बैक्टीरियल Histidine Kinase Autophosphorylation की मात्रा एक nitrocellulose बाध्यकारी परख का उपयोग

Biochemistry

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Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

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Abstract

Introduction

अनुकूलनीय प्रतिक्रिया बैक्टीरियल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। आदेश का पता लगाने और पर्यावरण परिवर्तन के लिए प्रतिक्रिया करने में, जीवाणु एक प्रोत्साहन-प्रतिक्रिया दो घटक संकेत के रूप में जाना जाता प्रणाली का उपयोग करें। 1,2 एक ठेठ दो घटक प्रणाली में, हिस्टिडीन काइनेज एक आत्मीय प्रोत्साहन का पता लगाता है, इसकी संरक्षित हिस्टिडीन अवशेषों autophosphorylates, तो एक प्रतिक्रिया नियामक प्रोटीन का रिसीवर डोमेन पर एक संरक्षित aspartate अवशेषों को फॉस्फेट हस्तांतरण। 3 इस घटना की प्रतिक्रिया नियामक है, जो एक बहाव के प्रभाव को बढ़ावा देने की गतिविधि में एक परिवर्तन हो सके। 4,5 इस प्रकार, बैक्टीरिया भावना और स्थानीय वातावरण में बदलाव के लिए अनुकूल करने में सक्षम हैं। कुछ दो घटक सिगनल प्रणाली इस मूलरूप आदर्श से विचलित। कुछ मामलों में, हिस्टिडीन काइनेज का संवेदी डोमेन एक खड़े अकेले प्रोटीन है, जो सीधे संवेदी इनपुट का पता लगाता है और एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के माध्यम से kinase गतिविधि को संशोधित करता है। 6 - 8 हालांकि, फंडamental प्रक्रिया और प्रणाली के समग्र भूमिका ही रहता है। दो घटक संकेतन एक सर्वव्यापी प्रोत्साहन-प्रतिक्रिया प्रणाली है कि बैक्टीरियल अस्तित्व के लिए आवश्यक है, और हिस्टिडीन kinases संकेत के पारगमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। 9

बैक्टीरियल जीव विज्ञान के लिए हिस्टिडीन kinases के महत्व के बावजूद, वे खराब विशेषता रहते हैं। इस phosphohistidine के निहित अस्थिरता, और autophosphorylation मापने के लिए एक व्यावहारिक विधि की कमी के कारण है। Phosphohistidine से phosphoserine, phosphothreonine, और phosphotyrosine अधिक अस्थिर है। 10 इस प्रकार, तकनीक है कि आमतौर पर Ser / Thr / Tyr kinases विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं हिस्टिडीन kinases के लिए लागू नहीं कर रहे हैं। 11 इन विट्रो assays हिस्टिडीन kinases अध्ययन करने के लिए काफी हद तक एसडीएस पृष्ठ autoradiography तक ही सीमित कर दिया गया है। 12,13 इस विधि में, [γ- 32 पी] -ATP काइनेज साथ incubated है, और काइनेज के फोस्फोराइलेशन पोल से विश्लेषण किया हैyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) जेल के autoradiography द्वारा पीछा किया। इस विधि काइनेज autophosphorylation, साथ ही एक प्रतिक्रिया नियामक को काइनेज से phosphotransfer पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस विधि उल्लेखनीय कमियों है। पृष्ठ आधारित assays कम throughput और समय लेने वाली हैं। ऐसी सीमाओं एक प्रोटीन निस्र्पक और इसकी गतिज मानकों को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। हिस्टिडीन kinases अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक तरीका है कि हाल ही में प्रकाशित किया गया था autophosphorylation पता लगाने के लिए phosphohistidine एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है। 14 इस विधि 1-phosphohistidine और 3-phosphohistidine के बीच भेद का लाभ दिया है, वहीं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है, इस पद्धति एक बड़ी गतिशील रेंज या पता लगाने के उच्च ऊपरी सीमा पेशकश नहीं कर सकते। इस प्रकार, वहाँ एक तेजी से, कम श्रमसाध्य है, और अधिक संवेदनशील परख है कि इन महत्वपूर्ण प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक की जरूरत है।

यहाँ, हम का वर्णन है और घएक सावधानी से विकसित nitrocellulose बाध्यकारी परख है कि इन विट्रो में शुद्ध बैक्टीरियल हिस्टिडीन kinases के autophosphorylation यों इस्तेमाल किया जा सकता है emonstrate। इस परख उच्च throughput और पृष्ठ आधारित assays से भी कम समय लेने वाली है। विधि को भी phosphohistidine मात्रा का ठहराव है, जो पता लगाने और एक बड़ी गतिशील रेंज के एक उच्च ऊपरी सीमा प्रदान करता है के लिए सेरेन्कोव विकिरण का इस्तेमाल करता है। परख हिस्टिडीन kinases के लिए गतिज मापदंडों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

सावधानी: इस प्रोटोकॉल रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग में उचित प्रशिक्षण और निपटने की आवश्यकता है। जब इस परख प्रदर्शन, बीटा विकिरण परिरक्षण सहित अपेक्षित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें। रेडियोधर्मी कचरे, सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए के रूप में कचरे की बड़ी मात्रा में प्रयोग के चरण धोने के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं। सुनिश्चित करें कि कचरे को इतनी बड़ी बाल्टी या बोतल है कि आसानी से खत्म खटखटाया नहीं किया जाएगा या गिरा के रूप में एक ईमानदार कंटेनर में संग्रहित है। एक बार प्रयोग निष्कर्ष निकाला है, ध्यान से हस्तांतरण सभी तरल अपशिष्ट उचित रूप में चिह्नित करने के लिए रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर। देखभाल के साथ सभी सामग्री संभाल, और पास के एक गीजर काउंटर रखने के प्रदूषण के लिए कार्यक्षेत्र की निगरानी के लिए।

नोट: इस प्रोटोकॉल हमारे समूह से एक पहले से सूचना दी परख का एक संशोधित संस्करण है। एच 3 4 पीओ में 15 Phosphohistidine स्थिरता किसी भी uncharacterized हिस्टिडीन काइनेज इस पद्धति का उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। phosphohistidine सेंटक्षमता परीक्षण पहले से वर्णित किया गया है। 15 एक नकारात्मक नियंत्रण कि काइनेज शामिल नहीं है शामिल किया जाना चाहिए। इस क्रम में प्रत्येक नमूने से पृष्ठभूमि संकेत घटाना, और सुनिश्चित करें कि [γ- 32 पी] -ATP पर्याप्त झिल्ली से धोया जाता है करने के लिए आवश्यक है।

1. अभिकर्मकों और सामग्री की तैयारी

  1. हिस्टिडीन kinases शुद्ध जीवाणु संस्कृति से पहले इस परख का उपयोग करने के लिए।
    1. इस परख के विकास के लिए विब्रियो parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) से एक हिस्टडीन kinase (जीन आईडी 1189383) शुद्ध। अभिव्यक्ति वेक्टर पीईटी-23aHis-TEV में काइनेज NdeI और XhoI प्रतिबंध साइटों का उपयोग कर क्लोन, और उपज के लिए उत्परिवर्ती Vp1876 D499A निर्माण साइट निर्देशित mutagenesis बाहर ले।
    2. ई कोलाई BL21 (DE3) pLysS में प्लाज्मिड बदलने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर टीबी मीडिया में कोशिकाओं को विकसित। एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और chloramphenicol के साथ पूरक संस्कृतियों (34 माइक्रोग्राम / एमएल), और आंदोलन के साथ हो जाना(250 आरपीएम) एक आयुध डिपो के 600 0.6 करने के लिए।
    3. 25 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित, और 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृतियों बढ़ता है। centrifugation (5000 XG), sonication द्वारा lyse, और सेंट्रीफ्यूज द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं सेलुलर मलबे (18,000 XG) को हटा दें।
    4. उनकी टैग काइनेज नी NTA agarose उपयोग कर शुद्ध। एसडीएस पृष्ठ से पवित्रता की पुष्टि करें। प्रत्येक प्रोटीन के लिए शुद्धि का अनुकूलन, और पवित्रता इस परख का उपयोग करने से पहले की पुष्टि करें।
  2. 25 मिमी एच 3 पीओ 4 धोने समाधान तैयार है। आसुत विआयनीकृत पानी का 1 एल, 25 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एच 3 4 पीओ जोड़ें। इस समाधान का पीएच लगभग 2.0 है। बर्फ पर जगह 25 मिमी एच 3 4 पीओ।
  3. 325 मिमी एच 3 के एक 13x शेयर समाधान पीओ 4, तैयार काइनेज प्रतिक्रिया बुझाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इस समाधान का पीएच लगभग 1.5 है। बर्फ पर रखें 325 मिमी एच 3 4 पीओ।
    नोट: एच 3 पीओ 4
  4. एक 4x प्रतिक्रिया बफर स्टॉक से युक्त 160 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.0, 600 मिमी KCl, 16 मिमी 2 MgCl समाधान है, और 40% ग्लिसरॉल तैयार करें।
  5. स्थापित प्रोटीन एकाग्रता तरीकों (ब्रैडफोर्ड, यूवी विज़, आदि) द्वारा हिस्टिडीन काइनेज एकाग्रता यों। 16,17 एक एकाग्रता 4 बार वांछित अंतिम एकाग्रता है कि के साथ एक हिस्टिडीन काइनेज समाधान तैयार है। पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए, प्रतिक्रिया में अंतिम प्रोटीन एकाग्रता आदर्श कम से कम 5 सुक्ष्ममापी होना चाहिए।
  6. एक 4x radiolabeled तैयार [γ- 32 पी] लेबल हटाया गया एटीपी की उचित 4x एकाग्रता और लेबल के साथ -ATP समाधान: प्रयोग के लिए लेबल हटाया गया अनुपात।
    नोट: [γ- 32 पी] -ATP की राशि है कि इस मिश्रण में शामिल किया जाना चाहिए कितना [पर निर्भर है ^7; - 32 पी] -ATP अंततः प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए देखा जाएगा। 5 प्रतिक्रिया प्रति μCi - हम 0.1 के बीच लेकर अंतिम सांद्रता के साथ पर्याप्त संकेत प्राप्त किया है। यह महत्वपूर्ण है कि लेबल: लेबल नहीं किया गया एटीपी अनुपात एक भी प्रयोग में सभी प्रतिक्रियाओं के लिए स्थिर रखा जा सकता है। जब कई एटीपी सांद्रता वांछित हैं सीरियल dilutions, बनाया जाना चाहिए क्योंकि यह अच्छी तरह से लेबल रखें: सभी सांद्रता भर लेबल नहीं किया गया एटीपी अनुपात निरंतर। अंतिम एटीपी सांद्रता आम तौर पर 10 माइक्रोन के लिए कम से कम 1 मिमी से लेकर, और प्रत्येक एकाग्रता विश्वसनीय गतिज डेटा प्राप्त करने के लिए तीन प्रतियों में यत्न किया जाना चाहिए।
  7. 96- अच्छी तरह डॉट धब्बा तंत्र
    1. nitrocellulose झिल्ली (0.2 माइक्रोन रोमकूप आकार) के एक 8 सेमी x 12 सेमी टुकड़ा काट।
    2. एक डॉट धब्बा तंत्र में स्थिति nitrocellulose, यह सुनिश्चित करना है कि झिल्ली इस तरह से फिट बैठता है कि तंत्र बंद है, और सभी कुओं पूरी तरह से झिल्ली द्वारा कवर कर रहे हैं। जब वैक्यूम Appl है यदि सही ढंग से इकट्ठा किया है, वहाँ कोई हवा रिसाव होना चाहिएआईईडी।
    3. छानना इकट्ठा करने के लिए, एक माध्यमिक ओर हाथ फ्लास्क तंत्र कनेक्ट। वाल्व स्टेम से, पर्याप्त ट्यूबिंग कि इस तरह के तंत्र को आराम से माध्यमिक कुप्पी ढोने के बिना इस्तेमाल किया जा सकता कनेक्ट।
    4. Aspirator / वैक्यूम स्रोत के लिए माध्यमिक ओर हाथ कुप्पी कनेक्ट करें।
    5. परीक्षण है कि तंत्र पूरी तरह से तंत्र के लिए वैक्यूम लगाने से बंद है। उपकरण सही ढंग से इकट्ठा किया जाता है, एक मजबूत वैक्यूम कुओं के सभी में उपस्थित रहेंगे। सभी ट्यूबिंग कनेक्शन Parafilm में लपेटा जा सकता है या एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए लपेटो सरन।
    6. वैकल्पिक रूप से, अच्छी तरह से एक में निर्वात, प्रतिक्रिया बफर के pipet 100 μL परीक्षण करने के लिए। वैक्यूम काफी मजबूत अच्छी तरह के माध्यम से और झिल्ली पर सभी तरल आकर्षित करने के लिए किया जाना चाहिए।
    7. जब तक सभी नमूने झिल्ली पर देखा जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं वैक्यूम बंद कर दें।

2. रिएक्शन दीक्षा और शमन

  1. प्रतिक्रिया घटकों के मिश्रण
    1. initi से पहलेसमझना, 4x स्टॉक समाधान के रूप में सभी चार प्रतिक्रिया घटकों को तैयार: प्रतिक्रिया बफर, हिस्टिडीन काइनेज (1.5), [γ- 32 पी] -ATP (1.6) (खंड 1.4 देखें), और DDH 2
    2. प्रतिक्रिया बफर, हिस्टिडीन काइनेज के बराबर मात्रा मिक्स, और DDH 2 ओ इन प्रतिक्रिया घटकों एक कम समय (10 मिनट) के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करने की अनुमति दें।
      नोट: अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा कि क्या प्रयोग समय पर निर्भर, एंजाइम पर निर्भर है, या सब्सट्रेट पर निर्भर है पर निर्भर है। समय पर निर्भर प्रतिक्रियाओं, बड़ा होना चाहिए के रूप में कई aliquots वांछित समय बिंदु पर एक ही प्रतिक्रिया से लिया और बुझती रहे हैं। प्रतिक्रिया मात्रा वांछित समय बिंदुओं की संख्या पर निर्भर करेगा। परख nitrocellulose झिल्ली पर प्रत्येक स्थान प्रतिक्रिया के 30 μL को रोकने के लिए के लिए अनुकूलित है। इस प्रकार, यदि 10 समय अंक वांछित हैं, प्रतिक्रिया मात्रा कम से कम 300 μL होना चाहिए (एक उच्च मात्रा जैसे 330 μL किसी भी pipetting त्रुटियों की स्थिति में बेहतर होगा)।एंजाइम और सब्सट्रेट पर निर्भर प्रयोगों छोटे प्रतिक्रिया मात्रा में आवश्यकता होती है। इन प्रयोगों के लिए प्रतिक्रिया मात्रा 30 μL के रूप में के रूप में छोटा हो सकता है, के रूप में यह अंतिम मात्रा कि nitrocellulose झिल्ली पर देखा जाएगा।
    3. प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए, प्रतिक्रिया के लिए [32 पी γ-] -ATP समाधान में से एक मात्रा जोड़ने और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण। एक टाइमर के साथ ट्रैक गुजरे प्रतिक्रिया समय और प्रतिक्रिया वांछित समय के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. प्रतिक्रिया बुझाना, प्रतिक्रिया के लिए बहुत ठंडा 325 मिमी एच 3 की कुल प्रतिक्रिया मात्रा पीओ 4 की 1/13 जोड़ सकते हैं और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, 325 मिमी एच 3 की प्रतिक्रिया पीओ 4 के एक विभाज्य जोड़ें।
      नोट: एच 3 पीओ 4 के अंतिम एकाग्रता 25 मिमी पर्याप्त प्रतिक्रिया बुझाने के लिए होना चाहिए। उदाहरण के लिए, 30 μL प्रतिक्रिया के लिए 2.5 μL 325 मिमी एच 3 4 पीओ जोड़ने के लिए, या 30 μL प्रतिक्रिया 2.5 μL 325 मिमी एच 3 पीओ जोड़ने <उप> 4। प्रतिक्रिया के अंतिम पीएच लगभग 4.0 है। एच 3 पीओ 4 के इस एकाग्रता का परीक्षण किया और phosphohistidine अपमानजनक बिना इस बफर में काइनेज प्रतिक्रिया बुझाने के लिए पुष्टि की गई है।
      1. उदाहरण के लिए, 7.5 μL 4x प्रतिक्रिया बफर, 7.5 μL 4x हिस्टिडीन काइनेज, और 7.5 μL DDH 2 ओ मिश्रण 7.5 μL [γ- 32 पी] -ATP साथ प्रतिक्रिया आरंभ। साथ 2.5 μL 325 मिमी एच 3 4 पीओ प्रतिक्रिया बुझाने।
    5. बर्फ पर तुरंत बुझती प्रतिक्रियाओं जगह जब तक सभी प्रतिक्रियाओं समाप्त कर दिया गया है।
      नोट: क्षमता को अधिकतम करने के लिए, यह एक प्रतिक्रिया सभी प्रतिक्रियाओं तक हर 15 या 20 S शुरू कर रहे हैं आरंभ करने के लिए सलाह दी जाती है, और एक बार वांछित प्रतिक्रिया समय बीत चुका है, एक प्रतिक्रिया बुझाने हर 15 या 20 S जब तक सभी बुझती हैं। जो लोग पहली बार के लिए परख उपयोग कर रहे हैं, एक लंबे अंतराल अधिक प्रबंधनीय हो सकता है।

3. खोलना ओNitrocellulose पर च बुझती प्रतिक्रियाओं

  1. 96 अच्छी तरह से धब्बा तंत्र डॉट पर वैक्यूम शुरू
    1. पूर्व इकट्ठे 96 अच्छी तरह से डॉट धब्बा तंत्र (धारा 1.7) एक माध्यमिक कंटेनर में रखें। इस कंटेनर काफी बड़े के लिए उपकरण आसानी से disassembled किया जा करने के लिए, के रूप में उपकरण और झिल्ली के उपयोग के बाद रेडियोधर्मी होगी होना चाहिए।
    2. 96 अच्छी तरह से धब्बा तंत्र डॉट को वैक्यूम लागू करें।
    3. एक बार जब तंत्र वैक्यूम के अंतर्गत है, ध्यान से बुझती प्रतिक्रिया सीधे प्रत्येक में nitrocellulose झिल्ली पर अच्छी तरह से pipet। दोहराएँ जब तक सभी प्रतिक्रियाओं झिल्ली पर लोड कर रहे हैं। Nitrocellulose के बंधन क्षमता के बाद से (75 - 110 माइक्रोग्राम / 2 सेमी) हिस्टिडीन काइनेज की राशि देखा जाता है कि, यह माना जा सकता है जब सही ढंग से भरी हुई है कि लगभग सभी काइनेज की झिल्ली को बांधता से अधिक है।
      नोट: इस्तेमाल तंत्र पर निर्भर करता है, देखभाल nitrocellulose पंचर करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। ध्यान से देखें कि प्रतिक्रिया के सभी वें के साथ संपर्क किया गया हैई nitrocellulose। यह आसान कुछ या प्रतिक्रिया के सभी अच्छी तरह से की दीवारों के लिए छड़ी करने के लिए, और nitrocellulose तक पहुँच नहीं है।
    4. ठंडा 25 मिमी एच 3 4 पीओ के 100 μL के साथ कुओं धो लें। यह किसी भी प्रतिक्रिया मात्रा कि अच्छी तरह से में फंस गया हो सकता है झिल्ली तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं, सभी प्रतिक्रियाओं का पूरा लोड हो रहा है यह सुनिश्चित करना होगा। पूरी मात्रा झिल्ली के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति।
  2. उपकरण disassembly और nitrocellulose झिल्ली हस्तांतरण
    1. ध्यान से वैक्यूम बंद बंद करने से पहले उपकरण जुदा। सलाह दी है कि दोनों उपकरण और nitrocellulose झिल्ली इस समय रेडियोधर्मी हैं। इस समय माध्यमिक कंटेनर से किसी भी उपकरण घटकों को दूर मत करो।
    2. संदंश के साथ, ध्यान से लगभग 200 एमएल 25 मिमी ठंडा एच 3 पीओ 4 के एक कंटेनर को तंत्र से nitrocellulose झिल्ली हस्तांतरण। इस कंटेनर पर एक ढक्कन की जगह, के रूप में धोने रादी होगीoactive। इस समय, वैक्यूम बंद किया जा सकता है।

4. Nitrocellulose प्रसंस्करण

  1. nitrocellulose धोने
    1. एक घुमाव पर झिल्ली धोने के साथ कंटेनर रखें। झिल्ली धीरे 20 मिनट के लिए रॉक करने के लिए अनुमति दें।
    2. 20 मिनट के बाद, ध्यान से छानना एक बड़ी बाल्टी में इस्तेमाल किया धोने समाधान अस्थायी कचरे के भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। ठंडा 25 मिमी एच 3 4 पीओ के 200 मिलीलीटर झिल्ली और दोहराने के लिए जोड़ें।
      नोट: कम से कम तीन से 20 मिनट washes दूर करने के लिए पृष्ठभूमि [γ- 32 पी] झिल्ली से -ATP संकेत जरूरी हैं। तीसरे धोने के बाद, एक गीजर काउंटर के साथ विकिरण के लिए इस्तेमाल किया धोने के समाधान का परीक्षण करें। ऊपर के रूप में जब तक कोई संकेत धोने के समाधान में मौजूद है वर्णित झिल्ली धोने के लिए आगे बढ़ें।
  2. nitrocellulose सुखाने
    1. बाद झिल्ली पर्याप्त धोया जाता है, संक्षेप में शुष्क हवा झिल्ली अनुमति देते हैं। यह आमतौर पर 5 मिनट या उससे कम समय लेता है।

5. भंडारण फॉस्फर स्क्रीन के संपर्क में

नोट: इस खंड वैकल्पिक है। एक भास्वर स्क्रीन करने के लिए झिल्ली को उजागर करने में है कि यह झिल्ली पर प्रत्येक स्थान में radiolabeled काइनेज की तीव्रता के दृश्य के लिए अनुमति देता है फायदेमंद है। इन स्थानों के रिश्तेदार तीव्रता सीधे प्रत्येक स्थान में फॉस्फोरिलेटेड हिस्टिडीन काइनेज की राशि के लिए आनुपातिक है। तीव्रता खंड 7. इसके अलावा से उत्पन्न उन लोगों के लिए इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, और इन परिणामों की तुलना की जा सकती है, इस कदम गुणवत्ता नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। इस स्कैन में देखा असामान्यताएं जगमगाहट गिनती से प्राप्त अनियमित परिणामों की व्याख्या हो सकती है।

  1. भास्वर स्क्रीन तैयारी
    1. भंडारण भास्वर स्क्रीन करने के लिए झिल्ली को प्रकाश में लाने से पहले, कम से कम 5 मिनट के लिए सफेद रोशनी करने के लिए भास्वर स्क्रीन बेनकाब। यह सुनिश्चित करता है कि किसी भी अवशिष्ट छवि है कि स्क्रीन के द्वारा आयोजित किया जा सकता मिट जाता है।
    2. सुनिश्चित करें कि स्क्रीन साफ ​​हैऔर सूखी। यदि आवश्यक हो, धीरे से एक भास्वर स्क्रीन सफाई समाधान स्क्रीन निर्माता द्वारा अनुमोदित के साथ स्क्रीन को साफ और सूखी पोंछे।
  2. Nitrocellulose झिल्ली तैयारी
    1. ध्यान से भास्वर स्क्रीन को नुकसान पहुंचाने से अवशिष्ट नमी को रोकने के लिए एक पतली प्लास्टिक की चादर में सूखे nitrocellulose झिल्ली लपेटो। सुनिश्चित करें कोई सिलवट या बुलबुले देखते हैं कि।
  3. भास्वर स्क्रीन के संपर्क में
    1. भंडारण भास्वर स्क्रीन कैसेट में लिपटे nitrocellulose झिल्ली प्लेस, झिल्ली पर स्क्रीन चेहरा नीचे जगह है, और कैसेट बंद करें। कैसेट को खोलने या झिल्ली कदम जब तक यह, भास्वर स्क्रीन स्कैन करने के लिए समय है के रूप में प्रदर्शन के दौरान झिल्ली स्थानांतरण का कारण होगा एक डबल या लिप्त छवि पर कब्जा करने के लिए नहीं है।
    2. जब तक भास्वर स्क्रीन निर्माता का सुझाव के रूप में कम से कम 4 घंटे के लिए पर्दाफाश, या।
    3. एक बार जोखिम पूर्ण है, फॉस्फर स्क्रीन स्कैन और एक भास्वर स्कैनर के साथ छवि पर कब्जा।

6. जगमगाहट गिनती के लिए nitrocellulose झिल्ली तैयारी

  1. रक्तवर्ण रंग एस धुंधला और destaining
    1. संक्षेप में रक्तवर्ण रंग एस धुंधला समाधान में nitrocellulose झिल्ली विसर्जित (0.1% रक्तवर्ण रंग एस (डब्ल्यू / वी) 5% एसिटिक एसिड में) के लिए 1 - 2 मिनट। दाग destaining करने से पहले साथ पूरे झिल्ली गीले।
    2. झिल्ली से अतिरिक्त रक्तवर्ण रंग एस छानना।
    3. जब तक केवल हिस्टिडीन काइनेज से स्पॉट दाग रहे हैं DDH 2 हे के साथ झिल्ली कुल्ला। ध्यान दें कि यह प्रक्रिया केवल अगर सभी स्थानों प्रोटीन का पता लगाने योग्य मात्रा में होते हैं काम करेंगे।
      नोट: यह कदम इस बात की पुष्टि करने के लिए कि काइनेज nitrocellulose के लिए बाध्य है आवश्यक है, और है कि प्रोटीन लोड हो रहा है यहां तक ​​कि सभी स्थानों भर में है। यह भी आसानी से झिल्ली से बाहर कटौती करने के लिए देखा काइनेज अनुमति देता है।
  2. स्पॉट बाहर काटना
    1. कैंची का प्रयोग, nitrocellulose झिल्ली पर प्रत्येक स्थान के बाहर काटा। यह Alon पूरी तरह से कट करने के लिए आवश्यक नहीं हैजी दाग ​​स्थान की बढ़त; यदि झिल्ली पर्याप्त धोया गया था, स्पॉट बाहर कटौती की अलग-अलग आकार के कारण पृष्ठभूमि नगण्य हो जाएगा। यह प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पूरी जगह को काटने के लिए ही महत्वपूर्ण है।
    2. संदंश का प्रयोग, ध्यान जगमगाहट शीशियों में प्रत्येक स्थान के लिए स्थानांतरण। के रूप में 32 पी आसानी से सेरेन्कोव विकिरण द्वारा detectable है कोई जगमगाहट कॉकटेल आवश्यक है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, जगह एक तेज काग बोरर का उपयोग कर बाहर काटा जा सकता है। काग छिद्रक साथ nitrocellulose से प्रत्येक स्थान निकालें, और एक पिन के साथ एक जगमगाहट शीशी में धक्का। इस विधि के साथ, झिल्ली को छुआ जा सकता है, आगे विकिरण जोखिम को कम करने की जरूरत नहीं है।
  3. निर्धारण सीपीएम / [γ- 32 पी] -ATP समाधान के pmol
    1. की स्पॉट कई dilutions [γ- 32 पी] -ATP समाधान (धारा 1.5) 1 सेमी nitrocellulose की एक्स 1 सेमी चौकों पर। संक्षेप में शुष्क हवा।
    2. संदंश का प्रयोग, ध्यान जगमगाहट में प्रत्येक वर्ग के लिए स्थानांतरणशीशियों। कोई जगमगाहट कॉकटेल आवश्यक है। इन नमूनों एटीपी समाधान के सीपीएम / pmol निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

7. जगमगाहट गिनती

  1. जगमगाहट काउंटर कैसेट में सभी जगमगाहट शीशियों लोड। जगमगाहट काउंटर में लोड कैसेट।
  2. जगमगाहट गिनती कार्यक्रम पर अमल प्रत्येक शीशी के लिए सीपीएम को मापने के लिए। इन आंकड़ों, radiolabeled एटीपी मिश्रण (खंड 6.3) के सीपीएम / pmol के साथ-साथ, फॉस्फोरिलेटेड हिस्टिडीन काइनेज की राशि प्रत्येक स्थान में मौजूद है, और इस तरह autophosphorylation की दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 18,19

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Representative Results

एक प्रतिनिधि डेटा सेट एक छवि एक भास्वर इमेजर (चित्रा 1), रक्तवर्ण रंग एस nitrocellulose झिल्ली के दाग (चित्रा 2), और जगमगाहट गिनती डेटा (चित्रा 3) के साथ कब्जा कर लिया विशेषता उत्पन्न किया गया था। चित्रा 3A एक Lineweaver-Burk साजिश में एंजाइम गतिज स्थिरांक पता चलता है। इन परिणामों के ग्राम नकारात्मक प्रजातियों विब्रियो parahaemolyticus (जीन आईडी 1189383) से एक शुद्ध हिस्टिडीन काइनेज का उपयोग कर प्राप्त किया गया। इस काइनेज शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल धारा 1.1 में वर्णित है। प्रतिक्रिया में अंतिम काइनेज एकाग्रता 7.5 सुक्ष्ममापी था। अंतिम एटीपी सांद्रता 0 सुक्ष्ममापी से 1.28 मिमी तक बताया गया। [Γ- 32 पी] -ATP समाधान 171.97 सीपीएम / pmol एटीपी था। इन आंकड़ों से सभी प्रक्रिया हम वर्णन किया है का उपयोग कर एक ही दिन में उत्पन्न किया जा सकता है।

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चित्रा 1: एक nitrocellulose झिल्ली के रक्तवर्ण रंग एस धुंधला हो जाना। काइनेज nitrocellulose झिल्ली के लिए बाध्य दिखा रक्तवर्ण रंग दाग। झिल्ली एटीपी के विभिन्न सांद्रता, लेकिन लगातार काइनेज एकाग्रता युक्त प्रतिक्रियाओं के साथ देखा गया था। कोई प्रोटीन नहीं, काइनेज नियंत्रण स्पॉट (4 वें और 8 वें पंक्ति) में पाया जाता है। रक्तवर्ण रंग एस धुंधला समाधान 0.1% रक्तवर्ण रंग एस की रचना की थी (डब्ल्यू / वी) 5% एसिटिक एसिड में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: fluorography का परिणाम है। कि एक nitrocellulose झिल्ली को उजागर किया गया था एक भास्वर स्क्रीन के स्कैन की गई छवि। झिल्ली चोर युक्त प्रतिक्रियाओं के साथ देखा गया थाstant काइनेज एकाग्रता, और एटीपी के विभिन्न सांद्रता। प्रत्येक एकाग्रता तीन प्रतियों में यत्न किया गया था। प्रत्येक एकाग्रता में, एक नहीं काइनेज नियंत्रण शामिल किया गया था (4 वीं और 8 वीं पंक्ति) को दिखाना है कि radiolabeled एटीपी पूरी तरह से कदम धोने के दौरान झिल्ली से निकाल दिया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: जगमगाहट गिनती डेटा। ए) हिस्टिडीन काइनेज का autophosphorylation की डबल पारस्परिक साजिश है। सब्सट्रेट-निर्भरता की अवस्था जगमगाहट गिनती से उत्पन्न किया गया था। Phosphohistidine गठन चित्रा 3 बी (सीपीएम / pmol एटीपी) है, जो भी सुप्रीम कोर्ट के साथ उत्पन्न किया गया था के ढलान का उपयोग कर गणना की गईintillation स्पेक्ट्रोमेट्री। बी) एटीपी के सीपीएम / pmol के मानक वक्र। ढलान phosphohistidine (pmol) की राशि प्रत्येक नमूने में मौजूद गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

nitrocellulose बाध्यकारी परख हम वर्णन किया है पहले से इस्तेमाल किया तरीकों पर कई फायदे हिस्टिडीन kinases को चिह्नित करने के लिए है। पारंपरिक एसडीएस / पृष्ठ आधारित autoradiography की तुलना में, हमारे विधि उच्च throughput और कम समय लेने वाली है। nitrocellulose झिल्ली एसडीएस जैल से संभालना आसान है, और तय होने की जरूरत नहीं है। रक्तवर्ण रंग nitrocellulose धुंधला करने के लिए प्रोटीन स्पॉट देखे जा करने के लिए अनुमति देता है। यह एक आसान तरीका जगमगाहट गिनती के लिए प्रत्येक स्थान के बाहर कटौती, और तय है कि प्रोटीन लोडिंग सभी स्थानों भर में लगातार है प्रदान करता है। प्रत्येक स्थान की जगमगाहट गिनती सटीक परिणाम है कि आसानी से मानक वक्र चित्रा 3 बी में दिखाया गया है की ढलान का उपयोग कर प्रतिक्रिया वेग में बदला जा सकता है।

हालांकि एक भंडारण भास्वर स्क्रीन करने के लिए nitrocellulose झिल्ली को प्रकाश में लाने प्रयोग की कुल अवधि के लिए समय कहते हैं, इस कदम सोख्ता की सफलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। कोईविसंगतियों कि जगमगाहट गिनती डेटा में देखा जाता है संभावित पूरक भास्वर छवि से समझाया जा सकता है। अगर, उदाहरण के लिए, झिल्ली पर्याप्त धोया नहीं किया गया था, भास्वर छवि इस जानकारी का खुलासा करेंगे। झिल्ली के fluorography जो किसी को भी इस परख का उपयोग करने के लिए, के रूप में इस कदम से परिणाम पूरक जानकारी का एक मूल्यवान टुकड़ा हो सकता है की योजना बना रही करने के लिए सिफारिश की है।

इस परख का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ जगमगाहट गिनती से डेटा उत्पन्न करने की क्षमता है। जगमगाहट गिनती के लिए प्रत्येक व्यक्ति के स्थान को काटना इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के बैंड तीव्रता यों तो, के रूप में आम तौर पर पृष्ठ आधारित assays के लिए किया जाता है बेहतर है। ऊपरी सीमा है और पता लगाने के लिए गतिशील रेंज जगमगाहट गिनती के साथ अब तक ज्यादा हैं। एक मानक वक्र उत्पन्न निर्धारित करने के लिए सीपीएम / pmol एटीपी यह आसान कच्चे डेटा से autophosphorylation की दर की गणना करने के लिए बनाते हैं। इस विधि का उपयोग करना, हम सही ढंग से पता लगाने में सक्षम हैंफॉस्फोरिलेटेड उत्पाद की picomoles।

हमारे विधि का उपयोग करने के कई फायदे के बावजूद, यह अपनी सीमाओं के बिना नहीं है। हमारे विधि 1-phosphohistidine और 3-phosphohistidine के बीच भेद नहीं करता। phosphohistidine एंटीबॉडी इन फॉस्फोरिलेटेड उत्पादों के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हमारे विधि अभी भी सेरेन्कोव विकिरण का उपयोग फोस्फोराइलेशन यों तो का लाभ दिया है। सेरेन्कोव विकिरण एक बड़ी गतिशील रेंज और पता लगाने के उच्च ऊपरी सीमा प्रदान करता है। पता लगाने की विधि पर निर्भर करता है, एंटीबॉडी का उपयोग phosphohistidine गठन यों तो एक हद ऊपरी सीमा और गतिशील रेंज से पीड़ित हो सकता है। हमारे विधि भी शुद्ध प्रोटीन के साथ इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए सीमित है, और इन विवो में फॉस्फोरिलेटेड kinases पता लगाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। हमारे विधि radiolabeled सब्सट्रेट, जो प्रयोगशालाओं कि रेडियोधर्मिता के लिए सुसज्जित नहीं कर रहे रोकते हो सकता आवश्यकता है। अंत में, इस विधि ज्यादातर प्रयोगशालाओं कि पहले से ही संभाल सुसज्जित हैं के लिए उपयुक्त हैरेडियोधर्मिता, और एक उच्च throughput में रुचि रखते हैं और कम समय लगता है विकल्प अक्सर हिस्टिडीन kinases अध्ययन करने के लिए एसडीएस पृष्ठ तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए। जो सर्विसेज / Thr / Tyr kinases अध्ययन कर रहे हैं वे भी इन प्रोटीनों के अध्ययन के लिए वैकल्पिक तरीकों के रिश्तेदार बहुतायत के बावजूद, इस विधि उपयोगी होने के लिए मिल सकता है।

हिस्टिडीन kinases की विशेषता लंबे मायावी किया गया है के बावजूद तरीकों में प्रगति kinases के अन्य प्रकार यों की। इस परख के साथ, हम इन जैविक रूप से प्रासंगिक अभी तक खराब समझ प्रोटीन को चिह्नित करने के लिए शुरू कर सकते हैं। हिस्टिडीन काइनेज autophosphorylation बढ़ाता अंततः दो घटक बैक्टीरिया में संकेत के बारे में हमारी समझ में सुधार होगा के लिए कार्यप्रणाली में यह उन्नति। इस परख के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि हम विभिन्न दो घटक संकेत दे रास्ते में आत्मीय उत्तेजनाओं और हिस्टिडीन काइनेज गतिविधि पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के प्रभाव का पता लगाने के रूप में हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

यह काम राष्ट्रीय जरूरत कार्यक्रम (P200A100044) के क्षेत्रों में स्नातक की सहायता के माध्यम से शिक्षा विभाग द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

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References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

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