Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bragg, E. M., Briggs, F. Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations. J. Vis. Exp. (120), e55133, doi:10.3791/55133 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van neuronen in combinatie met het gebruik van onafhankelijke en onpartijdige clustering analyses om een ​​uitgebreid onderzoek van de morfologische kenmerken waargenomen bij een selectieve neuronale populatie te creëren. Combinatie van deze technieken is een nieuwe benadering voor het verzamelen en analyseren van neuroanatomische data. Samen vormen deze technieken in grootschalige en dus uitgebreidere steekproef van selectieve neuronale populaties en vastgesteld onpartijdige kwantitatieve methoden ter indeling morfologisch unieke neuronale klassen binnen een populatie.

Het protocol beschrijft het gebruik van gemodificeerde rabiësvirus selectief labelen neuronen. G-verwijderde rabies virus gedraagt ​​zich als een retrograde tracer na stereotaxische injectie in een doel hersenstructuur van belang en dient als een voertuig voor de levering en expressie van EGFP in neuronen. Grote aantallen neuronen geïnfecteerd met dezetechniek en express GFP gedurende hun dendrieten, het produceren van "Golgi-achtige" compleet fills van individuele neuronen. Dienovereenkomstig, de virus-gemedieerde retrograde tracing methode verbetert traditionele dye-basis retrograde tracing technieken door het produceren van volledige intracellulaire fills.

Individuele goed geïsoleerde neuronen verspreid over alle regio's van de hersenen gebied onder onderzoek zijn geselecteerd voor de wederopbouw met het oog op een representatieve steekproef van neuronen te verkrijgen. Het protocol beschrijft procedures om cellichamen te reconstrueren en te voltooien dendritische arborization patronen van gelabelde neuronen verspreid over meerdere weefselcoupes. Morfologische gegevens, inclusief posities van elk neuron in de hersenen structuur, worden verwijderd voor verdere analyse. Standaard programmering functies werden gebruikt om onafhankelijke cluster analyses en evaluaties cluster op basis van morfologische metrics te voeren. Het nut van deze analyses, statistische beoordeling van clusteranalyse perfo verifiërenrmed op 160 neuronen gereconstrueerd in de thalamische reticulaire nucleus van de thalamus (TRN) van de makaak werd gemaakt. Zowel de originele clusteranalyse en statistische evaluaties uitgevoerd hier aan dat TRN neuronen in drie subpopulaties, elk met unieke morfologische kenmerken.

Introduction

Neuroanatomie is een van de fundamenten van de neurowetenschappen 1 en recente interesse in "connectomics" heeft enthousiasme verlengd voor het begrijpen van de morfologische diversiteit van neuronale populaties en de verbindingen tussen specifieke neuronen 2. Methoden voor de etikettering en de reconstructie van neuronen zijn sterk verbeterd met recente innovaties, met inbegrip van genetische en virus-gemedieerde circuit tracing komt 3, 4, waardoor meer uitgebreide morfologische onderzoeken van neuronale populaties 5. Naast verbeteringen in de etikettering van individuele neuronen, hebben kwantitatieve data-analysetechnieken ook naar voren gekomen dat in staat stellen onafhankelijke en onpartijdige indeling van neuronen in afzonderlijke subpopulaties op basis van morfologische gegevens 5, 6. Deze onpartijdige technieken zijn een verbetering ten opzichte van meer traditional kwalitatieve indeling methoden die de standaard in het veld voor meer dan een eeuw zijn geweest. Het doel van deze studie is om te schetsen, stap-voor-stap, de combinatie van virus-gemedieerde etikettering van neuronen binnen een selectief bevolking, grootschalige reconstructies van een uitgebreide steekproef van deze neuronen, en kwantitatieve data-analyse op basis van onafhankelijke clustering met statistische evaluatie. Door het combineren van deze methoden, schetsen we een nieuwe aanpak in de richting van het verzamelen en analyseren van gegevens neuroanatomische uitgebreide bemonstering en onpartijdige classificatie van morfologisch unieke neuronale types binnen een selectieve neuronale bevolking te vergemakkelijken.

Als voorbeeld van deze werkwijzen beschrijven we onze analyse van een grote populatie van neuronen binnen één sector van de thalamische reticulaire nucleus (TRN) van de makaak. Deze gegevens zijn afkomstig uit een eerdere studie 7. Werkwijzen voor het selectief labelen TRN neuronen projecteren naar de dorsale lateral geniculate nucleus van de thalamus (dLGN) met behulp van chirurgische injectie van gemodificeerde rabiësvirus coderend EGFP 4, 8 (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 2) worden beschreven. Deze gemodificeerde rabies virus mist het gen dat codeert voor een essentieel manteleiwit, waardoor trans-synaptische beweging van het virus. Zodra het virus komt axon terminals op de injectieplaats, fungeert als een traditionele retrograde tracer met het belangrijkste voordeel van het rijden EGFP expressie gedurende de volledige dendritische arborization van geïnfecteerde neuronen 5, 9, 10. Bijgevolg kan deze-G verwijderd rabiësvirus worden gebruikt om selectief te infecteren en label elke neuronale bevolking na de injectie en retrograde transport.

Om een ​​uitgebreide analyse van specifieke neuronale populatie te voeren, is het belangrijk om te proeven vaneen brede spreiding van neuronen in de bevolking. Omdat het virus-gemedieerde labeling techniek produceert volledig intracellulair, "Golgi-achtige" vullingen van vele neuronen met axonen op de injectieplaats virus, is het mogelijk om een ​​zeer grote groep neuronen reconstrueren binnen de volledige omvang van een hersenstructuur. Bovendien, omdat de gemodificeerde rabiësvirus zo effectief bij infecteren en etikettering grote aantallen neuronen, is het mogelijk om honderden neuronen per dier te reconstrueren. Procedures voor het bemonsteren van 160 neuronen in de hele visuele sector van de TRN 11 met het oog op een uitgebreide steekproef van dLGN-projecteren TRN neuronen te genereren worden geschetst. Het proces van reconstructie van individuele neuronen met een neuron reconstructie omvattende een microscoop, camera en reconstructie software wordt beschreven. Eveneens beschreven worden werkwijzen posities van individuele neuronen in hersenen structuur (in dit geval binnen de TRN) bepalen en Virusinjectie sit verifiërene volume en locatie binnen een structuur (in dit geval binnen de dLGN) via volumemeting contour reconstructies. Stappen voor morfologische gegevens te exporteren en het uitvoeren van onafhankelijke cluster analyses op basis van morfologische metrieken gemeten voor elke neuron worden geschetst. Er zijn beperkingen aan clustering methoden en er zijn ook een verscheidenheid van verschillende clustering algoritmen beschikbaar. Dienovereenkomstig deze opties en de voordelen van enkele van de meest gebruikte algoritmen worden beschreven. Het cluster analyse geeft geen statistische controle van de uniciteit van clusters. Daarom zijn extra stappen optimale clustering en de relaties tussen morfologische data binnen en tussen clusters verifiëren. Statistische methoden voor het evalueren van clusters voor de TRN dataset om te bevestigen dat TRN neuronen zijn gegroepeerd in drie unieke clusters gebaseerd op 10 onafhankelijke morfologische metrics worden beschreven.

Door dus waarin stappen voor het selectief etiketteren, Reconstrueren en analyseren van morfologische gegevens van een specifieke neuronale populatie beschrijven we werkwijzen voor het kwantificeren morfologische verschillen tussen neuronen binnen een populatie. Voorafgaande bevindingen van verschillende neuronale types binnen de beeldende sector van de makaak TRN worden bevestigd met een aparte statistische evaluatiemethoden. Samen hopen we deze technieken zullen breed toepasbaar neuroanatomische datasets zijn en helpen bij het vaststellen kwantitatief onderzoek naar de diversiteit van de neuronale populaties door de hersenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het weefsel onderzocht in deze studie werd bereid als een onderdeel van een afzonderlijk onderzoek 5. Derhalve alle experimentele methoden waarbij het gebruik van dieren in detail is beschreven in de sectie experimentele werkwijzen van Briggs et al. (2016). Alle procedures waarbij dieren uitgevoerd als onderdeel van de voorafgaande studie werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies. De stappen voor injectie van het virus in de dLGN en histologische verwerking van hersenweefsel worden hieronder kort beschreven in hoofdstukken 1-2.

1. Stereotaxische Injection

  1. Voer alle chirurgische ingrepen in een steriele omgeving met behulp van aseptische technieken. Steam-steriliseren alle metalen chirurgische instrumenten, gaas en laken materiaal in een autoclaaf. Steriliseren alle materialen die kunnen worden beschadigd door stoom door chemische sterilisatie (bijvoorbeeld ethyleenoxide).
  2. Induceren en anesthesie te behouden volgens dier- en pROTOCOL-specifieke eisen.
    1. Voor virus injectie in apen, te induceren anesthesie met ketamine (10 mg / kg) en dieren onder volledige chirurgische anesthesie met isofluraan houden (1-3% ingeademde zuurstof) toezicht verlopen CO 2, ECG, ademhaling, en de temperatuur voortdurend en periodiek controleren voor kaak toon om de juiste verdoving diepte te garanderen.
  3. Plaats dier in een stereotaxische kader om het hoofd te stabiliseren en om het gebruik van stereotactische coördinaten aan de injectie structuur van belang (bijvoorbeeld dLGN) te lokaliseren. Als het meten van visuele reacties, druppels plaats oog (1% atropine oogdruppels als pupil dilatatie gewenst is, anders zakt zoutoplossing oog) en contactlenzen in beide ogen tot droog te voorkomen. Als dat niet het meten van visuele reacties plaatsen oogzalf in de ogen.
  4. Maak een middellijn hoofdhuid incisie en trekken de huid en spieren.
  5. Volgens stereotaxische coördinaten voor de structuur van belang (dLGN) in één hemisphere, een kleine craniotomie.
  6. Geleidelijk te verlagen een registratie-elektrode (bijvoorbeeld wolfraam of platinum / iridium elektrode (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 3) vastgeklemd zit op een micromanipulator die handmatig wordt geplaatst) door de craniotomie in de hersenen. Lagere impedantie (<1 MQ) en iets dikkere (~ 250 urn diameter) elektroden kunnen worden gebruikt om de dura dringen, indien gewenst.
  7. Noteer de manipulator stand aan het corticale oppervlak op het punt waar visuele responstijden gemeten. Visual reacties zijn hoorbaar, in de tijd opgesloten neuronale reacties op licht flitste in de ogen met een oftalmoscoop of kleine LED / zaklamp.
  8. Bepaal de locatie en de dikte van de dLGN de ​​opmerking manipulator posities aan het begin, midden en einde van visuele reacties en aftrekken van de corticale oppervlaktepositie van deze waarden. Noteer de diepten van elk ontworpen injectieplaats binnen de dLGN.
    LET OP: Vergelijkbare procedures kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van niet-visuele structuren waarbij geschikte sensorische stimuli. Bovendien kan gekoppeld opname / injectiesystemen ook worden gebruikt om gericht op kleine hersenstructuren.
  9. Zodra optimale injectieplaatsen worden genoteerd, verwijdert de registratie-elektrode en plaats een injectie pipet (glazen pipet of injectiespuit) tegelijkertijd stereotaxische positie en lager op de juiste hoogte voor elke injectie, beginnend met de diepste injectieplaats en bestemd voor de ondiepe, wacht ten minste 1 min na het injecteren van voordat u de elektrode positie. Glazen pipetten met een buitendiameter van ~ 50 urn kan terugstromen van het virus te verminderen in vergelijking met de spuit tips (~ 200 micrometer diameter).
  10. Met behulp van een inspuitsysteem (zie Tabel van specifieke materialen / appara, rij 4), picospritzer of injectiepomp, injecteer kleine volumes (1-5 pl; verwijzen naar instructies van de fabrikant voor injectie procedures) van gemodificeerde rabiësvirus over meerdere (3 - 10) dieptesmet een snelheid van ~ 100 nL / min binnen de beoogde structuur (dLGN). Opmerking: Aparte injectie doorvoeringen kunnen worden gemaakt in grotere doelgroep structuren (bijv aap dLGN). Pas de totale injectievolume volgens doel structuur grootte.
  11. Pauze ten minste 5 minuten voor het terugtrekken van de injectiepipet. Wanneer de injectie pipet wordt verwijderd, vul de craniotomie met beschermend materiaal (lijm bot stuk in plaats van toepassing bot was of Gelfoam), dan hechtdraad de spier en de huid weer bij elkaar.
  12. Dien analgetica (bijv ketoprofen) en antibiotica vóór het einde van de operatie en monitor dierlijke continu tot dier ambulant.
  13. Gedurende ten minste 3 dagen en tot 10 dagen na de operatie, monitoren dier dagelijks waarborgen hechtingen schoon, droog en intact dier vertoont geen tekenen van pijn of ongemak. Toedienen dagelijks pijnstillers en antibiotica vereist. Begin sociale woningbouw van de post-operatieve dier na dier volledig is hersteld van een operatie.
  14. </ Ol>

    2. Tissue Oogsten, Sectioning en kleuring

    1. Sta 7-14 dagen omgekeerd transport van reageert, komt euthanaseren het dier door overdosis euthanasie oplossing (bijv Euthasol) en perfuseren het dier transcardially met 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing, 4% paraformaldehyde, daarna 4% paraformaldehyde met 10% sucrose.
    2. Verwijder de hersenen (zie 12 voor analoge stappen in een knaagdier model) en plaats in de 20-30% sucrose met 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer en in de koelkast voor 1-2 dagen.
    3. Wanneer de hersenen naar de bodem van de container is gezonken, verwijderen en snij het weefsel in blokken die het hersengebied met retrograde gemerkte neuronen (bijvoorbeeld visuele cortex) en de injectie beoogde structuur (bijv dLGN). Snijd dezelfde blokken weefsel van de niet-geïnjecteerde halfrond - dit zal dienen als controlesecties. Voor het beste resultaat, beginnen histologische procedures immediately op vers doorgesneden weefsel.
    4. Sectie weefsel coronaalwaarts bij een dikte van 50 micrometer per sectie met behulp van een bevriezing microtoom (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 5).
    5. Vlekken op alle afdelingen voor cytochroom oxidase activiteit (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rijen 5-8) om corticale lagen en subcorticale structuren 13 te visualiseren. Opmerking: Secties kunnen overnacht worden bewaard in de koelkast in de laatste spoeling na het cytochroom oxidase vlek.
    6. Label alle secties met een primair antilichaam tegen GFP (1: 1000 verdunning, ~ 12 uur incubatie zie Tabel van specifieke materialen / middelen, rij 9), gevolgd door een secundair antilichaam overeenkomt met de primaire gastheer en gelabeld met biotine 5 (1: 500 verdunning , 2-4 uur incubatie, zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 10). Het wordt aanbevolen om secties broeden in het secundaire antilichaam 's nachts.
    7. Label secties met een avidine / biotine-complex vervolgens reageren met DAB en peroxide om permanent vlekken op alle gelabelde neuronen 5.
    8. Monteer secties op glasplaatjes subbed en laten drogen 's nachts.
    9. Defat secties met behulp van een reeks van alcohol en xyleen spoelt vervolgens dekking slip 14.

    3. Neuronale Wederopbouw

    LET OP: Alle reconstructies voor originele experimenten werden gemaakt met behulp van een neuron reconstructie systeem bestaat uit een microscoop (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 14), aangesloten camera (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 13), en de wederopbouw software pakket (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rijen 11-12). -Software bijgestaan ​​neuronale reconstructie maakt visualisatie van weefsel dia's bedekt met computer-gebaseerde tekeningen van neuronale processen. Belangrijk is dat de software digitaliseert morfologische reconstructiegegevens in drie dimensies, waardoor extractie van positie-specifieke morfologische informatie. De bijbehorende data-extractie programma (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 12) maakt de extractie van een rijke set van morfologische gegevens van elk opgeslagen wederopbouw.

    1. Plaats glijbaan in de microscoop diahouder en focussen op enkele sectie belangstelling via een low vergrotende objectief (bijvoorbeeld 2X of 10x). Zorg ervoor dat het camerabeeld zichtbaar is in de software het oog door de juiste positionering van de sluiter van de camera.
    2. Kies gemerkte neuronen in de hersenen structuur van belang (bijvoorbeeld TRN) die redelijk zijn geïsoleerd teneinde ondubbelzinnig deel van de dendritische arborization mogelijk te reconstrueren. Bij voorkeur kiest neuronen als het cellichaam volledig binnen een enkele sectie om de grootste omvang van elk cellichaam vangen en nauwkeurig schatten de stippellijn rondheid. Gebruik 10X microscoop objectief naar cel b identificerenody in huis sectie.
    3. Zodra een goed gekleurd, goed geïsoleerde neuron is geïdentificeerd, voeg de sectie "thuis" met daarin de cel lichaam aan de afdeling Manager door te klikken op de "Nieuwe sectie" knop. Voer het aantal secties op te nemen (aanbevolen 2-3 secties om te beginnen). een sectie dikte van 50 pm toe te wijzen als daarom wordt gevraagd (zie stap 2.3).
    4. Teken de contouren van relevante hersenstructuren in de sectie huis met daarin de cel lichaam. Gebruik de 2X objectief / vergroting voor contour tracing.
      1. Selecteer eerst "Contour" uit het drop-down menu op de bovenste werkbalk en kies vervolgens de contour type uit de drop-down menu (bijvoorbeeld "LGN" of "TRN").
      2. Trace contouren van de beoogde structuur (bijv TRN) en aangrenzende structuren desgewenst door op punten langs de omtrek met muizen als een draw tool.
      3. Selecteer "Sluiten Contour" door met de rechtermuisknop te klikken en deze optie te selecterenuit het menu in te vullen en te omsluiten elk getraceerd contour.
    5. Plaats een markering in het midden van het doel structuur door te klikken op de gewenste markering symbool in de rechter werkbalk en vervolgens te klikken op de gewenste locatie in de reconstructie van de markering op die locatie. Gebruik hetzelfde type markering naar het midden van de beoogde structuur in alle reconstructies markeren.
    6. Zodra de contouren voltooid, teken de omtrek van de cellichaam 40 via - 60X doelstellingen / vergroting. Om dit te doen, selecteert u eerst "Neuron" uit het drop-down menu op de bovenste werkbalk en selecteer vervolgens de neuron structuur op te sporen, in dit geval "Cell Body". Volgende traceren van de cel lichaam als in 3.4.
    7. Plaats een andere stijl marker in het midden van het cellichaam, de stappen beschreven in 3.5.
    8. Traceren dendrieten vanaf het cellichaam.
      1. Selecteer eerst "Dendrite" uit het drop-down menu. trace dan elke dendrieten beginnen bij de cel body en het gebruik van de muis als een gelijkspel tool. Zorg ervoor dat u de z-diepte aan te passen in de gehele tracing nauwkeurig vastleggen van de hoek en richting van de dendriet.
      2. Plaats een knooppunt op elke tak punt langs de dendrite door met de rechtermuisknop te klikken en te kiezen voor "bifurcating Node" of "Trifurcating Node" uit het drop-down menu. Gebruik 40 - 60X objectief / vergroting voor alle dendrite reconstructies.
      3. Aan het einde van elke dendrite met de rechtermuisknop op de muis en selecteer "Ending" uit het drop-down menu.
    9. Identificeer dendritische eindes die waarschijnlijk zal blijven in de aangrenzende gedeelte en brengt deze in beeld op de juiste z-diepte-imago van de microscoop zijn. Omvatten de belangrijkste bezienswaardigheden in de omgeving, zoals bloedvaten of gemakkelijk herkenbaar dendrite patronen of bundels imago van de microscoop in.
      1. Verminder vergroting 20x of 10x op de microscoop (kies de vergroting dat de grootste mijlpaal visualisatie mogelijk maakt), en neemteen foto imago van de microscoop van het gebruik van een digitale camera (bv mobiele telefoon, tablet) de hand gehouden aan het computerscherm.
    10. Verplaatsing naar het aangrenzende gedeelte van de glijbaan en lijn de contour van de eerder gevolgde gedeelte met de grenzen van de dLGN en TRN in de nieuwe sectie.
    11. Terugkeren het gezichtsveld op het algemene gebied van het cellichaam (gebaseerd op de contouren en de belangrijkste monumenten) en breng de vergroting terug naar 10 - 20X.
    12. Gebruik de foto van de dendrite eindes van de eerder gevolgde gedeelte om te helpen bij de aanpassing van de uitgangen met het begin van de dendrieten in het nieuwe gedeelte.
      1. Om het opsporen draaien en verplaatsen naar dendrieten te lijnen, gebruik de pijl instrument om de wederopbouw te selecteren, klik met de rechtermuisknop en kies "Move" in het drop-down menu.
      2. U kunt ook gebruik maken van de "Match" tool om dendritische eindes aan te passen aan begin. Selecteer the Match gereedschap uit de bovenste werkbalk en wanneer daarom wordt gevraagd, klikt u op het eindebij de wederopbouw en de bijbehorende voortzetting punt in het beeld. Herhaal dit voor 3 of meer uitgangen.
    13. Zodra het traceren van de vorige paragraaf up is bekleed met de dendrieten in het nieuwe gedeelte, zorg ervoor dat de overeenkomstige nieuwe sectie in de sectie manager geselecteerd door te klikken op de huidige sectie. Of, een nieuwe sectie om de Sectiemanager, zoals hierboven in 3,3, aanpassing van de z-diepte en de positie van elk nieuw deel ten opzichte van het huis deel daarvan is en elke sectie dikte 50 mm (zie stap 2,3).
    14. Verhoog de vergroting tot 40 - 60X en spoor de dendrite voortzettingen door met de rechtermuisknop te klikken op de muis naar het einde van de dendriet van de wederopbouw en de "toevoegen aan Ending" te selecteren in het drop-down menu, dan is het opsporen van de dendrieten met behulp van de muis als een trekken tool. Volg de prompt aan te geven of de voortzetting is in het nieuwe gedeelte.
    15. Volg dendrieten door ten minste 3 aangrenzende secties (een aan elke zijde vanhet thuisvak) volgende stappen 3,8-3,15. Naar de reconstructie tot ten minste 3 totaal secties worden opgespoord de neuron of tot de dendrieten kan niet meer worden gevolgd of gevonden. Trace contouren in naburige afdelingen naar aanleiding van de bovenstaande stappen, indien gewenst.

    4. Onafhankelijke Clustering

    Opmerking: Onafhankelijke clusteranalyses mogelijk onpartijdige analyses van grote, multidimensionale datasets die anders moeilijk te visualiseren en belangrijk kan zijn, verschaffen een kwantitatieve evaluatie van morfologische diversiteit. Een matrix-gebaseerde programmering platform is zeer bruikbaar voor de analyse van multidimensionale datasets en maakt verfijnde datamanipulaties en statistische analyses. De in stap 4 genoemde functies - 6 zijn gedefinieerd in de in de tabel van specifieke materialen / Equipment vermeld programmering platform, rij 15.

    1. Uittreksel morfologische gegevens van elke individuele neuronale reconstrueren aan de hand van een extraction programma geassocieerd met het neuron reconstructie (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rijen 11-12).
      1. Kies eerst de morfologische gegevens gewenst voor elke reconstructie, waaronder: contour informatie, teller informatie, morfologische gegevens van cellichaam en dendritische arborization, etc.
      2. Uit het drop-down menu Bewerken in de werkbalk, selecteert u "Selecteer alle objecten". Selecteer vervolgens "vertakte structuur Analysis" van de Analysis drop-down menu in de werkbalk en klik op elk tabblad en selecteer de gewenste analyse-opties in elk tabblad.
      3. Extract alle gewenste gegevens door te klikken op de knop "OK" in het venster Analyse en opslaan in een spreadsheet door rechts te klikken op de output ramen en te kiezen voor "Export to Excel".
    2. Stel een Master spreadsheet (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur, rij 16) waarin elke morfologische variabele / metruc wordt vertegenwoordigd door een enkele numerieke observatie per neuron. In deze master spreadsheet, een register bijhouden van de rij-ID voor elke neuron.
    3. Controleert of alle variabelen in de clusteranalyse (bijv morfologische metrics) onafhankelijk van elkaar. Zo zal het aantal knooppunten correleren met het aantal vertakkingen in een dendritische of axonale arborization. Derhalve dient slechts een van deze twee variabelen worden opgenomen in een clusteranalyse.
    4. Zorg ervoor dat elke meting bevat een observatie voor elke variabele, dat wil zeggen elke neuron (meet), moet een data-punt (waarneming) die overeenkomt met elke morfologische metric (variabele) te hebben. Als observatie in een bepaalde variabele (bijvoorbeeld axon lengte) ontbreken van een subset van neuronen, kan deze variabele (axon lengte) niet onder de clusteranalyse.
    5. Het organiseren van de data op de master werkblad tot één matrix waarin elke rij geeft een neuron en each kolom bevat numerieke gegevens voor elke morfologische gegeven (figuur 1). Bijvoorbeeld, een dataset waarvan 100 neuronen waarvoor er observaties gedurende 5 onafhankelijke variabelen zou worden vertegenwoordigd door een 100 x 5 (rij-by-kolom) matrix. Het is niet nodig om identificatie voor elke neuron in de matrix omvatten - de rij index als unieke identifier elk neuron dienen. Er moet ook geen gaten of "NaN" s in de matrix. Sla de matrix als een enkele variabele (bijv data = [100 x 5 matrix], zie Aanvullende Code File voor het monster code).
    6. Kies een algoritme om de afstanden tussen de punten die individuele neuronen in een n-dimensionale ruimte, waarbij n wordt bepaald door het aantal variabelen te berekenen. De functie 'pdist' stelt flexibiliteit bij de berekening van tussen-neuron afstanden. De berekening standaard afstand is Euclidische afstand en is al eerder voor soortgelijke analyses van neuronale morphological data 5, 6.
    7. De tussen-afstanden neuron uitvoer van de functie "pdist ', de functie' koppeling om clusters. Nogmaals, verschillende clustering opties beschikbaar. Ward's methode en zwaartepunt afstand hebben soortgelijke resultaten opgeleverd in analyses van morfologische datasets 5, 6.
    8. Indien gewenst, de functie 'kmeans als alternatief clustering benadering' pdist "en" linkage "functies. 'Kmeans' wendt kwadraat Euclidische afstand tussen-neuron afstanden te berekenen en vervolgens zwaartepunt afstand tot clusters toewijzen.
    9. Een hiërarchische boom cluster visualiseren, de functie 'dendrogram' aan de uitgang van de "linkage" operatie. Deze functie heeft een standaardinstelling die visualisatie beperkt tot 30 metingen, maar het kan worden overschreven door opgave van het aantal metingen (<em> bijvoorbeeld neuronen) weergegeven. Het dendrogram toont de koppeling afstanden op de y-as voor elk van de neuronen, die door de rij index op de x-as.
      LET OP: De uitgangen van 'linkage' en 'dendrogram' niet het optimale aantal clusters te definiëren. De uitvoer van 'kmeans' bestaat metingen toewijzen clusters, maar niet testen of deze clusters zijn optimaal. Afzonderlijke statistische vergelijkingen en verificatie van optimale clustering kan worden uitgevoerd (zie hieronder).

    5. Verificatie van Clustering

    Opmerking: Zoals hierboven vermeld, heeft de clusteranalyse zelf niet direct geven een statistische beoordeling of de clusters geïllustreerd in de cluster dendrogram zijn uniek en representatief voor het monster. Methodes voor toetsing van clusters van het dendrogram zijn voorgesteld 15, maar deze bieden geen statistische keuring van optimale clustering. Er zijn multiple methodes voor toetsing van een optimale clustering.

    1. Methode 1: Evaluatie clustering:
      1. Gebruik de functie 'evalclusters' met vermelding van de gebruikte methode voor de berekening van clusters, zoals 'kmeans' of 'koppeling'. Een Gauss-mengsel model uitgang kan tevens te worden (zie Stap 5.2, zie Aanvullende Code File voor het monster code).
      2. Geef het beoordelingscriterium van een aantal opties (bijvoorbeeld 'CalinskiHarabasz' - voor een beschrijving van criterium opties, zie het Help-menu, op zoek naar "evalclusters").
      3. Geef een bereik van optimale clusteraantallen testen (bijv [1: 6] om te testen of 1, 2, 3, 4, 5 of 6 clusters optimaal).
        Opmerking: De output van 'evalclusters' is een optimale aantal clusters gegeven de clustering algoritme en criterium gespecificeerd.
    2. Methode 2: Gaussian mengsel model clustering:
      LET OP: Gaussian mengsel model clustering Algorithms (GGM) gaan ervan uit dat de opmerkingen voor elke variabele komen uit een mengsel van Gauss-distributies het bepalen van elke vermoedelijke cluster, elk met hun eigen gemiddelde en covariantie. De GMM gebruikt dan een verwachting maximalisatie algoritme om posterior waarschijnlijkheden toe te kennen aan elke meting, met vermelding van de waarschijnlijkheid van het behoren tot een bepaalde cluster 16.
      1. Implementeren van een GMM met behulp van de 'fitgmdist' functie door het invoeren van de vermeende aantal clusters waarneembaar in de gegevens. Als alternatief, om a priori toewijzing van het aantal clusters te voorkomen, gebruikt principale componenten analyse (PCA) met een reeks van verschillende optimale cluster nummers met behulp van de stappen die hier beschreven (zie Aanvullende Code File voor het monster code).
      2. Gebruik de functie 'PCA' op de originele data matrix en sla de belangrijkste component scores als een output.
      3. In een lus vanaf 1 en gaan door een aantal aantal vermeende optimale clusters, gebruiken th'Fitgmdist' functie e op het hoofdbestanddeel scores en het genereren van GGM's voor elk nummer van de vermeende optimale clusters.
      4. Evalueer elke GMM door onderzoek van de negatieve log waarschijnlijkheid Akaike informatie criterium, en Bayes informatie criterium. De GMM met de laagste criteria optimaal.
      5. Desgewenst testen of de gemiddelde waarden voor elke cluster aanzienlijk verschillen wanneer het aantal clusters optimaal (op- elk cluster worden opgeslagen in de "mu" uitgang van elke GMM).

    6. Statistische analyses van clustered data

    1. Zodra het optimale aantal clusters wordt bepaald met hiërarchische clustering en geëvalueerd om de oorspronkelijke gegevens, afzonderlijke neuronen in clusters en bepalen welke morfologische metrics bijdragen aan de bundeling van neuronen in unieke klassen.
    2. Sorteer de originele morfologische metrische data zodanig dat neuronen worden gegroepeerd op basis van cluster opdracht. Relaties tussen morfologische gegevens in neuronen (voor neuronen of neuronen gescheiden in clusters) te onderzoeken, uitvoeren lineaire regressie past bij 2- en 3-weg vergelijkingen morfologische waarnemingen gegeven. Deze aanvallen kunnen worden geschat met behulp van de functie 'fit' en geëvalueerd met behulp van de functie 'fitlm' waarin goedheid van fit uitgangen omvatten R2 en p-waarden voor regressie past.
    3. De statistische verhoudingen tussen neuronen in elke cluster onderzoeken gebruik van niet-parametrische twee steekproeven (Wilcoxon rank-sum test) of multipele bemonstering vergelijkingen testen (ANOVA), afhankelijk van het aantal clusters. Belangrijk is dat het gebruik van meerdere-monster ANOVA zodat p-waarden zijn gecorrigeerd voor meerdere vergelijkingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben eerder aangetoond dat grootschalige reconstructies van neuronen in een selectieve populatie haalbaar na injectie van gemodificeerde rabies virus in de dLGN 5. Onlangs werd hetzelfde weefsel gebruikt voor 160 neuronen reconstrueren de visuele sector van de TRN (Bragg e.a., revue,. Figuur 2A-B) volgens de gedetailleerde methodische stappen hierboven beschreven. In de TRN studie werden drie unieke clusters van TRN neuronen geïdentificeerd op basis van onafhankelijke clusteranalyse van 10 morfologische metrics: cellichaam gebied cellichaam ronding mediale-laterale positie ten opzichte van het midden van het TRN, dorsale-ventrale positie binnen de TRN , het aantal dendritische bomen, gemiddeld dendritische afstand tot knooppunten, de gemiddelde lengte van de 3e en hogere orde dendrieten, de gemiddelde hoek van 1e orde dendrieten, gemiddeld fase hoek van de totale dendritische arborization en hoekafwijking van deTal dendritische arborization. TRN neuronen gelijkwaardig verdeeld over de drie clusters (figuur 2C). Afzonderlijke statistische vergelijkingen van alle 10 morfologische statistieken over neuronen in de drie clusters leverde statistisch significante verschillen tussen de clusters voor iedereen, maar twee van de morfologische statistieken opgenomen in de oorspronkelijke cluster analyse. Dus op basis van de hiërarchische boom dendrogram gegenereerd uit de clusteranalyse (figuur 2C) en de afzonderlijke statistische vergelijkingen van morfologische statistieken voor clusters TRN neuronen worden ingedeeld in drie groepen uniek.

In deze studie hebben we specifiek wilden statistische methoden afzonderlijk clusters bepaald clusteranalyse evalueren toepassing. De TRN dataset van de voorafgaande studie geëvalueerd om te bepalen of de drie clusters waargenomen waren optimaal. Afzonderlijke extra cluster analyses, namelijk PCA en GMM clustering, werden de stand clusteringmethodes (figuur 1) te verifiëren. Drie belangrijke uitkomsten apart controleren voorafgaande cluster analyse. Ten eerste wanneer de oorspronkelijke clusteranalyse methode werd geëvalueerd volgens de 'evalclusters functiegroep waarin de functie wordt' koppeling om clusters te genereren, het optimale aantal clusters was 3, die overeenkomen met de oorspronkelijke conclusie op basis van de hiërarchische boom dendrogram (Figuur 2C). Ten tweede PCA werd uitgevoerd op de oorspronkelijke data matrix van 10 morfologische statistieken voor 160 TRN neuronen als een alternatief middel van het groeperen van neuronen gebaseerd op bijdragen van morfologische metrics. Drie GGM werden gegenereerd uitgaande TRN neuronen werden gegroepeerd in 1, 2 of 3 unieke clusters. De negatieve log waarschijnlijkheid (NLL) en Akaike informatie criterium (AIC) leverde de laagste, en daarom meest informatieve, waarden en beide waarden waren optimaal wanneer de GGM gebruikt 3 clusters TRN morfologische data te beschrijven (Figure 3). Ten derde werd de GMM-gebaseerde clustering afzonderlijk beoordeeld met de functie 'evalclusters en het optimale aantal clusters is 3. Aldus opmerkingen van de hiërarchische boom dendrogram, statistische vergelijkingen morfologische statistieken voor neuronen gescheiden in de drie clusters, PCA en GMM- based clustering en afzonderlijke evaluatie van elke clustering methode (linkage en GMM), al leverde hetzelfde resultaat dat TRN neuronen optimaal zijn onderverdeeld in 3 clusters gebaseerd op de 10 morfologische metrics gebruikt.

Figuur 1
Figuur 1: Data Format. Voorbeeldgegevens matrix n rijen corresponderen met het aantal neuronen en m = 5 kolommen overeenkomt met het totale aantal onafhankelijke variabelen in het cluster analyse omvatten (exclusief headers in Data matrix).


Figuur 2: Onafhankelijk Clustering van 160 TRN neuronen. A. Links, foto van enkele coronale doorsnede door de dLGN van één dier, gekleurd voor cytochroom oxidase activiteit dLGN lagen visualiseren en tegen GFP virus injectie te visualiseren. Pijl geeft gebieden van dichte retrograde gemerkte neuronen TRN. Sectie oriëntatie volgt de dorsale-ventrale / mediale-laterale (DV / ML) kompas hieronder en schaal balk vertegenwoordigt 500 pm voor alle panelen in A. Tweede van links, contour contouren van dLGN (rood) en TRN (kastanjebruine) voor alle secties bevatten virus injectie (zwart contouren). Gele sterren geven injectieplaats centra. Oriëntatie en schaal bars in A. Derde van links, 3-d weergaven van contouren en de injectieplaats, oriëntatie en schaal bars in A. Rechts, plattegronden van locaties van gereconstrueerd TRN neuronen, kleurcode volgens cluster opdracht (C) binnen een enkel aggregaat TRN contour (kastanjebruine). Oriëntatie en schaal bars in A. B. Links, totaal contouren van TRN (zwart) en dLGN (grijs) met 5 gereconstrueerde TRN neuronen gekleurd warm afkoelen naar hun mediale-laterale positie binnen de TRN. Oriëntatie op basis van de DV / ML kompas in A, schaal bar vertegenwoordigt 500 urn. Recht, foto's van dezelfde 5 TRN neuronen met bijpassende kleur schaal bars vertegenwoordigt 100 urn. C. Hiërarchische dendrogram volgende cluster analyse illustreren koppeling afstanden tussen 160 gereconstrueerde TRN neuronen gebaseerd op 10 onafhankelijke morfologische metrics. Drie clusters geïllustreerd in blauw, groen en rood. Alle delen van deze figuur zijn afgeleid van cijfers in Bragg et al. (in beoordeling).lank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Cluster Evaluation. Perceel van twee verschillende criterium waarden, negatief log waarschijnlijkheid (NLL, rood) en Akaike informatie criterium (AIC, blauw) gegenereerd op basis van drie GGM uitgaande van 1, 2 of 3 clusters. GGM's met 3 clusters bieden de laagste criterium waarden.

Aanvullende Code File: Voorbeeld code, geschreven in een Matlab-compatibele taal, om cluster analyses uit te voeren op een voorbeeld van de gegevens matrix gevolgd door cluster evaluatie met behulp van PCA en GMM benadert. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neuroanatomische studies zijn gebleven een van de pijlers van de neurowetenschappen en de recente interesse in connectomics en structuur-functie relaties heeft het enthousiasme verlengd voor gedetailleerde morfologische karakterisatie van selectieve neuronale populaties. Traditioneel zijn neuroanatomische studies vertrouwd op kwalitatieve indeling van neuronen in morfologisch verschillende klassen van neuronen die door deskundige neuroanatomists. Met de vooruitgang in de techniek voor het reconstrueren neuronen en extraheren van morfologische gegevens, is het mogelijk om meer geavanceerde en kwantitatieve data analysemethoden gebruiken om morfologisch verschillende neuronale klassen indelen onpartijdige wijze. In deze studie worden stap voor stap beschreven methoden voor 1) het selectief labelen honderden individuele neuronen met behulp van virus gemedieerde retrograde labeling methoden; 2) systematisch het reconstrueren van honderden individuele neuronen om een ​​uitgebreide en dus representatieve steekproef van neuronen in een te vormen selectieve bevolking; en 3) onafhankelijke clustering analyses statistische evaluatie om optimale clusters van neuronen te bepalen binnen een selectief populatie op basis van morfologische metrics. Deze analyse methoden worden gecontroleerd door het toepassen van verschillende clustering methoden om een ​​bestaande dataset van TRN neuronen en we zien op basis van drie verschillende evaluatiemethoden die TRN neuronen optimaal zijn geclusterd in drie morfologisch verschillende subpopulaties.

Een groot voordeel van de in deze studie protocollen is de flexibiliteit. De G-verwijderde rabiësvirus is effectief in het besturen van EGFP expressie in honderden retrograde gemerkte neuronen na injectie in een doelwit structuur geweest. Dezelfde rabies virus stam van effectiviteit van verschillende soorten, waaronder makaken 5, 9, fretten (Hasse & Briggs, bij revisie), en knaagdieren 7,"> 8. Dienovereenkomstig gemodificeerd rabies virus kan worden gebruikt om selectief labelen totale dendritische arborization patronen van elke populatie van neuronen na injectie in een doelstructuur. Antilichaam kleuring tegen GFP gevolgd door DAB / peroxide reactiemengsel wordt aanbevolen omdat dit veroorzaakt permanente kleuring van gelabelde neuronen en maakt weefselcoupes onder een microscoop worden gevisualiseerd zonder behulp van fluorescentiemicroscopie (die fluorescent label bleekmiddelen met langere blootstelling). echter, alternatieve kleuring methoden beschikbaar en / of fluorescentie kan direct worden gevisualiseerd indien gewenst. een voordeel van het meten rauwe fluorescentie is dat verschillende virussen die de expressie van verschillende fluorescerende moleculen kunnen worden gecombineerd, bijvoorbeeld om te bepalen of neuronen projecteren veelvoudige doelplaatsen hersenstructuren. Bovendien kunnen de bovenstaande stappen worden toegepast op alle beschikbare morfologische gegevens (zoals axonen en dendrieten) om steeds krachtiger morpho mogelijk te makenlogische indeling van neuronen. Het is ook belangrijk op te merken dat kleinere hoeveelheden van rabies virus ook kan worden geïnjecteerd om sparser retrograde labeling, die voordelig kunnen zijn voor reconstructies van axonen naast dendrieten genereren.

Een bijkomend voordeel van de analysemethoden die in deze studie is dat meerdere verschillende clusterbenaderingen kunnen worden gebruikt en vergeleken. Bij elke stap in de clusteranalyse verschillende opties beschikbaar tussen neuron-afstanden in parameterruimte evenals verschillende algoritmen berekenen clusters genereren. Bovendien, verschillende evaluatiemethoden beschikbaar. Dit laatste is vooral nuttig als middel om optimale clustering verifiëren, zoals uiteengezet in de sectie Representatieve resultaten. Ongetwijfeld, extra algoritmen voor het genereren van clusters en voor de evaluatie van optimale clustering zal beschikbaar komen als het veld naar voren beweegt. Samen zullen deze analysemethoden blijven Improve kwantitatieve aanpak op het gebied van neuro-anatomie en verbeteren van de robuustheid van de bevindingen.

Er is een groeiende belangstelling voor de automatisering van neuronale reconstructies, omdat door de hand reconstructies van individuele gelabelde neuronen zijn tijdrovend, vereisen opleiding en ervaring, en zijn nog steeds enigszins subjectief. Omdat computergebaseerde automatische neuronale reconstructies nog foutgevoelig worden elektronenmicroscopie gebaseerde neuroanatomical data nog geanalyseerd door mensen (zie bijvoorbeeld 17). Het is echter waarschijnlijk dat geautomatiseerde neuronale reconstructie beschikbaar zijn in de nabije toekomst. Geautomatiseerde neuronale reconstructie zal nog meer controle over de data-analyse eind vereisen, waardoor de clustering analyses en evaluatiemethoden hier geschetste zal nog belangrijker worden als het veld blijft technologisch vooruit te gaan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken Drs. Ed Callaway en Marty Usrey voor het mogelijk maken om het weefsel bereid als een onderdeel van een eerdere studie en Libby Fairless en Shiyuan Liu voor hulp bij neuronale reconstructies gebruiken. Dit werk werd gefinancierd door de NIH (NEI: EY018683) en de Whitehall Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SADΔG-EGFP E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten FHC UEPSGGSE1N2M Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II Drummod Scientific 3-000-204, 110V Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome Thermo Scientific
DAB Sigma Aldrich D5905-50TAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C Sigma Aldrich C2037-100MG
Catalase Sigma-Aldich C9322-5G
Rabbit anti-GFP Life Technologies/Thermo Fisher #A-11122  Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit Vector Laboratories #BA-1000 Secondary antibody
Neurolucida System  MicroBrightField Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer MicroBrightField Data export software
Microfire Camera  Optronics 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope Nikon Instruments Inc. Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab The MathWorks Inc.  Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel Microsoft Spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. Maloine. (1911).
  2. Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
  3. Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
  4. Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
  5. Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
  6. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
  7. Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525, (5), 1273-1290 (2017).
  8. Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
  9. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
  10. Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
  11. Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
  14. Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
  15. Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
  16. Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
  17. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics