: odlingskärlet kommer att staplas över LED-matrisen. Om tråd band hindrar kärlet, offset dem från matrisen. Använd sedan fast kärna tråd för att överbrygga klyftan mellan matrisstiften och tråd band stift, så att de elektriska anslutningarna inte Change.

4. Installera programvara och ansluta till Hardware

  1. Stack PCB på mikrokontroller.
  2. Följ länkarna i listan material att hämta integrerad utvecklingsmiljö (IDE) och anpassad kod för mikrokontroller.
  3. Ansluter mikrostyrenheten till mikroskopet dator via en AB universal serial bus (USB) kabel. Sammanställa och ladda upp egen kod till mikrokontroller.
  4. Ladda ner Micro-Manager 21, 22 och Fiji 23. Konfigurera Micro-Manager som FIJI plugin genom att kopiera alla ".dll" -filer, den "mmplugins" katalog, och "mmautofocus" katalogen från katalogen där Micro-Manager var ner till "Fiji.app" katalogen. Dessutom, kopiera "plugins / Micro-Manager" katalog i "Fiji.app/plugins" katalogen.
  5. Ladda ner "BioreactorController.jar" fil into "Fiji.app/mmplugins" katalogen.
  6. Öppna Micro-Manager från Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Använd Hardware Configuration Wizard för att konfigurera programvara för att styra mikroskopet. Inkludera "FreeSerialPort" enhet i guiden med etiketten hamnen som AB USB-kabeln är ansluten.

5. Gör och karakterisera den ljustät inneslutning för odlingskärlet

  1. Stapla tre åtta stift IC-socklar som byggstenar på kopplingsdäcket vid varje hörn av LED matrisen så att odlingskärlet kan vila på dem ovanför matrisen.
  2. Fästa en del av diffusion papper under det översta lagret av hylsorna, så att ljus som träffar odlingskärlet från LED matrisen är diffus.
  3. Skär ut tre 8 "med 6" delar av svart skum. Skära ut en del som är av samma storlek som den elektroniska kopplingsdäck (2,3 "x 3,5") från insidan av den första two och en del som är storleken på rektangeln som gjorts av IC-socklar (0,9 "x 1,8") från insidan av den tredje. Stack dessa lager över LED matrisen så att det sista lagret som innehåller 0,9 "x 1,8" öppning ligger även med toppen av IC-socklar, och omger LED matrisen.
  4. Skär ett extra ark av svart skum i halv att göra en 6 "med 24" rektangel. Rulla in i en ihålig kolonn av svart skum som odlingskärlet kan passa in med plats för rör och trådar, så att den termiskt och optiskt kommer isolera odlingskärlet.
  5. Centrera ihåliga pelare av svart skum över LED matris, och markera gränsen för kolonnen på lager av svart skum under den. Denna gräns kommer att markera var den ska centreras i framtiden.
  6. Skära ut en 3 "x 3" -delen av svart skum. Använd denna senare som ett lock som kan tejpas till toppen av kolonnen för att blockera externt ljus.
  7. Fäst fotodiod effektsensorn till th e odling fartygets mössa med tejp, fäster locket och sätt i odlingskärlet i inneslutningen.
  8. I Micro-Manager, gå till Plugins> Bioreaktor Controller. Ställa matrisen för att lysa vid en delmängd av de möjliga intensiteter vid 30 s intervaller.
  9. Registrera ljusintensitet som visas på wattmetern konsolen är ansluten till effektsensorn. Dessa mätningar gör det möjligt för den faktiska intensiteten av ljus att vara känd när antalet lysdioder som är tända och pulsbreddmodulerade (PWM) ström till dessa lysdioder är inställd.

6. Bered odlingskärlet

figur 6
Figur 6: fartygs anslutningar. Diagrammet visar hur fartyget och slangar av apparaten ska anslutas innan de autoklaveras.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Mark höjden motsvarar varje 2 ml inkrement av vätska i området från 10 ml till 30 ml i odlingskärlet. Sätt 10 ml sterilt avjoniserat vatten, markera vattennivån, tillsätt 2 ml, markera vattennivån, och upprepa tills 30 ml nivån är markerad. Täck markeringarna med genomskinlig tape så att de inte lätt avlägsnas, och förfoga över vätskan.
  2. Placera den långa änden av aluminium port via silikonpackning, in i odlingskärlet. Skruva på locket.
  3. Täck en kort aluminiumport utlopp med 1/16 "ID kisel slang. Anslut den distala änden genom att sätta in en honluerlåset och sedan ansluta en luer lås kontakten. Detta uttag är kompletterande, och kommer inte att användas (röret 6 i figur 6 ).
  4. Ansluta två korta segment av 1/16 "ID silikonslang med manliga och kvinnliga luer lås. Anslut ena änden till en kort aluminium port utlopp och anslut distal slutet med en luer och honluerlåset plugg. Fartyget kommer att inokuleras genom detta rör (rör 7 / 7,1 i figur 6).
  5. Ansluta två 1/16 "ID rör till ändarna av 1/16" ID peristaltiska slangar och kopplingar. Anslut ena änden till en kort aluminium port och anslut den andra (rör 4 i figur 6). Senare kommer det att anslutas till mediekolven.

7. Förbered Media Flask

  1. Anslut en 1/16 "innerdiameter (ID) silikonslang till den längsta aluminium porten. Röret bör vara tillräckligt lång för att nå media kolven. Anslut en 1/8" ID manliga luerlock till ett kort segment av 1/16 " ID slangar, anslut den till föregående röret ,, och sedan infoga denna korta segmentet i gummiproppen på media kolven (rör 3 i figur 6).
  2. Spänna fast röret. Denna anslutning tillåter luft att strömma från media kolven till odlingskärlet. När media kolven senare pumpas med luft end detta rör är ospänt, kommer odlingen att blandas, luftad, och hölls vid ett positivt tryck av inkommande bubblor.
  3. Sätt en 1/16 "ID slang tillräckligt länge för att nå botten av kolven i proppen, genom vilka medier kommer att överföras. Anslut en annan 1/16" ID röret till detta, och sedan en 3/16 "ID slang till det. Anslut detta med en 3/16 "ID honluerlåset och en manlig luer lås plugg (rör 1 / 1,1 i figur 6).
  4. Det tredje hålet i proppen bör fyllas med ett kort segment av 1/16 "ID slang, ansluten till två andra segment av slangen medeldiameter och ansluten vid den distala änden (rör 2 / 2,1 i fig 6). Detta kommer att anslutas till en vakuumpump och senare till ett akvarium pump.
    OBS: Om slangen inte lätt kan passa genom hålen i gummiproppen, skär ändarna av slangen på en vinkling. Sedan kan den lutande änden som trycks genom hålet användas för att dra resten igenom.

  1. Sätt en luer lås i ett segment av 1/16 "ID silikonslang, och sedan ordentligt sätta 0,022" ID polytetrafluoretylen (PTFE) slang. Separat bifoga en honluerlåset till en 1/16 "ID röret. Därefter tråd ena änden längs PTFE röret för att ansluta lås och den andra till en kort aluminium port (rör 5 i figur 6).
  2. Anslut den exponerade 1/50 "ID silikonslang till 1/50" ID peristaltiska rör och kopplingar. Till detta ansluter tre segment av 1/50 "ID slang och två segment av 0,022" ID PTFE slang, omväxlande dem. Anslut detta till utflödet kolven via 1/16 "ID slang (rör 5 i figur 6).
  3. Ansluta en ände av en 1/16 "ID silikonslang till den näst längsta röret av aluminium port och den andra änden till utflödet kolven. Denna aluminiumtub ställer odlingsvolymen, och överskott av kulturen flödar i utflödet behållaren (röret 8 i
  4. Autoklavera odlingsanordningen vid 121 ° C och 15 psi (allmänt sterilisering) under 30 min.
    Notera: De rör genom vilka medierna kolven är fylld, genom vilken medie Kolven dammsugas, och genom vilken odlingskärlet ympas ha flera segment av slangen så att om det distala segmentet är förorenad, kan den avlägsnas för att avslöja en steril segmentet.

9. Förbered mikroflödessystem kanal

  1. Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) och härdningsmedel i en 9: 1-förhållande. Degas och häll på kiselmasterform.
  2. Bota PDMS för 2 timmar vid 65 ° C och sedan klippa det från masken med ett rakblad. Skär runt PDMS tills den lossnar från formen. Undvik att trycka ned och bryta den bräckliga skivan.
  3. Använda en 1,2 mm ID biopsi hålslaget att stansa hål i båda ändar av kanalen.
  4. Plasma bond PDMS till täckglaset 24.
  5. Tejpa den långa ändar av täckglaset till det stödjande aluminiumram så att PDMS-kanalen är centrerad på aluminiumramen, och sedan baka PDMS igen under 2 h vid 65 ° C.

10. Fyll Media Flask

figur 7
Figur 7: Lägga till media. Diagrammet visar hur medier bör vara vakuumfiltrerades i media kolven. Den ser till att medierna förblir steril. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Gör lämpliga medier. Om den kontinuerliga odlingssystemet kommer att drivas som en kemostat använder media begränsade till ett visst näringsämne.
    OBS: Exempel på standardmedier komposition för studier med S. cerevisiae har tidigare publicerats 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fäst vakuumfilter till en 100 ml flaska, ta bort bröstvårtan täcka, sedan bort den vita kontakten från bröstvårtan av vakuumfilter med sterila pincett.
  3. Anslut 3/16 "ID silikonslang till bröstvårtan, media kolven övriga fri rör till en vakuumpump (rören 1 och 2 i figur 7, respektive), och se till att röret som sammanbinder media kolven till odlingskärlet är fastklämd stänga (rör 3 i figur 7).
  4. Fyll filtret med media, slå på vakuumpumpen, och sedan filtrera resten av media. Kläm fast 1/16 "ID silikonslang kopplad till vakuum (rör 2 i figur 7) och stäng av vakuumpumpen.
  5. Avlägsna de leurs från det mellanliggande segmentet av 1/16 "ID rörledning är förbunden med vakuumpumpen, så att en frisk ände av röret är åtkomlig. För in the blå delen av en steril spruta luftfilter i detta rör.
  6. Kläm fast 3/16 "ID silikonslang (rör 1 i figur 7) och koppla bort luer från den. Dra ut stickkontakten ur den kvinnliga luer av odlingskärlet inlopp mediaröret. Anslut dessa manliga och kvinnliga Luers så att media är pumpas in i odlingskärlet.
  7. Avlägsna vakuumfilter och locket 100 ml flaska media som anslöts till vakuumfilter.
  8. En dag före odlingskärlet ska ympas, ympa en enda koloni av optogenetic mikroben i ett provrör med 4 ml media som samlats in i föregående steg, och låta det växa över natten vid 30 ° C eller kulturen optimala tillväxttemperaturen med omröring.

11. Sätt ihop apparaten Runt Mikroskop

  1. Ställ den kontinuerliga odlingsenheten nära mikroskop med media kolven högre än odlingskärlet och effluent kolv lägre än odlingskärlet, så att röret sammansatt av segment av 0,022 "ID PTFE slang (rör 5 i figur 6) kan nå mikroskop scenen. säkert tejpa ner gummiproppar på media kolven och avloppsbehållaren.
  2. Koppla ur ändarna på 0,022 "ID PTFE-slang från 1/50" ID silikonslang ansluter dem (rör 5 i fig 6), och koppla dessa ändar in i inloppet och utloppet av mikrofluidanordningen.
  3. Anslut den vita änden av sprutluftfiltret till akvariet pumpen. Lufttrycket kommer att driva media i odlingskärlet.
  4. När media når nivån för utflödet porten, linda 1/16 "id medieinloppsslang och kontakter runt långsam peristaltisk pump (rör 4 i figur 6) och 1/50" ID provutloppsröret och kontakter runt den snabba peristaltisk pump (rör 5 i figur 6).
  5. Lufta media genom lossning luften tuvara mellan media kolv och odling kärlet.
  6. Tejpa värmedyna och termometer till odlingskärlet, så att dess temperatur kan regleras. Rulla mediaslangen runt odlingskärlet så in media kommer att vara i samma temperatur som fartyget.
    OBS: PWM ström till värmedynan är reglerad av mikrostyrenheten som använder insignaler från termometern för att hålla odlingskärlet vid dess börvärdestemperatur.
  7. Sätt i odlingskärlet i den svarta skuminneslutningen över LED matris, och se till att rören inte kläms.
  8. I Micro-Manager, gå till Plugins> Bioreaktor Controller. Ställ "Media pumpförhållande på" fältet till 0,1 och "Provpump förhållande på" fältet till 0. Flödet kommer att vara mycket låg, men högre än avdunstningshastigheten.
  9. Kläm den inkommande luftslangen mellan media kolven och odlingskärl. Ta ut kontakten ur ympning röret (röret 7 i figur
  10. Täck inneslutningen så att inget ljus kommer in, och låta kulturen växa över natten.

12. Kalibrera pumphastigheter

  1. I Micro-Manager, gå till Plugins> Bioreaktor Controller. Ställ "Media pumpförhållande på" fältet till 0,5 och "Provpump förhållande på" fältet till 0.
  2. Koppla från överströmningsrör från utflödet kolven (rör 8 i figur 6) och provtagningsröret från utflödet kolven (rör 8 i figur 6) och samla effluenten i separata kärl. Samla utflödet under 1 timme, med början efter pumparna har varit på under 15 minuter.
  3. Beräkna flödet av medier i odlingskärlet från den volym uppsamlas i kärlet som:
  4. Justera värdet av "Media pumpförhållande på" fältet genom denna linjära uppskattning:
    Equaiton 2
    var
    Equaiton 3
  5. Iterera genom denna kalibreringsförfarande tills skillnaden mellan den önskade flödeshastigheten och den uppmätta flödeshastigheten är <0,2 ml / h, där flödeshastigheten är ett genomsnitt över en tidsperiod på 1 timma.
  6. Öka värdet av "provkvot på" fältet och kalibrera den på ett liknande sätt tills ungefär 4/5: e av volymen som lämnar odlingskärlet pumpas ut av provtagningspumpen och ungefär 1/5: e volymen lämnar genom överströmnings porten.
  7. Låt kulturen tätheten i den kontinuerliga odlingsapparaten jämvikt under dessa förhållanden över natten.
    OBS: Om målet flöden inte kan nås, förändringden peristaltiska pumpslangen. Vätskan pumpas vid en högre hastighet när slangar med större diameter används. Följ steg 14 och sedan återgå till steg 8,4.

13. Samla mikroskopbilder av odlade mikrober

  1. Fyll scenen Position listan i Micro-Manager med en uppsättning av icke-överlappande positioner på vilka bilder av celler pumpas in i mikroflödessystem kanal kommer att vara i fokalplanet.
  2. Öppna "Bioreaktor Controller" plugin. Välj önskad LED matris tidsförloppet, imaging-kanaler, och andra experimentella inställningar från anvisningarna. Samla in och analysera bilder.
  3. Medan experimentet körs ser till att materialet i media kolven förblir klar. Om det är molnigt, då det har förorenats.

14. Post-experiment

  1. Avyttra media, överskott cellodling och avloppsvatten.
  2. Fyll mediekolven med 200 ml 20% EtOH blandades med avjoniserat vatten. Kör kemostaten som den hade tidigarekörts under försöket att tvätta bort cellrester och media.
  3. När alkohollösningen har runnit från media kolven isär kemostat helt.
  4. Tvätta glas och rör med varmt vatten och milt rengöringsmedel, och skölj noga med avjoniserat vatten. Låt torka.
  5. Öppna "microcontrollerRecords.csv" filen för att granska temperatur och LED matris status under loppet av experimentet till "Summary.csv" fil granska sammanfattningsdata från varje uppsättning av bilder och "Resultat <n> .csv" filer att granska data som sammanfattar varje ROI från varje tidsperiod, där n är den n: te datamängden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna apparat användes för att stimulera en kultur av S. cerevisiae som uttrycker gult fluorescerande protein (YFP) som svar på blått-ljus via en inducerbar optogenetic transkriptionssystem baserat på cry2 / CIB1 proteinparet 30. Celler odlades chemostatically i fosfatbuffrad begränsad media med en genomsnittlig utspädningshastighet av 0,2 ± 0,008. Fosfat begränsning används ofta i S. cerevisiae kemostat experiment för att kontrollera tillväxt och effekterna av fosfatbegränsning är väl karakteriserade. 31, 32, 33 Utflödet från den kontinuerligt utspädda odling Kärlet samplas till en mikrofluidanordning på ett inverterat mikroskop. Bilderna analyseras automatiskt såsom visas i figur 8. Individuella celler identifierades i bakgrunden korrigerad fas-kontrastrika bilder och deras YFP Concentraningen uppskattades från deras fluorescens mätt från bakgrundskorrigerad fluorescerande bilder.

Fluorescensen hos 169,677 celler analyserades från 33.600 bilder av effluenten som förvärvats från 28 platser i mikroflödessystem enheten under de 70 h av försöket. Vi använde ett inverterat mikroskop utrustat med ett fluorescensbelysningssystem och en CMOS-kamera. YFP bilder förvärvades med en 500/20 nm excitationsfilter, en 535/30 nm emissionsfilter och en T515lp dikroiska. Bilder togs med en 40X faskontrast mål under Köhler belysning. Bilder registrerades i 16-bitars färgdjup med 87 pixlar per mikrometer kvadrat. Kulturen exponerades för varierande intensiteter av blått ljus för 6 timmars intervall, följt av fullständigt mörker under 6 timmars intervall. Kulturen hade utsatts för ljus innan den första mätningen, vilket är anledningen till dess fluorescensintensitet minskar under första mörka perioden. </ P>

Figur 9 visar fluorescens grund av YFP produktion vid aktivering av optogenetic systemet som svar på belysning av odlingskärlet. Det visar användbarheten av encelliga mätningar av fluorescens över en population mätningar genomsnittliga-encelliga avslöja populationsfördelning av fluorescensintensitet. Notera avvikare vid 42 h 26 min. Efter att ha granskat de motsvarande bilder, var det uppenbart att det fanns klumpar av celler i majoriteten av de bilder som används för att generera den sammansatta bilden av bakgrunden, vilket resulterar i artefakter som liknade celler i bakgrunden-korrigerad bild. Dessutom var en bubbla från odlingskärlet pumpas till mikroflödessystem kanal och delar av dess kanter var misstas som celler genom bildanalysalgoritmen. Eftersom varken bubblan eller artefakter från att subtrahera bakgrunden motsvarade faktiska celler, deras uppmätta fluorescensintensitetenär lägre än den auto-fluorescens av cellerna. Denna siffra visar kvaliteten på de uppgifter som automatiskt kan förvärvas under 3 d. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8: Visuell skildring av bildanalysalgoritmen. Dessa bilder har beskurna och expanderat för att underlätta visning. (A) Sex bilder förvärvas att generera bakgrunden korrigerad faskontrast bild av cellodlingen. Efter huvudbilden förvärvas, är ytterligare fem bilder som förvärvats med utflödet-provtagningspumpen kort påslagen mellan varje förvärv för att säkerställa att cellerna förskjuts. En sammansatt bild av bakgrunden genereras från de fem komponentbilderna. Värdet för varje pixeli bakgrundsbilden är medianvärdet i samma pixel över 5 komponentbilderna. (B) Bakgrunden korrigerad bild omvandlas sedan till en binär. Det binära sedan utvidgas och hålen i kontinuerliga delar av binära fylls. De gula konturer motsvarar utvalda regioner av intresse (ROI), som baseras på storlek och cirkularitet kriterier. (C) Dessa ROI avbildas på fluorescerande bild, där fluorescens varje cell mäts som värdet av de ljusaste pixeln i ROI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 9
Figur 9: Population distribution av fluorescensintensiteter över tiden. I dessa subfigures logaritmen av uppmätt fluorescence visas, efter praxis i flödescytometri. Linjen i A och B indikerar intensiteten hos det ljus som absorberas eller diffrakteras av den kultur, som mäts som skillnaden i intensitet mellan ljus som transmitteras genom sterila media och ljus överförs genom cellodling i odlingskärlet. Det är avsatt mot den andra ordinata axeln. (A) En ruta och whisker plot (5: e percentilen, 25: e percentilen, medianen, 75: e percentilen, 95: e percentilen) av logaritmen av den uppmätta fluorescensen av befolkningen över tiden. (B) En 2-dimensionell histogram av samma data som, där färg motsvarar den normaliserade frekvensen av celler med en uppmätt fluorescens i området av det motsvarande bin. Färgerna skalades till dataområdet utan avvikande vid 42 h 26 min ingår. Den normaliserade frekvensen av utliggaren i den lägsta fluorescens binär 0,7. (C) endimensionell histogram av logaritmen av den uppmätta fluorescensen av befolkningen innan den första registrerade exponering för ljus och efter den största exponeringen för ljus. Det visar att ljus inducerat uttryck av YFP i denna stam är bimodal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utformat denna apparat med flexibilitet i åtanke. All kod som används är gratis och öppen källkod. Processen standard bildanalys att segmentera celler är enkel och går snabbt. Anpassad analys skulle kunna genomföras genom att registrera användarens input samtidigt analysera en representativ bild med FIJI grafiska användargränssnittet, omvandlar insignalen till en Beanshell script, och sedan ställa in plugin för att ringa skriptet. När det kallas, kommer skriptet skickas en sträng array med namnet "bilder" som innehåller de sökvägar till den senaste uppsättningen av bakgrundskorrigerad bilder. Bilder och data sparas när de samlas in, så att de inte går förlorade om ett experiment slutar abrupt. En blå LED array valdes för att framkalla vår optogenetic systemet men det skulle kunna ersättas med lysdioder i olika färger. Det finns ytterligare ingångs- och utgångsstift finns på mikro samt genomgående hål för en ytterligare MOSFET switch och reläbrytare på kretskortet som gör det enkeltför detta system anpassas för mer komplexa syften. Till exempel, för att göra denna apparat fungerar som en turbidostat, använda ytterligare stiften på mikro att driva en lysdiod och läsa värden från en ljussensor fastspänd på odlingskärlet, och sedan modifiera programvaran för att mäta grumlighet och späd fartyget i enlighet .

Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att kulturen inte är förorenad, för att skydda känslig mikroskopi utrustning, och se till att vätskeflödeshastigheter är konsekventa. Föroreningar före när odlingskärlet avsiktligt ympas kan upptäckas genom att vänta några dagar innan ympning fartyget och kontrollera att det inte finns någon tillväxt inuti. För att undvika att spilla cellodling på mikroskopobjektivet, kontrollera att mikroflödessystem enhet inte kommer att läcka genom att först pumpa cellodling genom den över en absorberande duk. Om flödet av material i odlingskärlet är inkonsekvent, är det oftast på grund av röret runtrullarna i den peristaltiska pumpen har blivit alltför lös. Om luftflödet från akvariet pumpen är inkonsekvent, se till att det inte finns några U-formade böjar i utflödet röret där vätska kan pool och inkonsekvent motstå luftflöde. Om slangen täpps igen efter ett experiment eftersom media har torkat upp inne i det, blöt tilltäppta rören i ett hett vattenbad för att upplösa täppa.

Det finns inneboende begränsningar i detta protokoll att tänka på när man planerar ett experiment eller analys resultat. Beroende på utspädningshastighet och längden av röret som används, det finns en fördröjning på ungefär 10 minuter, under vilken cellkulturen pumpas från odlingskärlet till mikroskopet. Därför är det inte väl lämpad att studera händelser som inträffar över kortare tidsskalor. Också, medan ett experiment kan köras kontinuerligt under ca tio dagar, endast begränsad av volymen av media, utvecklingen av cellkulturen måste betraktas som den hela experimentet ökar. den begränsade titing näringsmedie har djupgående effekter på ämnesomsättningen och genuttryck 35, 36, 37, 38, 39 och bör därför bestämmas utifrån aspekten av fysiologi under utredning. Vid analys av resultat, bilderna-särskilt bilder perifera datapunkter-bör ses över för fel på det sätt som ROI identifierades genom bildanalys rutin. Det är möjligt för bubblor eller artefakter som ska förväxlas med celler, och därigenom skeva den uppmätta fluorescens. Ett enkelt sätt att eliminera sådana felaktiga mätningar är att kasta alla ROI med fluorescensintensiteter under auto-fluorescensintensitet.

Detta protokoll kommer att vara användbar för mätning av fluorescensintensitet och / eller cellulär morfologi hos effluenten cellodling som svar på ljus i organismer som kan växa i kontinuerlig odling, inställdTLE till en konsekvent fokalplan när inte rört, och identifieras automatiskt av en bildanalysalgoritmen. Standardcellidentifikations algoritm som används här kommer att vara mest direkt tillämplig på ungefär sfäriska mikrober som liknar spirande jäst. Ett alternativ 40 till detta protokoll är att växa mikrober i en uppsättning satskulturer, och sedan prova ett parti för varje tidpunkt och karakterisera provet genom flödescytometri. Men fördelarna med det protokoll som beskrivs här är att prover tas från samma kultur, kan många prover tas, och processen är automatiserad. Detta protokoll förbättrar också på en liknande metod där optogenetic jäst var kontinuerligt odlade och avbildas under ett mikroskop 34 genom att förvärva flera bilder snabbt och inte polarisering ROI identifiering genom fluorescens. En stor fördel med detta protokoll är att många mätningar av individuella celler kan regelbundet förvärvas under flera dagar utan bUT inmatning från användare. Efter mätning av responsen hos den mikrobiella kulturen till ljusexponering kan ett nästa steg vara att genomföra in silico sluten slinga-kontroll av svaret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Vi vill tacka för Molly Lazar och Veronica Delgado för att få hjälp att testa protokollet, Kieran Sweeney för hjälpsamma diskussioner och redigering, och Taylor Scott, My An-adirekkun, och Stephanie Geller för kritisk läsning av manuskriptet. Megan Nicole McClean, Ph.D. har en karriär Award vid vetenskapligt gränssnitt från Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10, (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58, (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20, (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134, (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11, (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24, (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11, (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27, (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52, (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20, (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112, (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10, (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189, (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14, (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22, (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90, (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1, (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14, (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104, (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322, (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41, (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23, (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6, (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19, (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21, (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10, (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4, (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11, (4), 449-455 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats